Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de la Oficina de Ciencia y Tecnología de Jingzhou (n.º 2020HC06).

El estudio se ajustó plenamente a las directrices de publicación proporcionadas por la TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
1. Fuente de datos y análisis bioinformático
<ol><li>Obtenga datos de secuenciación de ARN de la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) para el análisis de conglomerados. Utilice GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), una herramienta basada en la web para volver a calcular los datos de secuenciación de ARN sin procesar de muestras de proyectos TCGA, para detectar dianas farmacológicas candidatas contra el cáncer con una línea de procesamiento estándar. NOTA: El sitio web de GEPIA está disponible gratuitamente para todos los usuarios.</li>
	<li>Acceda a la página de inicio del sitio web de GEPIA y haga clic en Análisis de tipo de cáncer, seleccione la opción Análisis de genes diferenciales y establezca los siguientes parámetros: Nombre del cáncer = CESE (definido como carcinoma de células escamosas de cuello uterino y adenocarcinoma de endocuello uterino en esta página web), |Log2FC| Punto de corte = 1, valor de corte q = 0,01, métodos diferenciales = ANOVA y distribución cromosómica = ambos. A continuación, haga clic en Lista para obtener una lista de genes que muestra la expresión diferencial entre los grupos tumorales y normales. NOTA: Se requiere una extensa revisión de la literatura para identificar genes candidatos expresados diferencialmente. En este estudio, teniendo en cuenta los antecedentes de la literatura disponible, nos centramos en el gen tumoral de interés, FAM83A.</li>
	<li>A continuación, examine la expresión de FAM83A en el cáncer de cuello uterino y en los tejidos normales utilizando GEPIA procediendo a la opción Expression DIY en el sitio web y seleccione Boxplot como tipo de gráfico. Introduzca FAM83A en el campo de parámetros del gen y establezca los siguientes parámetros: |Log2FC| Valor de corte = 1; valor q Punto de corte = 0,01. Seleccione CESE como nombre del cáncer y Coincidir con los datos normales de TCGA para el campo de datos Normal coincidente , dejando todas las demás configuraciones en su valor predeterminado. Haga clic en Plot y permita que el sitio web genere un diagrama de caja que represente la expresión diferencial del gen FAM83A ; Guarde el diagrama de caja para futuras referencias y análisis.</li>
	<li>Por último, analizar la supervivencia global de pacientes portadoras de tumores con diferentes niveles de expresión de FAM83A en cáncer de cuello uterino. Vaya a la opción Survival Plots en el sitio web, establezca el gen en FAM83A y seleccione Overall Survival como tipo de análisis. Agregue el nombre del tumor CESE, elija Meses para las Unidades del eje y deje todos los demás parámetros en su configuración predeterminada. Haga clic en Trazar y deje que el sitio web genere un gráfico de curva de supervivencia; Guarde este gráfico para futuras referencias y análisis.</li>
	<li>Tener en cuenta tanto la expresión diferencial de FAM83A en tumores como su correlación con el análisis de supervivencia de las pacientes para identificar FAM83A como un gen diana terapéutica potencial en el cáncer de cuello uterino.</li>
</ol>2. Experimentos basados en células
<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Cultivo de líneas celulares tumorales humanas en el medio modificado a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 . NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre la línea celular y los componentes del medio de cultivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfección celular<ol><li>Utilice siRNA para reducir la expresión de FAM83A en las células. NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver la secuencia específica de siRNA.</li>
		<li>Células de siembra en placas de 6 pocillos e incubar con la mezcla de 50 nM de si-FAM83A o siRNA-NC y 8 μL de agente de transfección o solo 8 μL de agente de transfección durante 4-6 h después de alcanzar una confluencia del 50%-70%. Agregue solo DMEM sin suero al control negativo.</li>
		<li>Después de la incubación, reemplace el medio que contiene el agente de transfección con DMEM + suero fetal para terneros al 10%. Además, 48 h después de la transfección, tratar con 5 μM de cisplatino (DDP) durante 24 h según lo previsto y recolectar todas las células para la extracción de ARN total y el análisis qRT-PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Detección de EdU para el ensayo de proliferación celular
NOTA: Utilice el kit de proliferación celular EdU para evaluar la proliferación celular in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
<ol><li>Siembre las células en placas de 6 pocillos e incorpórelas con 10 μM de solución de EdU durante 2 h. Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT) y permeabilizar con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min a RT.</li>
	<li>Retire el tampón de permeabilización y agregue 500 μL de solución de reacción 1x. A continuación, incubar durante 30 minutos a RT en la oscuridad para la tinción nuclear.</li>
