Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Departamento de Ciência e Tecnologia de Jingzhou (nº 2020HC06).

O estudo estava completamente de acordo com as diretrizes de publicação fornecidas pelo TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Fonte de dados e análise bioinformática
<ol><li>Obter dados de sequenciamento de RNA do banco de dados (https://cancergenome.nih.gov) do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para análise de agrupamento. Use o GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uma ferramenta baseada na web para recalcular dados brutos de RNA-Seq de amostras de projetos TCGA, para rastrear alvos de drogas candidatas ao câncer com um pipeline de processamento padrão. NOTA: O site do GEPIA está disponível gratuitamente para todos os usuários.</li>
	<li>Acesse a página inicial do site do GEPIA e clique em Análise de Tipo de Câncer, selecione a opção Análise Diferencial de genes e defina os seguintes parâmetros: Nome do câncer = CESE (definido como carcinoma de células escamosas do colo do útero e adenocarcinoma endocervical nesta página), |Log2FC| Ponto de corte = 1, valor de q Cutoff = 0,01, Métodos Diferenciais = ANOVA e Distribuição Cromossômica = ambos. Em seguida, clique em Lista para obter uma lista de genes que mostre expressão diferencial entre grupos tumorais e normais. NOTA: Requer uma extensa revisão da literatura para identificar genes candidatos diferencialmente expressos. Neste estudo, considerando o histórico da literatura disponível, enfocamos o gene tumoral de interesse, FAM83A.</li>
	<li>Em seguida, examine a expressão de FAM83A no câncer cervical e tecidos normais usando GEPIA prosseguindo para a opção Expressão DIY no site e selecione Boxplot como o tipo de gráfico. Insira FAM83A no campo de parâmetro do gene e defina os seguintes parâmetros: |Log2FC| Valor de corte = 1; valor de q Ponto de corte = 0,01. Selecione CESE como o nome do câncer e Corresponder dados normais do TCGA para o campo de dados Normal Correspondente , deixando todas as outras configurações como padrão. Clique em Plotar e permitir que o site gere um boxplot representando a expressão diferencial do gene FAM83A ; Salve o boxplot para referência e análise futuras.</li>
	<li>Finalmente, analisar a sobrevida global de pacientes portadoras de tumores com diferentes níveis de expressão de FAM83A no câncer cervical. Navegue até a opção Gráficos de sobrevivência no site, defina o Gene como FAM83A e selecione Sobrevivência global como o tipo de análise. Adicione o nome do tumor CESE, escolha Meses para as Unidades do Eixo e deixe todos os outros parâmetros em suas configurações padrão. Clique em Plotar e deixe o site gerar um gráfico de curva de sobrevivência; Salve este gráfico para referência e análise futuras.</li>
	<li>Levar em consideração tanto a expressão diferencial de FAM83A em tumores quanto sua correlação com a análise de sobrevida de pacientes para identificar FAM83A como um potencial gene alvo terapêutico no câncer cervical.</li>
</ol>2. Experimentos baseados em células
<ol><li>Cultura celular<ol><li>Cultura de linhagens tumorais humanas em meio modificado a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 . NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter informações sobre a linha celular e os componentes do meio de cultura.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfecção celular<ol><li>Use siRNA para derrubar a expressão de FAM83A nas células. NOTA: Consulte a Tabela 1 para a sequência específica de siRNA.</li>
