Выемчатая сигнализация контролирует принятие сульфатных решений и формирование паттернов во время развития многоклеточных организмов. Мы разработали анализ поглощения антител для маркировки лиганда дельта-D и визуализации его эндоцитарного трафика в предшественниках радиальной глии в переднем мозге развивающихся рыб зебры. Скрытая инъекция желудочков головного мозга рыбок данио-рерио обеспечивает селективное поглощение анти-Dld-Atto-647N миотическими предшественниками радиальной глии, выстилающими желудочки головного мозга в процессе развития, с высокой эффективностью и длительным эффектом.
Этот протокол может быть легко комбинирован с другими фармакологическими или генетическими возмущениями, используемыми на разных стадиях развития и, возможно, адаптирован к взрослому мозгу, а также к 2D или 3D органоидам мозга, полученным из плюрипотентных стволовых клеток человека. После генерации оплодотворенных эмбрионов и инкубации в течение 18-20 часов извлеките их из инкубатора. Наблюдайте их под эпифлуоресцентным микроскопом, используя сначала белый свет с 20-кратным увеличением.
Откажитесь от мертвых эмбрионов, которые кажутся мутными или разорванными под микроскопом, с помощью стеклянной пипетки. Затем включите люминесцентную лампу и выберите настройку фильтра RFP микроскопа. Выберите эмбрионы с сильной красной флуоресценцией и перенесите их в новую посуду с яичной водой.
Теперь дехорионируйте эмбрионы вручную с помощью двух тонких щипцов под белым светом. Зажмите хорион одной парой щипцов и сделайте разрыв хориона другими щипцами. Осторожно откройте слезу с помощью щипцов и сделайте ее достаточно большой, чтобы эмбрион мог пройти, осторожно надавливая на эмбрион кончиками других щипцов.
Перенесите дехорионированные эмбрионы в новую чашку Петри со свежей эмбриональной средой для быстрого промывания перед микроинъекцией. Потянув тонкие инъекционные иглы на съемник, откройте кончик иглы щипцами под стереодиссекционным микроскопом. Диаметр наконечника составляет около 10 микрометров, а угол конусности - около 30 градусов.
Теперь смешайте 0,5 микролитра антитела против Dld с двумя микролитрами антитела против мыши L G Atto-647N путем пипетки от пяти до 10 раз, чтобы конъюгировать их, и инкубировать при комнатной температуре не менее 30 минут. В конце инкубации добавляют 2,5 микролитра блокирующего буфера и 0,5 микролитра 0,5%-ного фенольного красного в смесь антител и перемешивают пипеткой, чтобы блокировать любые неконъюгированные антитела, оставшиеся в смеси. Затем приготовьте 1%-ную агарозу с низкой температурой плавления в зародышевой среде.
Нагрейте смесь, содержащую агарозу, до 70 градусов Цельсия, пока смесь не станет прозрачной. После аликвотирования раствора агарозы держите их в тепловом блоке при температуре 40 градусов Цельсия. Промойте эмбрион в пробирке, содержащей 1% агарозы с низкой температурой плавления, в течение трех секунд.
Поместите эмбрион на перевернутую пластиковую крышку чашки Петри с отдельными агарозными каплями, чтобы смонтировать каждый эмбрион отдельно. Положите зародыши плашмя сбоку в агарозу и удерживайте это положение до тех пор, пока агароза не затвердеет при комнатной температуре. Покройте все смонтированные в агарозе зародыши яичной средой.
Поместите внедренные эмбрионы под стереомикроскоп и залейте агарозу яичной водой. Установите инжектор давления воздуха с микроманипуляторами, расположив их близко к микроскопам. В качестве воздушного ресурса используйте стальной газовый баллон, содержащий газообразный азот под высоким давлением.
После того, как эмбрионы были помещены в агарозу, откройте газовый вентиль. При использовании модуля переднего заполнения микроинжектора загрузите подготовленную стеклянную иглу двумя микролитрами смеси антител на микроманипулятор. Теперь настройте входное давление на 80–90 фунтов на квадратный дюйм, а давление впрыска — на 20 фунтов на квадратный дюйм.