	<li>Tiñir las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y visualizarlas bajo un microscopio de fluorescencia con un aumento de 200x. Tiñir los núcleos de las células en proliferación con EdU y examinarlos en busca de fluorescencia roja.</li>
	<li>Por último, utilice un software para cuantificar los resultados contando al menos 10 campos aleatorios y calcule las tasas de proliferación utilizando la proporción de células fluorescentes positivas con respecto al total de células.</li>
</ol>4. Ensayo de cicatrización de heridas
<ol><li>Células de siembra en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 105 celdas por pocillo.</li>
	<li>Cuando las células alcancen el 90 % de confluencia, utilice una punta de micropipeta estéril de 10 μL para crear suavemente un rasguño lineal en la monocapa celular. Enjuague suavemente los pocillos con PBS estéril para eliminar las células desprendidas y los residuos causados por el rascado.</li>
	<li>Además, incube las células en un medio que contenga 1% de FBS. Luego, observe y tome imágenes con el microscopio invertido para la curación de la región herida a las 12, 24 y 48 h.</li>
</ol>5. Ensayo de inserto de membrana porosa
<ol><li>Preparar una suspensión celular en medio de cultivo celular a la concentración celular deseada (que contenga 4 × 104 células), incluidas las células C33a transfectadas o de control y HeLa. Agregue la suspensión celular a la cámara superior de los insertos de membrana, asegurando una distribución uniforme. Agregue medio completo a la cámara inferior.</li>
	<li>Después de la incubación durante 24 h, utilizar alcohol metílico y violeta cristalino al 0,1% para la fijación y tinción de las células que migran a las cámaras inferiores, respectivamente.</li>
	<li>Utilice un microscopio invertido para tomar imágenes y, a continuación, analice el número de células migratorias contando al menos 10 campos aleatorios con ImageJ.<ol><li>Para el análisis de números con ImageJ, abra la imagen en el software ImageJ, vaya a la pestaña Imagen en el menú de herramientas, seleccione Ajustar y luego haga clic en Umbral. Ajuste la configuración del umbral, si es necesario, hasta que solo las celdas sean visibles sobre un fondo blanco.</li>
		<li>Haga clic en Aplicar en la ventana Umbral para aplicar esta configuración a la imagen. Ahora, seleccione la herramienta Varita (trazado) de la barra de herramientas (ubicada en la parte superior de la ventana).</li>
		<li>Haga clic en el área de la imagen donde se encuentran las celdas para seleccionar todas las celdas de la imagen con umbral. Después de resaltar las celdas, vaya a Analizar en el menú Herramienta y luego haga clic en Analizar partículas. En la ventana Analizar partículas, introduzca el tamaño deseado (p. ej., 0 - infinito) y los valores de circularidad (p. ej., 0,00 - 1,00) de acuerdo con los requisitos experimentales para incluir todas las celdas en el recuento.</li>
		<li>Haga clic en Aceptar y espere a que el software cuente las celdas y a que aparezca una nueva ventana con los resultados del análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Ensayo de formación de colonias
<ol><li>Siembre 2 × 105 células por pocillo de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de 6 pocillos con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM durante 24 h.</li>
	<li>Después de un período de 24 horas de tratamiento farmacológico, separar las células con tripsina al 0,25% y volver a suspenderlas en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de FBS. Siembre las células resuspendidas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 103 celdas por pocillo, y luego incube en una incubadora de CO2 al 5% a una temperatura de 37 °C.</li>
	<li>Después de la incubación durante ~7-10 días cuando las colonias son visibles, fije las células con polioximetileno al 4% y tiña con solución de tinción Giemsa durante 20 minutos.</li>
	<li>Lave ligeramente las celdas y deje que las placas se sequen al aire. Tome imágenes de los grupos de colonias con el microscopio y cuente el número de colonias que contienen más de 50 células.</li>
</ol>7. Análisis de despolarización de la membrana mitocondrial (MMP) con colorante JC-1
<ol><li>Siembre 1,2 × 106 células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.</li>
	<li>Incubar con 1x solución de tinción JC-1 durante 15-20 min bajo 5% de CO2 a 37 °C utilizando un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Lave las células y examínelas bajo un microscopio fluorescente a un aumento de 200x utilizando longitudes de onda de excitación y emisión para JC-1 a ~490 nm y 590 nm, respectivamente. Para visualizar la fluorescencia JC-1, utilice los filtros adecuados, como un filtro de excitación azul (450-490 nm) y un filtro de emisión rojo (paso largo > 590 nm) para capturar selectivamente la señal de fluorescencia emitida.</li>
</ol>8. Análisis citométrico de flujo de mPTP