		<li>Células de sementes em placas de 6 poços e incubar com a mistura de 50 nM si-FAM83A ou siRNA-NC e 8 μL de agente de transfecção ou apenas 8 μL de agente de transfecção por 4-6 h após atingir 50%-70% de confluência. Adicionar apenas DMEM sem soro ao controle negativo.</li>
		<li>Após a incubação, substituir o meio contendo o agente transfeccionista por DMEM + 10% de soro fetal bovino. Além disso, 48 h após a transfecção, tratar com cisplatina 5 μM (DDP) por 24 h como pretendido e colher todas as células para extração de RNA total e análise de qRT-PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Detecção de EdU para ensaio de proliferação celular
NOTA: Use o Kit de Proliferação Celular EdU para avaliar a proliferação celular in vitro de acordo com as instruções do fabricante.
<ol><li>Semeando as células em placas de 6 poços e incubando-as com solução de EdU 10 μM por 2 h. Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR) e permeabilizar com Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min em TR.</li>
	<li>Remova o tampão de permeabilização e adicione 500 μL de solução de reação 1x. Em seguida, incubar por 30 min no RT no escuro para coloração nuclear.</li>
	<li>Corar células com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e visualizá-las em microscópio de fluorescência com aumento de 200x. Manchar os núcleos das células em proliferação com EdU e examiná-los para fluorescência vermelha.</li>
	<li>Finalmente, utilizar um software para quantificar os resultados contando pelo menos 10 campos aleatórios e calcular as taxas de proliferação usando a razão entre as células fluorescentes-positivas e o total de células.</li>
</ol>4. Ensaio de cicatrização de feridas
<ol><li>Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 105 células por poço.</li>
	<li>Quando as células atingirem 90% de confluência, use uma ponta de micropipeta estéril de 10 μL para criar suavemente um risco linear na monocamada celular. Enxágue suavemente os poços com PBS estéril para remover quaisquer células destacadas e detritos causados por arranhões.</li>
	<li>Além disso, incubar as células em meio contendo 1% de SFB. Em seguida, observar e tirar imagens com o microscópio invertido para a cicatrização da região ferida em 12, 24 e 48 h.</li>
</ol>5. Ensaio de inserção de membrana porosa
<ol><li>Preparar uma suspensão celular em meio de cultura celular na concentração celular desejada (contendo 4 × 104 células), incluindo células C33a transfectadas ou controle e HeLa. Adicione a suspensão celular à câmara superior das inserções de membrana, garantindo uma distribuição uniforme. Adicione o meio completo à câmara inferior.</li>
	<li>Após incubação por 24 h, utilizar álcool metílico e violeta de cristal 0,1% para fixação e coloração das células migratórias para as câmaras inferiores, respectivamente.</li>
	<li>Use um microscópio invertido para tirar imagens e, em seguida, analisar o número de células migratórias contando pelo menos 10 campos aleatórios com ImageJ.<ol><li>Para a análise numérica com o ImageJ, abra a imagem no software ImageJ, vá para a guia Imagem no menu da ferramenta, selecione Ajustar e clique em Limite. Ajuste as configurações de limite, se necessário, até que apenas as células fiquem visíveis em um plano de fundo branco.</li>
		<li>Clique em Aplicar na janela Limite para aplicar essas configurações à imagem. Agora, selecione a ferramenta Varinha (rastreamento) na barra de ferramentas (localizada na parte superior da janela).</li>
		<li>Clique na área da imagem onde as células estão localizadas para selecionar todas as células na imagem limitada. Depois que as células estiverem realçadas, vá para Analisar no menu Ferramenta e, em seguida, clique em Analisar partículas. Na janela Analisar partículas, insira o tamanho desejado (por exemplo, 0 - infinito) e os valores de circularidade (por exemplo, 0,00 - 1,00) de acordo com os requisitos experimentais para incluir todas as células na contagem.</li>
