这项工作得到了荆州市科学技术局基金会（编号：2020HC06）的支持。

该研究完全符合TCGA（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）提供的出版指南。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅材料表 。
1. 数据来源和生物信息学分析
<ol><li>从癌症基因组图谱 （TCGA） 数据库 （https://cancergenome.nih.gov） 获取 RNA 测序数据以进行聚类分析。使用基于网络的 GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn/） 工具重新计算来自 TCGA 项目样本的原始 RNA-Seq 数据，以通过标准处理流程筛选候选癌症药物靶点。 注意：GEPIA网站对所有用户免费开放。</li>
	<li>访问GEPIA网站主页，点击“癌症类型分析”，选择“差异基因分析”选项，然后设置以下参数： 癌症名称 = CESE（定义为宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌），|Log2FC的|临界值 = 1，q 值临界值 = 0.01，差异方法 = 方差分析， 染色体分布 = 两者。然后，单击列表以获取显示肿瘤组和正常组之间差异表达的基因列表。 注意：它需要广泛的文献综述来鉴定差异表达的候选基因。在这项研究中，考虑到现有文献的背景，我们专注于感兴趣的肿瘤基因 FAM83A。</li>
	<li>然后，通过网站上的 Expression DIY 选项，使用 GEPIA 检查 FAM83A 在宫颈癌和正常组织中的表达，并选择 Boxplot 作为图表类型。在基因参数字段中输入FAM83A，并设置以下参数： |Log2FC的|截止值 = 1;q 值截止值 = 0.01。选择 CESE 作为癌症名称，将匹配正常数据字段选择匹配 TCGA 正常数据，将所有其他设置保留为默认值。单击“绘图”，允许网站生成表示FAM83A基因差异表达的箱线图;保存箱线图以备将来参考和分析。</li>
	<li>最后，分析宫颈癌中不同FAM83A表达水平的肿瘤患者的总生存期。导航到网站上的生存图选项，将基因设置为 FAM83A，然后选择总生存期作为分析类型。添加肿瘤名称 CESE，为轴单位选择月，并将所有其他参数保留为默认设置。点击绘图，让网站生成生存曲线图;保存此图表以备将来参考和分析。</li>
	<li>同时考虑 FAM83A 在肿瘤中的差异表达及其与患者生存分析的相关性，将 FAM83A 确定为宫颈癌的潜在治疗靶基因。</li>
</ol>2. 基于细胞的实验
<ol><li>细胞培养<ol><li>在37°C的改良培养基中，在湿润的5%CO2 气氛中培养人肿瘤细胞系。 注：有关细胞系信息和培养基成分，请参阅 材料表 。</li>
	</ol></li>
	<li>细胞转染<ol><li>使用 siRNA 敲低细胞中 FAM83A 的表达。 注：具体siRNA序列见 表1 。</li>
		<li>将细胞接种在 6 孔板中，并在达到 50%-70% 汇合度后，与 50 nM si-FAM83A 或 siRNA-NC 和 8 μL 转染试剂或仅 8 μL 转染试剂的混合物孵育 4-6 小时。在阴性对照中仅添加无血清 DMEM。</li>
		<li>孵育后，用DMEM+10%胎牛血清替换含有转染剂的培养基。此外，转染后 48 小时，按预期用 5 μM 顺铂 （DDP） 处理 24 小时，并收获所有细胞进行总 RNA 提取和 qRT-PCR 分析。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 用于细胞增殖测定的 EdU 检测
注意：根据制造商的说明，使用 EdU 细胞增殖试剂盒 在体外 评估细胞增殖。
<ol><li>将细胞接种在6孔板中，并用10μM EdU溶液孵育2小时。在室温（RT）下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，并在室温下用0.3%Triton X-100在PBS中透化10分钟。</li>
	<li>取出透化缓冲液并加入 500 μL 1x 反应溶液。然后，在室温下在黑暗中孵育30分钟进行核染色。</li>