<ol><li>Siembre 1,2 × 106 células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células, vuelva a suspender las células en PBS y agregue 300 μL cada una (1x volumen) de solución de tinción de Calceína AM y solución de trabajo de extinción de fluorescencia para cubrir las células de manera uniforme. Incubar las células a 37 °C en un ambiente protegido de la luz durante 30-45 min, y sustituir el medio por medio de cultivo fresco precalentado a 37 °C. Incubar las células a 37 °C en un ambiente protegido de la luz durante 30 minutos adicionales para asegurar la hidrólisis completa de la Calceína AM por esterasas intracelulares, lo que da como resultado la generación de Calceína verde fluorescente intracelular.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo, lave las células 2-3 veces con PBS y agregue un tampón de detección. Detecte mPTP celular mediante citometría de flujo y una longitud de onda de excitación de 488 nm.</li>
</ol>9. Citometría de flujo
<ol><li>Siembre 1,2 × 106 células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.</li>
	<li>Después de 24 h de tratamiento farmacológico, vuelva a suspender las células en 200 μL de solución tampón de unión y mezcle suavemente 10 μL de anexina V-FITC y 5 μL de yoduro de propidio (PI) en la suspensión celular. Incubar la mezcla durante 15 minutos evitando la luz y añadir 300 μL de solución tampón aglutinante a las células. Detecte la apoptosis celular mediante citometría de flujo a una longitud de onda de excitación de 488 nm.</li>
</ol>10. Análisis RT-PCR
<ol><li>Siembre 1,2 × 106 células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.</li>
	<li>Extraiga el ARN total de las células tumorales utilizando el reactivo de extracción de ARN y convierta el ARN extraído en ADN complementario (ADNc) con la mezcla de síntesis de ADNc incubando a 42 °C durante 45 min y luego a 95 °C durante 5 min.</li>
	<li>Prepare la mezcla de reacción de PCR que contiene ADN polimerasa, nucleótidos, tampón y los cebadores específicos del gen diseñados. Añadir la plantilla de ADNc a la mezcla de reacción para la reacción de PCR en tiempo real y realizar la PCR en el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real con las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s, y la etapa de curva de fusión a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s. Cuantificar los niveles de ARNm mediante el método 2−ΔΔCq utilizando GAPDH como control interno. NOTA: El sistema de reacción RT-PCR se muestra en la Tabla 1 y las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1.<ol><li>Para calcular el valor 2−ΔΔCq , mida los valores de Cq para el gen diana y el gen de referencia (GAPDH) en las muestras. Calcule el ΔCq restando el valor de Cq del gen de referencia del valor de Cq del gen objetivo para cada muestra. Calcule el ΔΔCq restando el ΔCq de una muestra de control del ΔCq de cada muestra experimental. Por último, calcula el valor 2−ΔΔCq elevando 2 a la potencia del valor ΔΔCq. NOTA: El valor Cq representa el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia alcanza el umbral establecido.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Análisis de Western blot
<ol><li>Siembre 1,2 × 106 células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.</li>
	<li>Recoja las células cultivadas y lávelas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para eliminar cualquier medio de crecimiento o suero residual. Lisar las células utilizando el tampón de lisis RIPA que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para liberar las proteínas celulares. Incubar las células en hielo durante unos minutos para asegurar una lisis completa y centrifugar a 4 °C, 12.000 × g durante 15 min. Recoja el sobrenadante para determinar su concentración de proteína.</li>
	<li>Determine la concentración de proteínas en el lisado celular utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar el lisado celular con un tampón de carga y calentar la mezcla a 95-100 °C durante 5-10 min para desnaturalizar las proteínas y asegurar una separación uniforme en el gel.</li>
	<li>De cada muestra, cargue 30 μg de proteína total en un gel SDS-PAGE y haga funcionar el SDS-PAGE a un voltaje constante de 80 V. Detenga la electroforesis cuando el azul de bromofenol llegue al fondo del gel de separación.</li>
	<li>Transfiera las proteínas separadas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilo utilizando un sistema de transferencia húmeda en un baño de hielo con una corriente de 200 mA durante 1,5 h.</li>
	<li>Bloquear la membrana con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris con tampón Tween-20 al 0,05% (TBST) durante 1 h a RT e incubar durante la noche a 4 °C con los anticuerpos respectivos indicados en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Lavar la membrana varias veces con TBST e incubar con los anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) durante 1 h en RT, seguido de lavado con TBST. Visualice las bandas de proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia mejorado y un sistema de generación de imágenes.</li>
</ol>12. Análisis estadístico
<ol><li>Como todos los puntos de datos experimentales serán independientes, presente los datos como la media ± DE. Realice análisis estadísticos.</li>
	<li>Utilice el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparaciones múltiples y la prueba de Dunnett para comparar cada grupo con el grupo de control. Utilice la prueba t de Student (dos colas no apareadas) para comparar dos grupos; consideran que P < 0,05 son significativos.</li>
</ol>