		<li>Clique em OK e aguarde até que o software conte as células e que uma nova janela apareça com os resultados da análise.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Ensaio de formação de colônias
<ol><li>A semente 2 × 105 células por poço dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em uma placa de 6 poços com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM por 24 h.</li>
	<li>Após um período de 24 horas de tratamento medicamentoso, separar as células usando tripsina a 0,25% e ressuspendê-las em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de SFB. Semeando as células ressuspensas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 103 células por poço e, em seguida, incubar em uma incubadora de 5% de CO2 a uma temperatura de 37 °C.</li>
	<li>Após a incubação por ~7-10 dias quando as colônias estiverem visíveis, fixar as células com Polioximetileno a 4% e corá-las com solução corante de Giemsa por 20 min.</li>
	<li>Lave levemente as células e deixe as placas secarem ao ar. Tire imagens dos aglomerados de colônias ao microscópio e conte o número de colônias que contêm mais de 50 células.</li>
</ol>7. Análise da despolarização da membrana mitocondrial (MMP) utilizando o corante JC-1
<ol><li>Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.</li>
	<li>Incubar com 1x solução corante JC-1 durante 15-20 minutos a 5% de CO2 a 37 °C utilizando um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Lave as células e examine-as em microscópio fluorescente com aumento de 200x usando comprimentos de onda de excitação e emissão para JC-1 a ~490 nm e 590 nm, respectivamente. Para visualizar a fluorescência JC-1, use filtros apropriados, como um filtro de excitação azul (450-490 nm) e um filtro de emissão vermelho (passa-longa > 590 nm) para capturar seletivamente o sinal de fluorescência emitido.</li>
</ol>8. Análise por citometria de fluxo do PTPm
<ol><li>Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.</li>
	<li>Remova o meio de cultura das células, ressuspenda as células em PBS e adicione 300 μL cada (1x volume) de solução corante Calcein AM e solução de trabalho de resfriamento de fluorescência para cobrir as células uniformemente. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido à luz por 30-45 min e substituir o meio por meio de cultura fresco pré-aquecido a 37 °C. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido contra a luz por mais 30 min para garantir a hidrólise completa da Calceína AM por esterases intracelulares, resultando na geração de Calceína verde-fluorescente intracelular.</li>
	<li>Retire o meio de cultura, lave as células 2-3x com PBS e adicione o tampão de detecção. Detectar mPTP celular usando citometria de fluxo e um comprimento de onda de excitação de 488 nm.</li>
</ol>9. Citometria de fluxo
<ol><li>Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.</li>
	<li>Após 24 h de tratamento medicamentoso, ressuspenda as células em 200 μL de solução tampão de ligação e misture suavemente 10 μL de Anexina V-FITC e 5 μL de iodeto de propídio (PI) na suspensão celular. Incubar a mistura durante 15 minutos, evitando a luz, e adicionar 300 μL de solução tampão de ligação às células. Detectar apoptose celular usando citometria de fluxo em um comprimento de onda de excitação de 488 nm.</li>
</ol>10. Análise RT-PCR
<ol><li>Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.</li>
