Questo lavoro è stato sostenuto dalla Jingzhou Science and Technology Bureau Foundation (n. 2020HC06).

Lo studio è stato completamente conforme alle linee guida di pubblicazione fornite dal TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Fonte dei dati e analisi bioinformatica
<ol><li>Ottieni i dati di sequenziamento dell'RNA dal database Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) per l'analisi dei cluster. Utilizzare GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uno strumento basato sul web per ricalcolare i dati grezzi RNA-Seq dei campioni provenienti dai progetti TCGA, per lo screening di bersagli di farmaci antitumorali candidati con una pipeline di elaborazione standard. NOTA: Il sito web GEPIA è disponibile gratuitamente per tutti gli utenti.</li>
	<li>Accedere alla home page del sito web GEPIA e fare clic su Analisi del tipo di cancro, selezionare l'opzione Analisi dei geni differenziali e impostare i seguenti parametri: Nome del cancro = CESE (definito come carcinoma a cellule squamose cervicale e adenocarcinoma endocervicale in questa pagina web), |Log2FC| Cutoff = 1, Cutoff del valore q = 0,01, Metodi differenziali = ANOVA e Distribuzione cromosomica = entrambi. Quindi, fare clic su Elenco per ottenere un elenco di geni che mostra l'espressione differenziale tra i gruppi tumorali e normali. NOTA: Richiede un'ampia revisione della letteratura per identificare i geni candidati differenzialmente espressi. In questo studio, considerando il background della letteratura disponibile, ci concentriamo sul gene tumorale di interesse, FAM83A.</li>
	<li>Quindi, esaminare l'espressione di FAM83A nel cancro cervicale e nei tessuti normali utilizzando GEPIA procedendo all'opzione Espressione fai-da-te sul sito Web e selezionare Boxplot come tipo di grafico. Inserire FAM83A nel campo dei parametri del gene e impostare i seguenti parametri: |Log2FC| Valore limite = 1; valore q Cutoff = 0,01. Selezionare CESE come nome del cancro e Corrispondenza dati TCGA normali per il campo dati Normale corrispondente , lasciando tutte le altre impostazioni predefinite. Clicca su Plot e consenti al sito web di generare un boxplot che rappresenti l'espressione differenziale del gene FAM83A ; Salvare il boxplot per riferimento e analisi futuri.</li>
	<li>Infine, analizzare la sopravvivenza globale di pazienti portatori di tumori con diversi livelli di espressione di FAM83A nel carcinoma cervicale. Passare all'opzione Grafici di sopravvivenza sul sito Web, impostare il gene su FAM83A e selezionare Sopravvivenza globale come tipo di analisi. Aggiungere il nome del tumore CESE, scegliere Mesi per le unità dell'asse e lasciare tutti gli altri parametri alle impostazioni predefinite. Fai clic su Traccia e lascia che il sito Web generi un grafico della curva di sopravvivenza; Salvare questo grafico per riferimento e analisi future.</li>
	<li>Prendere in considerazione sia l'espressione differenziale di FAM83A nei tumori che la sua correlazione con l'analisi della sopravvivenza dei pazienti per identificare FAM83A come potenziale gene bersaglio terapeutico nel cancro cervicale.</li>
</ol>2. Esperimenti basati su cellule
<ol><li>Colture cellulari<ol><li>Coltura di linee cellulari tumorali umane nel terreno modificato a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 . NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le informazioni sulla linea cellulare e i componenti del terreno di coltura.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasfezione cellulare<ol><li>Usa il siRNA per abbattere l'espressione di FAM83A nelle cellule. NOTA: Vedere la Tabella 1 per la sequenza specifica di siRNA.</li>
		<li>Cellule seme in piastre a 6 pozzetti e incubare con la miscela di 50 nM si-FAM83A o siRNA-NC e 8 μL di agente di trasfezione o solo 8 μL di agente di trasfezione per 4-6 ore dopo aver raggiunto il 50%-70% di confluenza. Aggiungere solo DMEM senza siero al controllo negativo.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, sostituire il terreno contenente l'agente di trasfezione con DMEM + 10% di siero fetale di vitello. Inoltre, 48 ore dopo la trasfezione, trattare con 5 μM di cisplatino (DDP) per 24 ore come previsto e prelevare tutte le cellule per l'estrazione dell'RNA totale e l'analisi qRT-PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Rilevamento di EdU per il saggio di proliferazione cellulare
NOTA: Utilizzare il kit di proliferazione cellulare EdU per valutare la proliferazione cellulare in vitro secondo le istruzioni del produttore.