	<li>用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞，并在荧光显微镜下以200倍放大倍率观察它们。用EdU染色增殖细胞的细胞核，并检查它们的红色荧光。</li>
	<li>最后，使用软件通过计数至少 10 个随机字段来量化结果，并使用荧光阳性细胞与总细胞的比率计算增殖率。</li>
</ol>4.伤口愈合试验
<ol><li>在 6 孔板中接种细胞，密度为每孔 2 × 105 个细胞。</li>
	<li>当细胞达到 90% 汇合度时，使用无菌的 10 μL 微量移液器吸头在细胞单层中轻轻形成线性划痕。用无菌 PBS 轻轻冲洗孔，以去除因刮擦引起的任何脱落的细胞和碎屑。</li>
	<li>此外，将细胞在含有1%FBS的培养基中孵育。然后，用倒置显微镜观察并拍摄图像，以便在12,24和48小时处愈合受伤区域。</li>
</ol>5. 多孔膜插入物测定
<ol><li>在所需细胞浓度（含有4×104 个细胞）的细胞培养基中制备细胞悬液，包括转染或对照 C33a 细胞和 HeLa。将细胞悬浮液添加到膜插入物的顶部腔室中，确保均匀分布。向下腔室中加入完全培养基。</li>
	<li>孵育24小时后，分别使用甲醇和0.1%结晶紫固定和染色迁移到下腔室的细胞。</li>
	<li>使用倒置显微镜拍摄图像，然后通过使用 ImageJ 计数至少 10 个随机场来分析迁移细胞的数量。<ol><li>对于使用 ImageJ 进行数字分析，请在 ImageJ 软件中打开图像，转到工具菜单中的 “图像 ”选项卡，选择 “调整”，然后单击 “阈值”。如有必要，调整阈值设置，直到在白色背景上仅显示单元格。</li>
		<li>单击“阈值”窗口中的“应用”，将这些设置应用于图像。现在，选择 魔杖 （描摹） 工具 从工具栏（位于窗口顶部）中。</li>
		<li>单击单元格所在的图像区域以选择阈值图像中的所有单元格。突出显示单元格后，转到“工具”菜单中的“分析”，然后单击“分析粒子”。在“分析粒子”窗口中，根据实验要求输入所需的大小（例如，0 - 无穷大）和圆度值（例如，0.00 - 1.00），以将所有细胞包含在计数中。</li>
		<li>单击 “确定 ”，然后等待软件对细胞进行计数，并等待显示分析结果的新窗口。</li>
	</ol></li>
</ol>6. 菌落形成试验
<ol><li>在6孔板中接种2×105 个Si-NC和Si-FAM83A 组的细胞，在6孔板中，有或没有5μM顺铂（DDP）处理24小时。</li>
	<li>经过24小时的药物处理后，使用0.25%胰蛋白酶分离细胞，并将其重悬于含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。将重悬细胞接种在密度为每孔1×103 个细胞的6孔板中，然后在37°C的温度下在5%CO2 培养箱中孵育。</li>
	<li>孵育~7-10天后，当菌落可见时，用4%聚甲醛固定细胞，并用Giemsa染色溶液染色20分钟。</li>
	<li>稍微洗净细胞，让板风干。通过显微镜拍摄菌落簇的图像，并计算包含超过 50 个细胞的菌落数量。</li>
</ol>7. 使用 JC-1 染料的线粒体膜去极化 （MMP） 分析
<ol><li>将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。</li>
	<li>根据制造商的说明，在37°C下，在5%CO2 下，使用线粒体膜电位测定试剂盒与1x JC-1染色溶液孵育15-20分钟。</li>
	<li>洗涤细胞并在荧光显微镜下以200倍放大倍率分别使用JC-1的激发波长和发射波长分别在~490nm和590nm处检查它们。要可视化 JC-1 荧光，请使用适当的滤光片，例如蓝色激发滤光片 （450-490 nm） 和红色发射滤光片（长通 > 590 nm）来选择性地捕获发射的荧光信号。</li>
</ol>8. mPTP的流式细胞分析
<ol><li>将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。</li>
	<li>从细胞中取出培养基，将细胞重悬于PBS中，并各加入300μL（1x体积）的钙黄绿素AM染色溶液和荧光猝灭工作溶液以均匀覆盖细胞。将细胞在37°C下在光保护环境中孵育30-45分钟，并在37°C下用新鲜的预热培养基替换培养基。 将细胞在37°C下在光保护环境中再孵育30分钟，以确保细胞内酯酶完全水解钙黄绿素AM，从而产生细胞内绿色荧光钙黄绿素。</li>