	<li>Extrair o RNA total das células tumorais usando o reagente de extração de RNA e converter o RNA extraído em DNA complementar (cDNA) com o cDNA Synthesis Mix, incubando a 42 °C por 45 min e depois a 95 °C por 5 min.</li>
	<li>Preparar a mistura de reação de PCR contendo DNA polimerase, nucleotídeos, tampão e os primers gene-específicos projetados. Adicionar o molde de cDNA à mistura de reação para a reação de PCR em tempo real e realizar a PCR no instrumento de PCR quantitativo em tempo real com as seguintes condições de termociclagem: desnaturação a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C para 5 s e 60 °C para 30 s, e o estágio da curva de fusão a 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s. Quantificar os níveis de RNAm usando o método 2−ΔΔCq usando GAPDH como controle interno. OBS: O sistema de reação RT-PCR é mostrado na Tabela 1, e as sequências de primers são mostradas na Tabela 1.<ol><li>Para calcular o valor de 2−ΔΔCq , meça os valores de Cq para o gene alvo e o gene de referência (GAPDH) nas amostras. Calcular o ΔCq subtraindo o valor de Cq do gene de referência do valor de Cq do gene alvo para cada amostra. Calcular o ΔΔCq subtraindo o ΔCq de uma amostra controle do ΔCq de cada amostra experimental. Finalmente, calcule o valor de 2−ΔΔCq elevando 2 para a potência do valor de ΔΔCq. Observação : O valor Cq representa o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência atinge o limite definido.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Análise de Western blot
<ol><li>Sementes 1,2 ×10 6 células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.</li>
	<li>Coletar as células cultivadas e lavá-las com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) para remover qualquer meio de crescimento residual ou soro. Lisar as células usando RIPA Lysis Buffer contendo fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) para liberar as proteínas celulares. Incubar as células no gelo por alguns minutos para garantir a lise completa e centrifugar a 4 °C, 12.000 × g por 15 min. Coletar o sobrenadante para determinar sua concentração de proteínas.</li>
	<li>Determine a concentração de proteína no lisado celular usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. Misture o lisado celular com um tampão de carga e aqueça a mistura a 95-100 °C por 5-10 min para desnaturar as proteínas e garantir uma separação uniforme no gel.</li>
	<li>De cada amostra, carregar 30 μg de proteína total em um gel SDS-PAGE e executar o SDS-PAGE sob uma tensão constante de 80 V. Pare a eletroforese quando o azul de bromofenol atingir o fundo do gel de separação.</li>
	<li>Transfira as proteínas separadas do gel para uma membrana de polivinildifluoreto usando um sistema de transferência úmido em um banho de gelo com uma corrente de 200 mA por 1,5 h.</li>
	<li>Bloquear a membrana com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tween-20 a 0,05% (TBST) por 1 h no TR e incubar durante a noite a 4 °C com os respectivos anticorpos administrados na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Lavar a membrana várias vezes com TBST e incubar com os anticorpos secundários (Tabela de Materiais) por 1 h no TR, seguido de lavagem com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando um kit de detecção de quimioluminescência aprimorado e um sistema de imagem.</li>
</ol>12. Análise estatística
<ol><li>Como todos os pontos de dados experimentais serão independentes, apresente os dados como média ± DP.</li>
	<li>Utilizar análise de variância (ANOVA) one-way para comparações múltiplas e teste de Dunnett para comparar cada grupo com o grupo controle. Utilizar o teste t de Student (bicaudal não pareado) para comparar dois grupos; consideram P < 0,05 significativo.</li>
</ol>