<ol><li>Seminare le cellule in piastre a 6 pozzetti e incubarle con una soluzione di EdU da 10 μM per 2 ore. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e aggiungere 500 μL di soluzione di reazione 1x. Quindi, incubare per 30 minuti a RT al buio per la colorazione nucleare.</li>
	<li>Colorare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e visualizzarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x. Colorare i nuclei delle cellule proliferanti con EdU ed esaminarli per la fluorescenza rossa.</li>
	<li>Infine, utilizzare un software per quantificare i risultati contando almeno 10 campi casuali e calcolare i tassi di proliferazione utilizzando il rapporto tra le cellule fluorescenti-positive e le cellule totali.</li>
</ol>4. Saggio di guarigione delle ferite
<ol><li>Cellule seme in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 105 cellule per pozzetto.</li>
	<li>Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, utilizzare un puntale sterile per micropipette da 10 μL per creare delicatamente un graffio lineare nel monostrato cellulare. Sciacquare delicatamente i pozzetti con PBS sterile per rimuovere eventuali cellule staccate e detriti causati da graffi.</li>
	<li>Inoltre, incubare le cellule in un terreno contenente l'1% di FBS. Quindi, osserva e scatta immagini con il microscopio invertito per la guarigione della regione ferita a 12, 24 e 48 ore.</li>
</ol>5. Saggio dell'inserto a membrana porosa
<ol><li>Preparare una sospensione cellulare in terreno di coltura cellulare alla concentrazione cellulare desiderata (contenente 4 × 104 cellule), comprese le cellule C33a trasfettate o di controllo e l'HeLa. Aggiungere la sospensione cellulare nella camera superiore degli inserti a membrana, garantendo una distribuzione uniforme. Aggiungere il terreno completo nella camera inferiore.</li>
	<li>Dopo un'incubazione di 24 ore, utilizzare alcol metilico e violetto cristallino allo 0,1% per la fissazione e la colorazione delle cellule che migrano rispettivamente nelle camere inferiori.</li>
	<li>Usa un microscopio invertito per scattare immagini e quindi analizzare il numero di cellule che migrano contando almeno 10 campi casuali con ImageJ.<ol><li>Per l'analisi dei numeri con ImageJ, aprire l'immagine nel software ImageJ, andare alla scheda Immagine nel menu degli strumenti, selezionare Regola, quindi fare clic su Soglia. Regolare le impostazioni di soglia, se necessario, fino a quando solo le celle sono visibili su uno sfondo bianco.</li>
		<li>Fare clic su Applica nella finestra Soglia per applicare queste impostazioni all'immagine. Ora, seleziona lo strumento Bacchetta (tracciamento) dalla barra degli strumenti (situata nella parte superiore della finestra).</li>
		<li>Fare clic sull'area dell'immagine in cui si trovano le celle per selezionare tutte le celle dell'immagine con soglia. Dopo aver evidenziato le celle, vai su Analizza nel menu Strumenti, quindi fai clic su Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, immettere la dimensione desiderata (ad esempio, 0 - infinito) e i valori di circolarità (ad esempio, 0,00 - 1,00) in base ai requisiti sperimentali per includere tutte le celle nel conteggio.</li>
		<li>Fare clic su OK e attendere che il software conti le celle e che venga visualizzata una nuova finestra con i risultati dell'analisi.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Saggio di formazione delle colonie
<ol><li>Seme 2 × 105 cellule per pozzetto di gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a 6 pozzetti con o senza trattamento con cisplatino (DDP) 5 μM per 24 ore.</li>
	<li>Dopo un periodo di 24 ore di trattamento farmacologico, staccare le cellule utilizzando tripsina allo 0,25% e risospenderle nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di FBS. Seminare le cellule risospese in una piastra a 6 pozzetti con una densità di 1 × 103 cellule per pozzetto, quindi incubare in un incubatore al 5% di CO2 a una temperatura di 37 °C.</li>
	<li>Dopo l'incubazione per ~7-10 giorni quando le colonie sono visibili, fissare le cellule con poliossimetilene al 4% e colorarle con la soluzione colorante Giemsa per 20 minuti.</li>
	<li>Lavare leggermente le celle e lasciare asciugare le piastre all'aria. Scatta immagini degli ammassi di colonie al microscopio e conta il numero di colonie che contengono più di 50 cellule.</li>
</ol>7. Analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale (MMP) utilizzando il colorante JC-1
<ol><li>Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.</li>
	<li>Incubare con 1x soluzione colorante JC-1 per 15-20 minuti al 5% di CO2 a 37 °C utilizzando un kit per il saggio del potenziale di membrana mitocondriale secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Lavare le cellule ed esaminarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per JC-1 rispettivamente a ~490 nm e 590 nm. Per visualizzare la fluorescenza JC-1, utilizzare filtri appropriati, come un filtro di eccitazione blu (450-490 nm) e un filtro di emissione rosso (> passa-lungo 590 nm) per catturare selettivamente il segnale di fluorescenza emesso.</li>
</ol>8. Analisi citofluorimetrica di mPTP
<ol><li>Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, risospendere le cellule in PBS e aggiungere 300 μL ciascuna (1x volume) di soluzione di colorazione Calcein AM e soluzione di lavoro di quenching fluorescente per coprire uniformemente le cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per 30-45 minuti e sostituire il terreno con terreno di coltura fresco preriscaldato a 37 °C. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per altri 30 minuti per garantire la completa idrolisi della Calceina AM da parte delle esterasi intracellulari, con conseguente generazione di Calceina intracellulare verde-fluorescente.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule 2-3 volte con PBS e aggiungere il tampone di rilevamento. Rileva l'mPTP cellulare utilizzando la citometria a flusso e una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.</li>