Validación de FAM83A como gen diana en cáncer de cuello uterino

<ol>
	<li>Arbyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+incidence+and+mortality+of+cervical+cancer+in+2018:+a+worldwide+analysis.">Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis.</a> Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).</li><li>Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+cancer.">Cervical cancer.</a> Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).</li><li>Cipriano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+oncogenic+behavior+of+the+fam83+family+regulates+mapk+signaling+in+human+cancer.">Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer.</a> Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).</li><li>Snijders, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal Of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).</li><li>Bonora, M., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+cancer:+molecular+mechanisms+involved+in+cell+death.">The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death.</a> Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).</li><li>Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALAT1+promotes+cisplatin+resistance+in+cervical+cancer+by+activating+the+pi3k/akt+pathway.">MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).</li><li>Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatidylinositol+3-kinase+(pi3k)-akt+pathway+suppresses+bax+translocation+to+mitochondria.">The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria.</a> Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. 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Los autores no reportan conflictos de interés en este trabajo.

La investigación de los genes diana tumorales es de suma importancia tanto para la prevención como para el tratamiento del cáncer de cuello uterino. La comprensión de los genes específicos que desempeñan un papel importante en el desarrollo y la progresión del cáncer de cuello uterino proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la enfermedad. Además, la identificación de estos genes diana puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y terapias dirigidas. ...

El cáncer de cuello uterino es una preocupación mundial, ya que es uno de los principales tipos de neoplasias malignas ginecológicas en todo el mundo y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en las mujeres1. La cirugía radical y la quimiorradioterapia se asocian con altas tasas de curación en la etapa primaria. Sin embargo, los resultados del tratamiento para las pacientes en estadio avanzado de cáncer de cuello uterino que desarrollan enfermedad metastásica son muy desfavorables2. Por lo tanto, es crucial comprender mejor los mecanismos biológicos que subyacen a la migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino e identificar posibles dianas terapéuticas para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad.
La identificación de genes diana implicados en la progresión del cáncer y la búsqueda de formas de inhibir su expresión o acción presentan opciones de tratamiento prometedoras. En este estudio, identificamos FAM83 como un gen causante de cáncer e investigamos más a fondo sus efectos inhibidores en las células C33a y HeLa. Los oncogenes de la familia FAM83 (FAM83A-H) están ampliamente reportados en cánceres humanos 3,4. Recientemente, se informó que FAM83A está regulado al alza en los cánceres de pulmón5, mama6, ovario7 y páncreas8, lo que indica que FAM83A desempeña un papel importante en la progresión del cáncer al promover la proliferación, la invasión, los rasgos similares a las células madre y la resistencia a los medicamentos en las células tumorales. Es importante destacar que FAM83A se identificó como uno de los nuevos genes candidatos asociados con la progresión de las lesiones cervicales y la carcinogénesis9. A pesar de la confirmación de la expresión elevada de FAM83A en células de cáncer de cuello uterino humano, el impacto específico y los mecanismos subyacentes de FAM83A en el cáncer de cuello uterino siguen sin estar claros.
En este estudio, describimos los protocolos involucrados en la identificación de FAM83A como un gen diana tumoral en el cáncer de cuello uterino y utilizamos un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en células HeLa y C33a . Se realizó la tinción con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la proliferación de células tumorales, mientras que la cicatrización de heridas y los ensayos de inserción de membranas porosas ayudaron a evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.
Se realizó Western blot para determinar los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, y se empleó la tinción de JC-1 para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Por lo tanto, informamos que FAM83A desempeña un papel crítico en la proliferación celular, la metástasis y la invasión en el cáncer de cuello uterino. A través de la disfunción mitocondrial y la apoptosis asociadas a la vía PI3K/AKT, FAM83A sensibilizó las células de cáncer de cuello uterino al cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP). Este estudio proporciona una nueva diana para el cáncer de cuello uterino y posiblemente otros cánceres y una referencia para el desarrollo de estrategias para superar la resistencia de las células cancerosas a ciertos fármacos quimioterapéuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >Cells and Medium Formulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C33a</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hela</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modified medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody Information</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AKT</td>
			<td >4691, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bcl2&#160;</td>
			<td >26593-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caspase 3</td>
			<td >19677-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cleaved-caspase3</td>
			<td >abs132005; Absin Bioscience Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytc</td>
			<td >10993-1-AP; Proteintech Group</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GAPDH&#160;</td>
			<td >10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:8,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTOR</td>
			<td >2983, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI3K</td>
			<td >4292, Cell Signaling Technology Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-AKT&#160;</td>
			<td >4060, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-mTOR (Ser2448)</td>
			<td >#5536, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-PI3K p85 subunit</td>
			<td >17366, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibodies</td>
			<td >GB23303, Servicebio</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plate</td>
			<td >Corning, NPY</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555</td>
			<td >Beyotime</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >P0011</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChemiDoc XRS Imager System&#160;</td>
			<td >BioRad</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enhanced chemiluminescence detection kit&#160;</td>
			<td >Servicebio, Inc.,China</td>
			<td ></td>
			<td >cat. no. G2014</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td >Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix&#160;</td>
			<td rowspan="2" >11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted microscope&#160;</td>
			<td >Olympus, Tokyo, Japan;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millicell transwell inserts&#160;</td>
			<td >Millipore,Bedford, MA, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mitochondrial membrane potential assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF&#160;</td>
			<td >ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td >#ST506</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Real-time quantitative PCR instrument&#160;</td>
			<td rowspan="2" >Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPA Lysis Buffer&#160;</td>
			<td >Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td >15596026</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent&#160;</td>
			<td >Takara Bio Inc., Otsu, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Image-Pro</td>
			<td >&#160;plus 6.0&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