Validação de FAM83A como um gene alvo no câncer do colo do útero

<ol>
	<li>Arbyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+incidence+and+mortality+of+cervical+cancer+in+2018:+a+worldwide+analysis.">Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis.</a> Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).</li><li>Cohen, P. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal Of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).</li><li>Bonora, M., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+cancer:+molecular+mechanisms+involved+in+cell+death.">The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death.</a> Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).</li><li>Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALAT1+promotes+cisplatin+resistance+in+cervical+cancer+by+activating+the+pi3k/akt+pathway.">MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).</li><li>Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatidylinositol+3-kinase+(pi3k)-akt+pathway+suppresses+bax+translocation+to+mitochondria.">The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria.</a> Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. 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Os autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.

A investigação de genes-alvo tumorais é de extrema importância tanto para a prevenção quanto para o tratamento do câncer cervical. A compreensão dos genes específicos que desempenham um papel significativo no desenvolvimento e progressão do câncer cervical fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes da doença. Além disso, a identificação desses genes-alvo pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e terapias-alvo. Neste estudo, descrevemos o uso da aná...

O câncer do colo do útero é uma preocupação mundial, pois é um dos principais tipos de neoplasia ginecológica no mundo e é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer emmulheres1. A cirurgia radical e a quimiorradioterapia estão associadas a altas taxas de cura no estágio primário. No entanto, os resultados do tratamento para pacientes em estágio avançado de câncer de colo uterino que desenvolvem doença metastática são muito desfavoráveis2. Portanto, é crucial compreender melhor os mecanismos biológicos subjacentes à migração e invasão de células cancerosas do colo do útero e identificar potenciais alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento desta doença.
Identificar genes-alvo envolvidos na progressão do câncer e encontrar maneiras de inibir sua expressão ou ação apresentam opções promissoras de tratamento. Neste estudo, identificamos FAM83 como um gene causador de câncer e investigamos seus efeitos inibitórios em células C33a e HeLa. Os oncogenes da família FAM83 (FAM83A-H) são amplamente relatados em cânceres humanos 3,4. Recentemente, foi relatado que o FAM83A é upregulated em cânceres de pulmão5, mama6, ovário7 e pâncreas8, indicando que o FAM83A desempenha um papel importante na progressão do câncer por meio da promoção da proliferação, invasão, características semelhantes a células-tronco e resistência a drogas nas células tumorais. É importante ressaltar que o FAM83A foi identificado como um dos novos genes candidatos associados à progressão da lesão cervical e carcinogênese9. Apesar da confirmação da expressão elevada de FAM83A em células humanas de câncer cervical, o impacto específico e os mecanismos subjacentes de FAM83A no câncer cervical permanecem obscuros.
Neste estudo, delineamos os protocolos envolvidos na identificação de FAM83A como um gene alvo tumoral em câncer cervical e usamos um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . A coloração com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi realizada para determinar os efeitos sobre a proliferação de células tumorais, enquanto os ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa ajudaram a avaliar a migração e a capacidade de invasão de células tumorais.
Western blotting foi realizado para determinar os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, e a coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Assim, relatamos que o FAM83A desempenha um papel crítico na proliferação celular, metástase e invasão no câncer cervical. Através da disfunção mitocondrial e apoptose associadas à via PI3K/AKT, o knockdown FAM83A sensibilizou células de câncer cervical à cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP). Este estudo fornece um novo alvo para o câncer do colo do útero e possivelmente outros cânceres e uma referência para o desenvolvimento de estratégias para superar a resistência das células cancerosas a certas drogas quimioterápicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >Cells and Medium Formulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C33a</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hela</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modified medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody Information</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AKT</td>
			<td >4691, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bcl2&#160;</td>
			<td >26593-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caspase 3</td>
			<td >19677-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cleaved-caspase3</td>
			<td >abs132005; Absin Bioscience Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytc</td>
			<td >10993-1-AP; Proteintech Group</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GAPDH&#160;</td>
			<td >10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:8,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTOR</td>
			<td >2983, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI3K</td>
			<td >4292, Cell Signaling Technology Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-AKT&#160;</td>
			<td >4060, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-mTOR (Ser2448)</td>
			<td >#5536, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-PI3K p85 subunit</td>
			<td >17366, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibodies</td>
			<td >GB23303, Servicebio</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plate</td>
			<td >Corning, NPY</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555</td>
			<td >Beyotime</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >P0011</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChemiDoc XRS Imager System&#160;</td>
			<td >BioRad</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enhanced chemiluminescence detection kit&#160;</td>
			<td >Servicebio, Inc.,China</td>
			<td ></td>
			<td >cat. no. G2014</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td >Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix&#160;</td>
			<td rowspan="2" >11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted microscope&#160;</td>
			<td >Olympus, Tokyo, Japan;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millicell transwell inserts&#160;</td>
			<td >Millipore,Bedford, MA, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mitochondrial membrane potential assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF&#160;</td>
			<td >ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td >#ST506</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Real-time quantitative PCR instrument&#160;</td>
			<td rowspan="2" >Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPA Lysis Buffer&#160;</td>
			<td >Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td >15596026</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent&#160;</td>
			<td >Takara Bio Inc., Otsu, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Image-Pro</td>
			<td >&#160;plus 6.0&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

knockdown of fam83a to verify its role in cervical cancer cell growth and cisplatin sensitivity