	<li>取出培养基，用PBS洗涤细胞2-3次，并加入检测缓冲液。使用流式细胞术和 488 nm 的激发波长检测细胞 mPTP。</li>
</ol>9. 流式细胞术
<ol><li>将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。</li>
	<li>药物处理 24 小时后，将细胞重悬于 200 μL 结合缓冲溶液中，并将 10 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 5 μL 碘化丙啶 （PI） 轻轻混合到细胞悬液中。将混合物孵育 15 分钟，同时避免避光，并向细胞中加入 300 μL 结合缓冲溶液。使用激发波长为488nm的流式细胞术检测细胞凋亡。</li>
</ol>10. RT-PCR分析
<ol><li>将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。</li>
	<li>使用RNA提取试剂从肿瘤细胞中提取总RNA，并通过在42°C下孵育45分钟，然后在95°C下孵育5分钟，将提取的RNA转化为cDNA合成混合物中的互补DNA（cDNA）。</li>
	<li>制备含有DNA聚合酶，核苷酸，缓冲液和设计的基因特异性引物的PCR反应混合物。将cDNA模板添加到反应混合物中进行实时荧光定量PCR反应，并在实时荧光定量PCR仪器上使用以下热循环条件进行PCR：在95°C下变性30秒，然后在95°C下变性5秒，在60°C下变性30秒，在95°C下熔解曲线阶段15秒， 60°C1分钟，95°C15秒。使用 GAPDH 作为内部对照，使用 2−ΔΔCq 方法定量 mRNA 水平。 注：RT-PCR反应系统如 表1所示，引物序列如 表1所示。<ol><li>要计算 2−ΔΔCq 值，请测量样品中靶基因和参考基因 （GAPDH） 的 Cq 值。通过从每个样品的目标基因的 Cq 值中减去参考基因的 Cq 值来计算 ΔCq。通过从每个实验样品的 ΔCq 中减去对照样品的 ΔCq 来计算 ΔΔCq。最后，通过将 2 提高到 ΔΔCq 值的幂来计算 2−ΔΔCq 值。 注意： Cq 值表示荧光信号达到设定阈值的循环数。</li>
	</ol></li>
</ol>11. 蛋白质印迹分析
<ol><li>将来自Si-NC和Si-FAM83A组的1.2×10 6个肿瘤细胞接种到六孔板中并培养24小时，有或没有5μM顺铂（DDP）处理。</li>
	<li>收集培养的细胞并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤，以除去任何残留的生长培养基或血清。使用含有苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞以释放细胞蛋白。将细胞在冰上孵育几分钟以确保完全裂解，并在4°C，12,000× g 下离心15分钟。收集上清液以确定其蛋白质浓度。</li>
	<li>根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。将细胞裂解物与上样缓冲液混合，并在95-100°C下加热混合物5-10分钟，使蛋白质变性并确保凝胶上的均匀分离。</li>
	<li>从每个样品中，将30μg总蛋白加载到SDS-PAGE凝胶上，并在80V的恒定电压下运行SDS-PAGE。</li>
	<li>使用湿式转移系统将凝胶中分离的蛋白质转移到聚氟乙烯膜上，在冰浴上以200mA的电流转移1.5小时。</li>
	<li>在室温下用Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶封闭膜，在室温下1小时，并在4°C下用 材料表中给出的相应抗体孵育过夜。</li>
	<li>用TBST多次洗涤膜，并在室温下与二抗（材料表）孵育1小时，然后用TBST洗涤。使用增强型化学发光检测试剂盒和成像仪系统可视化蛋白质条带。</li>
</ol>12. 统计分析
<ol><li>由于所有实验数据点都是独立的，因此将数据表示为标准差±均值。</li>
	<li>使用单因素方差分析 （ANOVA） 进行多重比较，并使用 Dunnett 检验将每组与对照组进行比较。使用学生 t 检验（未配对双尾）比较两组;认为 P < 0.05 是显著的。</li>
</ol>