knockdown of fam83a to verify its role in cervical cancer cell growth and cisplatin sensitivity

La exploración de los genes diana tumorales es de suma importancia para la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino. En este estudio, describimos los pasos involucrados en la identificación de un gen diana tumoral FAM83A en el cáncer de cuello uterino. En primer lugar, se empleó el conjunto de datos del Atlas del Genoma del Cáncer para validar la expresión y la importancia pronóstica de FAM83A en mujeres. Se utilizó un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en las células HeLa y C33a . A continuación, se realizó la tinción con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la capacidad de proliferación de las células tumorales. Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas e inserción de membranas porosas para evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.
Se utilizó Western blot para cuantificar los niveles de proteínas relacionados con la apoptosis. La tinción con JC-1 se empleó para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Además, se utilizó la intervención con cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP) para evaluar el potencial terapéutico del gen diana. Se realizaron citometrías de flujo y ensayos de formación de colonias para validar aún más las características anticancerosas del gen. Como resultado, se demostró que el knockdown de FAM83A inhibe la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino y sensibiliza a estas células al cisplatino. Estas metodologías integrales validan colectivamente FAM83A como un gen diana asociado a tumores, que es prometedor como una posible diana terapéutica en la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino.

Cervical cancer is a global concern as it is one of the leading types of gynecological malignancy worldwide and is the major cause of cancer-related mortality in women1. Radical surgery and chemoradiotherapy are associated with high cure rates at the primary stage. However, treatment outcomes for patients at the advanced stage of cervical cancer who develop metastatic disease are very unfavorable2. Therefore, it is crucial to further understand the biological mechanisms underlying the migration and invasion of cervical cancer cells and identify potential therapeutic targets for the prevention and treatment of this disease.
Identifying target genes involved in cancer progression and finding ways to inhibit their expression or action present promising treatment options. In this study, we identified FAM83 as a cancer-causing gene and further investigated its inhibitory effects on C33a and HeLa cells. FAM83 family oncogenes (FAM83A-H) are widely reported in human cancers3,4. Recently, FAM83A was reported to be upregulated in lung5, breast6, ovarian7, and pancreatic8 cancers,indicating that FAM83A plays an important role in cancer progression via promoting the proliferation, invasion, stem-cell-like traits, and drug resistance in the tumor cells. Importantly, FAM83A was identified as one of the novel candidate genes associated with cervical lesion progression and carcinogenesis9. Despite the confirmation of elevated FAM83A expression in human cervical cancer cells, the specific impact and underlying mechanisms of FAM83A in cervical cancer remain unclear.
In this study, we outline the protocols involved in the identification of FAM83A as a tumor target gene in cervical cancer and use a small interfering RNA (siRNA) for the knockdown of the FAM83A gene in HeLa and C33a cells. 5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) staining was performed to determine the effects on tumor cell proliferation, while wound healing and porous membrane insert assays helped evaluate tumor cell migration and invasion abilities.
Western blotting was performed to determine the levels of apoptosis-related proteins, and JC-1 staining was employed to evaluate mitochondrial function alterations. Thus, we reported that FAM83A plays a critical role in cell proliferation, metastasis, and invasion in cervical cancer. Through PI3K/AKT-pathway-associated mitochondrial dysfunction and apoptosis, FAM83A knockdown sensitized cervical cancer cells to cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP). This study provides a new target for cervical cancer and possibly other cancers and a reference for the development of strategies to overcome the resistance of cancer cells to certain chemotherapeutic drugs.