A exploração de genes-alvo tumorais é de suma importância para a prevenção e tratamento do câncer cervical. Neste estudo, descrevemos as etapas envolvidas na identificação de um gene alvo tumoral FAM83A no câncer cervical. Primeiro, o conjunto de dados do Atlas do Genoma do Câncer foi empregado para validar a expressão e o significado prognóstico de FAM83A em mulheres. Um pequeno RNA de interferência (siRNA) foi usado para knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . Em seguida, a coloração de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi conduzida para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação das células tumorais. Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa foram realizados para avaliar a capacidade de migração e invasão de células tumorais.
Western blotting foi usado para quantificar os níveis de proteína relacionada à apoptose. A coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Além disso, a intervenção com cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP) foi utilizada para avaliar o potencial terapêutico do gene alvo. Citometria de fluxo e ensaios de formação de colônias foram conduzidos para validar ainda mais as características anticâncer do gene. Como resultado, o knockdown de FAM83A mostrou inibir a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical e sensibilizar essas células à cisplatina. Essas metodologias abrangentes validam coletivamente o FAM83A como um gene-alvo associado ao tumor, sendo promissor como um alvo terapêutico potencial na prevenção e tratamento do câncer cervical.

Cervical cancer is a global concern as it is one of the leading types of gynecological malignancy worldwide and is the major cause of cancer-related mortality in women1. Radical surgery and chemoradiotherapy are associated with high cure rates at the primary stage. However, treatment outcomes for patients at the advanced stage of cervical cancer who develop metastatic disease are very unfavorable2. Therefore, it is crucial to further understand the biological mechanisms underlying the migration and invasion of cervical cancer cells and identify potential therapeutic targets for the prevention and treatment of this disease.
Identifying target genes involved in cancer progression and finding ways to inhibit their expression or action present promising treatment options. In this study, we identified FAM83 as a cancer-causing gene and further investigated its inhibitory effects on C33a and HeLa cells. FAM83 family oncogenes (FAM83A-H) are widely reported in human cancers3,4. Recently, FAM83A was reported to be upregulated in lung5, breast6, ovarian7, and pancreatic8 cancers,indicating that FAM83A plays an important role in cancer progression via promoting the proliferation, invasion, stem-cell-like traits, and drug resistance in the tumor cells. Importantly, FAM83A was identified as one of the novel candidate genes associated with cervical lesion progression and carcinogenesis9. Despite the confirmation of elevated FAM83A expression in human cervical cancer cells, the specific impact and underlying mechanisms of FAM83A in cervical cancer remain unclear.
In this study, we outline the protocols involved in the identification of FAM83A as a tumor target gene in cervical cancer and use a small interfering RNA (siRNA) for the knockdown of the FAM83A gene in HeLa and C33a cells. 5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) staining was performed to determine the effects on tumor cell proliferation, while wound healing and porous membrane insert assays helped evaluate tumor cell migration and invasion abilities.
Western blotting was performed to determine the levels of apoptosis-related proteins, and JC-1 staining was employed to evaluate mitochondrial function alterations. Thus, we reported that FAM83A plays a critical role in cell proliferation, metastasis, and invasion in cervical cancer. Through PI3K/AKT-pathway-associated mitochondrial dysfunction and apoptosis, FAM83A knockdown sensitized cervical cancer cells to cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP). This study provides a new target for cervical cancer and possibly other cancers and a reference for the development of strategies to overcome the resistance of cancer cells to certain chemotherapeutic drugs.

Autor em destaque: explorando o papel do FAM83A no câncer do colo do útero 

Knockdown de FAM83A para verificar seu papel no crescimento de células de câncer cervical e sensibilidade à cisplatina

The scope of our research as focus are investigating the role of FAM83A in cervical cancer growths and cisplatin sensitivity. By addressing this question, we hope to contribute to the scientific understanding of the cervical cancer biology and potentially identify real therapeutic targets for this disease. We found LA sentencing FAM83A expirations as a scientist, cervical cancer cells uses platin treatment.Enhancing the drug satisfies a factor, and inhibiting the cell viability and migration. Our laboratory will focus and foreign research question in the future illustrating the medical mechanisms of FAM83A of FAM83A in cervical cancer. FAM83A in cervical cancer.Developing FAM83A inhibitors or technicalities. Developing FAM83A inhibitors or technicalities. The therapies starting the correlation between FAM83A and the patient prognosis between FAM83A and the patient prognosis and investigating the role of FAM83A in and investigating the role of FAM83A and investigating the orle of FAM83A in other types of cancer.