FAM83A 作为宫颈癌靶基因的验证

<ol>
	<li>Arbyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+incidence+and+mortality+of+cervical+cancer+in+2018:+a+worldwide+analysis.">Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis.</a> Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).</li><li>Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+cancer.">Cervical cancer.</a> Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).</li><li>Cipriano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+oncogenic+behavior+of+the+fam83+family+regulates+mapk+signaling+in+human+cancer.">Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer.</a> Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).</li><li>Snijders, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAM83+family+oncogenes+are+broadly+involved+in+human+cancers:+an+integrative+multi-omics+approach.">FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach.</a> Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).</li><li>Gan, J., Meng, Q., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+systematic+analysis+of+expression+profiles+and+prognostic+significance+for+fam83+family+in+non-small-cell+lung+cancer.">Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer.</a> Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).</li><li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+expression,+prognostic+significance,+and+function+of+fam83+family+members+in+breast+cancer.">Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer.</a> World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prognostic+biomarkers+among+fam83+family+genes+in+human+ovarian+cancer+through+bioinformatic+analysis+and+experimental+verification.">Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification.</a> Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prognostic+and+therapeutic+biomarkers+among+fam83+family+members+for+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+cervical+RNA-binding+proteins+identifies+human+papillomavirus+regulation+of+rnaseh2a+expression+by+viral+e7+and+e2f1.">Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1.</a> mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal Of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).</li><li>Bonora, M., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+cancer:+molecular+mechanisms+involved+in+cell+death.">The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death.</a> Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).</li><li>Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALAT1+promotes+cisplatin+resistance+in+cervical+cancer+by+activating+the+pi3k/akt+pathway.">MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).</li><li>Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatidylinositol+3-kinase+(pi3k)-akt+pathway+suppresses+bax+translocation+to+mitochondria.">The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria.</a> Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cancer+chemoresistance.">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).</li><li>Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mitochondria+in+cancer:+current+concepts+and+immunotherapy+approaches.">Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches.</a> Translational Research. 202, 35-51 (2018).</li></ol>

作者报告说，这项工作没有利益冲突。

肿瘤靶基因的研究对于宫颈癌的防治都具有重要意义。了解在宫颈癌发展和进展中起重要作用的特定基因为了解该疾病的潜在分子机制提供了宝贵的见解。此外，识别这些靶基因可以导致新的治疗策略和靶向疗法的开发。在这项研究中，我们描述了使用TCGA数据集分析来鉴定 FAM83A 作为靶基因并研究其在宫颈癌中的机制作用。我们观察到宫颈癌细胞中 FAM83A 的表达显着高，这与宫颈癌?...

宫颈癌是全球主要的妇科恶性肿瘤类型之一，也是女性癌症相关死亡的主要原因，因此是一个全球关注的问题1。根治性手术和放化疗与初级阶段的高治愈率有关。然而，对于发生转移性疾病的宫颈癌晚期患者，治疗结果非常不利2。因此，进一步了解宫颈癌细胞迁移和侵袭的生物学机制，确定预防和治疗该疾病的潜在治疗靶点至关重要。
识别参与癌症进展的靶基因并找到抑制其表达或作用的方法提供了有希望的治疗选择。在这项研究中，我们将FAM83鉴定为致癌基因，并进一步研究了其对C33a和HeLa细胞的抑制作用。FAM83 家族癌基因 （FAM83A-H） 在人类癌症中被广泛报道 3,4。最近有报道称，FAM83A在肺5癌、乳腺癌6癌、卵巢癌7癌和胰腺癌8中上调，表明FAM83A通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、干细胞样性状和耐药性在癌症进展中发挥重要作用。重要的是，FAM83A 被鉴定为与宫颈病变进展和癌变相关的新型候选基因之一 9。尽管证实了FAM83A在人宫颈癌细胞中的表达升高，但FAM83A在宫颈癌中的具体影响和潜在机制仍不清楚。
在这项研究中，我们概述了鉴定FAM83A作为宫颈癌肿瘤靶基因所涉及的方案，并使用小干扰RNA（siRNA）敲低HeLa和C33a细胞中的FAM83A基因。进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖的影响，而伤口愈合和多孔膜插入试验有助于评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。
进行蛋白质印迹以确定细胞凋亡相关蛋白的水平，并采用 JC-1 染色评估线粒体功能改变。因此，我们报道 了FAM83A 在宫颈癌的细胞增殖、转移和侵袭中起着关键作用。通过PI3K/AKT通路相关的线粒体功能障碍和细胞凋亡， FAM83A 敲低宫颈癌细胞对顺铂（二胺二氯铂，DDP）敏感。这项研究为宫颈癌和可能的其他癌症提供了一个新的靶点，并为开发克服癌细胞对某些化疗药物耐药性的策略提供了参考。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >Cells and Medium Formulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C33a</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hela</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modified medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody Information</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AKT</td>
			<td >4691, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
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			<td >26593-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caspase 3</td>
			<td >19677-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cleaved-caspase3</td>
			<td >abs132005; Absin Bioscience Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytc</td>
			<td >10993-1-AP; Proteintech Group</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GAPDH&#160;</td>
			<td >10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:8,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTOR</td>
			<td >2983, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI3K</td>
			<td >4292, Cell Signaling Technology Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-AKT&#160;</td>
			<td >4060, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-mTOR (Ser2448)</td>
			<td >#5536, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-PI3K p85 subunit</td>
			<td >17366, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibodies</td>
			<td >GB23303, Servicebio</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plate</td>
			<td >Corning, NPY</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555</td>
			<td >Beyotime</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >P0011</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChemiDoc XRS Imager System&#160;</td>
			<td >BioRad</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enhanced chemiluminescence detection kit&#160;</td>
			<td >Servicebio, Inc.,China</td>
			<td ></td>
			<td >cat. no. G2014</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td >Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix&#160;</td>
			<td rowspan="2" >11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted microscope&#160;</td>
			<td >Olympus, Tokyo, Japan;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millicell transwell inserts&#160;</td>
			<td >Millipore,Bedford, MA, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mitochondrial membrane potential assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF&#160;</td>
			<td >ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td >#ST506</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Real-time quantitative PCR instrument&#160;</td>
			<td rowspan="2" >Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPA Lysis Buffer&#160;</td>
			<td >Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td >15596026</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent&#160;</td>
			<td >Takara Bio Inc., Otsu, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Image-Pro</td>
			<td >&#160;plus 6.0&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