Autor destacado: Explorando el papel de FAM83A en el cáncer de cuello uterino 

Eliminación de FAM83A para verificar su papel en el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino

The scope of our research as focus are investigating the role of FAM83A in cervical cancer growths and cisplatin sensitivity. By addressing this question, we hope to contribute to the scientific understanding of the cervical cancer biology and potentially identify real therapeutic targets for this disease. We found LA sentencing FAM83A expirations as a scientist, cervical cancer cells uses platin treatment.Enhancing the drug satisfies a factor, and inhibiting the cell viability and migration. Our laboratory will focus and foreign research question in the future illustrating the medical mechanisms of FAM83A of FAM83A in cervical cancer. FAM83A in cervical cancer.Developing FAM83A inhibitors or technicalities. Developing FAM83A inhibitors or technicalities. The therapies starting the correlation between FAM83A and the patient prognosis between FAM83A and the patient prognosis and investigating the role of FAM83A in and investigating the role of FAM83A and investigating the orle of FAM83A in other types of cancer.

Análisis de la base de datos TCGA y validación de PCR
A partir del análisis de la base de datos TCGA, realizamos un análisis comparativo de los niveles de expresión de ARNm en 306 muestras de células de cáncer de cuello uterino y 13 muestras de células normales para investigar la expresión diferencial de FAM83A. FAM83A fue regulado al alza en el cáncer de cuello uterino, mientras que ...

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Aquí, mostramos los procedimientos para el derribo de FAM83A ; los ensayos para detectar sus efectos sobre la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino; y la sensibilización de estas células al cisplatino. Este estudio proporciona un gen diana prometedor para el cáncer de cuello uterino y una referencia para futuras investigaciones farmacológicas.

The exploration of tumor target genes holds paramount importance for the prevention and treatment of cervical cancer. In this study, we outline the steps ...

El alcance de nuestra investigación como enfoque es investigar el papel de FAM83A en el crecimiento del cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino. Al abordar esta pregunta, esperamos contribuir a la comprensión científica de la biología del cáncer de cuello uterino y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos reales para esta enfermedad. Encontramos LA sentencia FAM83A expiraciones como científico, las células de cáncer de cuello uterino utilizan el tratamiento con platino.La mejora del fármaco satisface un factor e inhibe la viabilidad y la migración celular. Nuestro laboratorio se centrará en una pregunta de investigación extranjera en el futuro que ilustre los mecanismos médicos de FAM83A de FAM83A en el cáncer de cuello uterino. FAM83A en el cáncer de cuello uterino.Desarrollo de inhibidores o tecnicismos de FAM83A. Desarrollo de inhibidores o tecnicismos de FAM83A. Las terapias inician la correlación entre FAM83A y el pronóstico del paciente entre FAM83A y el pronóstico del paciente e investigan el papel de FAM83A en otros tipos de cáncer.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity

511 vistas.  Yangtze University. El alcance de nuestra investigación como enfoque es investigar el papel de FAM83A en el crecimiento del cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino. Al abordar esta pregunta, esperamos contribuir a la comprensión científica de la biología del cáncer de cuello uterino y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos reales para esta enfermedad. Encontramos LA sentencia FAM83A expiraciones como científico, las células de cáncer de cuello uterino utilizan el tratamien...