Análise do banco de dados TCGA e validação do PCR
A partir da análise do banco de dados TCGA, realizamos uma análise comparativa dos níveis de expressão de RNAm em 306 amostras de células de câncer cervical e 13 amostras de células normais para investigar a expressão diferencial de FAM83A. O FAM83A foi regulado para cima no câncer cervical, enquanto sua expressão no tecido cervical...

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Aqui, mostramos os procedimentos para knockdown do FAM83A ; os ensaios para detectar seus efeitos sobre a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical; e a sensibilização dessas células à cisplatina. Este estudo fornece um gene alvo promissor para o câncer cervical e uma referência para futuras pesquisas de drogas.

The exploration of tumor target genes holds paramount importance for the prevention and treatment of cervical cancer. In this study, we outline the steps ...

O escopo de nossa pesquisa como foco é investigar o papel do FAM83A no crescimento do câncer cervical e na sensibilidade à cisplatina. Ao abordar esta questão, espera-se contribuir para o entendimento científico da biologia do câncer do colo do útero e potencialmente identificar reais alvos terapêuticos para esta doença. Encontramos sentenças LA FAM83A expirações como um cientista, células de câncer cervical usa tratamento de platina.Melhorar a droga satisfaz um fator, e inibir a viabilidade celular e migração. Nosso laboratório irá focar e questão de pesquisa estrangeira no futuro ilustrando os mecanismos médicos de FAM83A de FAM83A no câncer cervical. FAM83A no câncer cervical.Desenvolvimento de inibidores ou aspectos técnicos de FAM83A. Desenvolvimento de inibidores ou aspectos técnicos de FAM83A. As terapias iniciam a correlação entre FAM83A e o prognóstico do paciente entre FAM83A e o prognóstico do paciente e investigam o papel do FAM83A e investigam o papel do FAM83A e investigam o orle do FAM83A em outros tipos de câncer.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity

520 visualizações.  Yangtze University. O escopo de nossa pesquisa como foco é investigar o papel do FAM83A no crescimento do câncer cervical e na sensibilidade à cisplatina. Ao abordar esta questão, espera-se contribuir para o entendimento científico da biologia do câncer do colo do útero e potencialmente identificar reais alvos terapêuticos para esta doença. Encontramos sentenças LA FAM83A expirações como um cientista, células de câncer cervical usa tratamento de platina.Melhorar a droga satisfaz um fator, e ...

Vídeo: Autor em destaque: explorando o papel do FAM83A no câncer do colo do útero 

The exploration of tumor target genes holds paramount importance for the prevention and treatment of cervical cancer. In this study, we outline the steps involved in the identification of a tumor target gene FAM83A in cervical cancer. First, the Cancer Genome Atlas dataset was employed to validate the expression and prognostic significance of FAM83A in women. A small interfering RNA (siRNA) was used for knockdown of the FAM83A gene in HeLa and C33a cells. Next, 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) staining was conducted to determine the effects on the proliferation capabilities of the tumor cells. Wound healing and porous membrane insert assays were performed to evaluate tumor cell migration and invasion abilities.
Western blotting was used to quantify apoptosis-related protein levels. JC-1 staining was employed to evaluate mitochondrial function alterations. Furthermore, cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP) intervention was used to assess the therapeutic potential of the target gene. Flow cytometry and colony formation assays were conducted to further validate the anticancer characteristics of the gene. As a result, FAM83A knockdown was shown to inhibit the proliferation, migration, and invasion of cervical cancer cells and sensitize these cells to cisplatin. These comprehensive methodologies collectively validate FAM83A as a tumor-associated target gene, holding promise as a potential therapeutic target in the prevention and treatment of cervical cancer.

Here, we show the procedures for FAM83A knockdown; the assays to detect its effects on proliferation, migration, and invasion of cervical cancer cells; and the sensitization of these cells to cisplatin. This study provides a promising target gene for cervical cancer and a reference for further drug research.