knockdown of fam83a to verify its role in cervical cancer cell growth and cisplatin sensitivity

肿瘤靶基因的探索对于宫颈癌的防治具有重要意义。在这项研究中，我们概述了在宫颈癌中鉴定肿瘤靶基因FAM83A所涉及的步骤。首先，利用癌症基因组图谱数据集验证FAM83A在女性中的表达和预后意义。使用小干扰 RNA （siRNA） 敲低 HeLa 和 C33a 细胞中的 FAM83A 基因。接下来，进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色以确定对肿瘤细胞增殖能力的影响。进行伤口愈合和多孔膜插入试验以评估肿瘤细胞迁移和侵袭能力。
Western blotting用于量化细胞凋亡相关蛋白水平。采用JC-1染色评估线粒体功能改变。此外，顺铂（二胺二氯铂，DDP）干预用于评估靶基因的治疗潜力。进行流式细胞术和集落形成试验以进一步验证该基因的抗癌特性。结果显示， FAM83A 敲低可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并使这些细胞对顺铂敏感。这些综合方法共同验证 了FAM83A 作为肿瘤相关靶基因，有望成为预防和治疗宫颈癌的潜在治疗靶点。

Cervical cancer is a global concern as it is one of the leading types of gynecological malignancy worldwide and is the major cause of cancer-related mortality in women1. Radical surgery and chemoradiotherapy are associated with high cure rates at the primary stage. However, treatment outcomes for patients at the advanced stage of cervical cancer who develop metastatic disease are very unfavorable2. Therefore, it is crucial to further understand the biological mechanisms underlying the migration and invasion of cervical cancer cells and identify potential therapeutic targets for the prevention and treatment of this disease.
Identifying target genes involved in cancer progression and finding ways to inhibit their expression or action present promising treatment options. In this study, we identified FAM83 as a cancer-causing gene and further investigated its inhibitory effects on C33a and HeLa cells. FAM83 family oncogenes (FAM83A-H) are widely reported in human cancers3,4. Recently, FAM83A was reported to be upregulated in lung5, breast6, ovarian7, and pancreatic8 cancers,indicating that FAM83A plays an important role in cancer progression via promoting the proliferation, invasion, stem-cell-like traits, and drug resistance in the tumor cells. Importantly, FAM83A was identified as one of the novel candidate genes associated with cervical lesion progression and carcinogenesis9. Despite the confirmation of elevated FAM83A expression in human cervical cancer cells, the specific impact and underlying mechanisms of FAM83A in cervical cancer remain unclear.
In this study, we outline the protocols involved in the identification of FAM83A as a tumor target gene in cervical cancer and use a small interfering RNA (siRNA) for the knockdown of the FAM83A gene in HeLa and C33a cells. 5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) staining was performed to determine the effects on tumor cell proliferation, while wound healing and porous membrane insert assays helped evaluate tumor cell migration and invasion abilities.
Western blotting was performed to determine the levels of apoptosis-related proteins, and JC-1 staining was employed to evaluate mitochondrial function alterations. Thus, we reported that FAM83A plays a critical role in cell proliferation, metastasis, and invasion in cervical cancer. Through PI3K/AKT-pathway-associated mitochondrial dysfunction and apoptosis, FAM83A knockdown sensitized cervical cancer cells to cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP). This study provides a new target for cervical cancer and possibly other cancers and a reference for the development of strategies to overcome the resistance of cancer cells to certain chemotherapeutic drugs.