Откалибруйте объем инъекции с помощью микрометра под микроскопом. Установите продолжительность настройки в зависимости от размера отверстия иглы от 10 до 120 миллисекунд. Коснитесь лопасти, чтобы подать каждый импульс инъекции, и настройте объем впрыска каждой подачи до четырех-пяти нанолитров.
Затем проткните кончик иглы для микроинъекций через дорсальную пластину крыши заднего мозга, позади точки шарнира рондимер ноль-один, и введите около 10 нанолитров смеси антител, не затрагивая ткани мозга. Наблюдалось течение красной жидкости в желудочке мозга. После инъекции быстро извлеките кончик иглы из эмбриона, вращая ручку микроманипулятора.
Для успешной инъекции красный краситель вводимой смеси стабильно остается в желудочке мозга, не просачиваясь в окружающую агарозу. Переместите монтажную пластину под микроскопом, чтобы найти другой смонтированный эмбрион в подходящем положении для повторов. После инъекции от шести до восьми эмбрионов очистите агарозу микрохирургическим ножом, чтобы освободить эмбрионы от встроенной агарозы.
Перенесите микроинъекционные эмбрионы в свежую посуду с 30 миллилитрами эмбриональной среды и поместите их при комнатной температуре для следующих шагов. Через 30 минут переведите отобранные эмбрионы в 10 миллилитров эмбриональной среды. Чтобы смонтировать эмбрионы, приготовьте 0,8% агарозу с низкой температурой плавления, содержащую такую же концентрацию трикана в пробирке.
С помощью стеклянной пипетки погрузите введенные эмбрионы в теплую агарозу на три секунды. Затем сразу же удалите зародыши из агарозы той же стеклянной пипеткой и поместите эмбрионы в центр 35-миллиметровой стеклянной нижней посуды для культуры с каплей агарозы из трубки. Осторожно ориентируйте эмбрионы с помощью волоконного зонда или загрузочного наконечника, чтобы дорсальная сторона эмбрионального мозга находилась как можно ближе к стеклянному дну.
Осторожно поверните положение эмбриона, чтобы удлинить эмбрион, не скручиваясь, по мере постепенного затвердевания агарозы. После этого проверьте положение эмбриона, перевернув тарелку со стеклянным дном. Убедитесь, что весь дорсальный передний мозг с правильно установленными эмбрионами можно увидеть под микроскопом.
Добавьте два-три миллилитра предварительно нагретой эмбриональной среды с температурой 28,5 градусов Цельсия, содержащей трикан, чтобы покрыть эмбрион. Правильно поместите чашку на столик конфокального микроскопа с контролируемой температурой и отрегулируйте температуру камеры визуализации до 28,5 градусов по Цельсию. Теперь эмбрион готов к визуализации.
У инъецированных эмбрионов Atto-647N наблюдалась фоновая флуоресценция в желудочке головного мозга. Эмбрионы рыбок данио, введенные против Dld-Atto-647N, показали большое количество интернализованных флуоресцентных частиц в большинстве клеток развивающегося переднего мозга. Покадровая визуализация показала движение внутриклеточных эндосом Anti-Dld-Atto-647N во время деления клеток.
Большинство митотических предшественников радиальной глии показали переднюю или заднюю асимметричную сегрегацию эндосом анти-Dld-Atto-647N на две дочерние клетки. Асимметрия стабилизировалась к концу анафазы, что привело к асимметричному наследованию сигнальных эндосом выемки дочерними клетками. Убедитесь, что игла была введена в скрытый желудочек марки в нужном месте, и проверьте, нет ли утечки после микроинъекции.
В дополнение к маркировке надрезной дельта-сигнализации, протокол применим для мечения других мембранных белков или внеклеточных белков с использованием аналогичных стратегий, если имеется хорошее антитело к внеклеточному домену.