作者聚焦：探索 FAM83A 在宫颈癌中的作用 

敲低 FAM83A 以验证其在宫颈癌细胞生长和顺铂敏感性中的作用

The scope of our research as focus are investigating the role of FAM83A in cervical cancer growths and cisplatin sensitivity. By addressing this question, we hope to contribute to the scientific understanding of the cervical cancer biology and potentially identify real therapeutic targets for this disease. We found LA sentencing FAM83A expirations as a scientist, cervical cancer cells uses platin treatment.Enhancing the drug satisfies a factor, and inhibiting the cell viability and migration. Our laboratory will focus and foreign research question in the future illustrating the medical mechanisms of FAM83A of FAM83A in cervical cancer. FAM83A in cervical cancer.Developing FAM83A inhibitors or technicalities. Developing FAM83A inhibitors or technicalities. The therapies starting the correlation between FAM83A and the patient prognosis between FAM83A and the patient prognosis and investigating the role of FAM83A in and investigating the role of FAM83A and investigating the orle of FAM83A in other types of cancer.

TCGA数据库分析和PCR验证
根据TCGA数据库分析，我们对306个宫颈癌细胞样本和13个正常细胞样本中的mRNA表达水平进行了比较分析，以研究FAM83A的差异表达。FAM83A在宫颈癌中上调，而其在正常宫颈组织中的表达可以忽略不计（图1A）。为了进一步了解 FAM83A 表达的预后意义，我...

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在这里，我们展示了 FAM83A 敲除的程序;检测其对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的测定;以及这些细胞对顺铂的致敏性。该研究为宫颈癌提供了一个有前途的靶基因，并为进一步的药物研究提供了参考。

The exploration of tumor target genes holds paramount importance for the prevention and treatment of cervical cancer. In this study, we outline the steps ...

我们的研究范围是研究FAM83A在宫颈癌生长和顺铂敏感性中的作用。通过解决这个问题，我们希望有助于对宫颈癌生物学的科学理解，并有可能确定这种疾病的真正治疗靶点。我们发现洛杉矶判刑FAM83A过期作为科学家，宫颈癌细胞使用铂治疗。增强药物满足一个因素，并抑制细胞活力和迁移。今后，本实验室将重点研究FAM83A和FAM83A在宫颈癌中的医学机制。FAM83A在宫颈癌中的应用。开发FAM83A抑制剂或技术。开发FAM83A抑制剂或技术。这些疗法开始FAM83A与患者预后之间的相关性，FAM83A与患者预后之间的相关性，并研究FAM83A在FAM83A中的作用，并研究FAM83A在其他类型癌症中的作用。

knockdown-fam83a-to-verify-its-role-cervical-cancer-cell-growth

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity

511 次观看.  Yangtze University. 我们的研究范围是研究FAM83A在宫颈癌生长和顺铂敏感性中的作用。通过解决这个问题，我们希望有助于对宫颈癌生物学的科学理解，并有可能确定这种疾病的真正治疗靶点。我们发现洛杉矶判刑FAM83A过期作为科学家，宫颈癌细胞使用铂治疗。增强药物满足一个因素，并抑制细胞活力和迁移。今后，本实验室将重点研究FAM83A和FAM83A在宫颈癌中的医学机制。FAM83A在宫颈癌中?...