</ol>9. Citometria a flusso
<ol><li>Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.</li>
	<li>Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, sospendere nuovamente le cellule in 200 μL di soluzione tampone legante e mescolare delicatamente 10 μL di annessina V-FITC e 5 μL di ioduro di propidio (PI) nella sospensione cellulare. Incubare la miscela per 15 minuti evitando la luce e aggiungere 300 μL di soluzione tampone legante alle cellule. Rilevare l'apoptosi cellulare utilizzando la citometria a flusso a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.</li>
</ol>10. Analisi RT-PCR
<ol><li>Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.</li>
	<li>Estrarre l'RNA totale dalle cellule tumorali utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA e convertire l'RNA estratto in DNA complementare (cDNA) con la miscela di sintesi del cDNA incubando a 42 °C per 45 minuti e poi a 95 °C per 5 minuti.</li>
	<li>Preparare la miscela di reazione PCR contenente DNA polimerasi, nucleotidi, tampone e primer gene-specifici progettati. Aggiungere il modello di cDNA alla miscela di reazione per la reazione di PCR in tempo reale ed eseguire la PCR sullo strumento di PCR quantitativa in tempo reale con le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s, e la fase della curva di fusione a 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min e 95 °C per 15 s. Quantificare i livelli di mRNA utilizzando il metodo 2−ΔΔCq utilizzando GAPDH come controllo interno. NOTA: Il sistema di reazione RT-PCR è mostrato nella Tabella 1 e le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.<ol><li>Per calcolare il valore 2−ΔΔCq , misurare i valori di Cq per il gene bersaglio e il gene di riferimento (GAPDH) nei campioni. Calcolare il ΔCq sottraendo il valore Cq del gene di riferimento dal valore Cq del gene bersaglio per ciascun campione. Calcolare il ΔΔCq sottraendo il ΔCq di un campione di controllo dal ΔCq di ciascun campione sperimentale. Infine, calcolare il valore 2−ΔΔCq elevando 2 alla potenza del valore ΔΔCq. NOTA: Il valore Cq rappresenta il numero di ciclo in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia impostata.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Analisi Western blot
<ol><li>Seme 1,2 × 106 cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.</li>
	<li>Raccogliere le cellule in coltura e lavarle con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per rimuovere eventuali residui di terreno di crescita o siero. Lisare le cellule utilizzando il tampone di lisi RIPA contenente fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) per rilasciare le proteine cellulari. Incubare le cellule su ghiaccio per alcuni minuti per garantire una lisi completa e centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 15 min. Raccogliere il surnatante per determinarne la concentrazione proteica.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica nel lisato cellulare utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore. Miscelare il lisato cellulare con un tampone di carico e riscaldare la miscela a 95-100 °C per 5-10 minuti per denaturare le proteine e garantire una separazione uniforme sul gel.</li>
	<li>Da ciascun campione, caricare 30 μg di proteina totale su un gel SDS-PAGE e far funzionare l'SDS-PAGE a una tensione costante di 80 V. Interrompere l'elettroforesi quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel di separazione.</li>
	<li>Trasferire le proteine separate dal gel su una membrana di polivinildifluoruro utilizzando un sistema di trasferimento a umido su un bagno di ghiaccio con una corrente di 200 mA per 1,5 h.</li>
	<li>Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris con tampone Tween-20 allo 0,05% (TBST) per 1 ora a RT e incubare per una notte a 4 °C con i rispettivi anticorpi indicati nella tabella dei materiali.</li>
	<li>Lavare la membrana più volte con TBST e incubare con gli anticorpi secondari (Tabella dei materiali) per 1 ora a RT, seguita dal lavaggio con TBST. Visualizza le bande proteiche utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza avanzato e un sistema imager.</li>
</ol>12. Analisi statistica
<ol><li>Poiché tutti i dati sperimentali saranno indipendenti, presentare i dati come media ± DS. Eseguire un'analisi statistica.</li>
	<li>Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per confronti multipli e il test di Dunnett per confrontare ciascun gruppo con il gruppo di controllo. Utilizzare il test t di Student (a due code non accoppiato) per confrontare due gruppi; considerare significativo P < 0,05.</li>
</ol>

Convalida di FAM83A come gene bersaglio nel carcinoma cervicale

<ol>
	<li>Arbyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+incidence+and+mortality+of+cervical+cancer+in+2018:+a+worldwide+analysis.">Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis.</a> Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).</li><li>Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+cancer.">Cervical cancer.</a> Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).</li><li>Cipriano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+oncogenic+behavior+of+the+fam83+family+regulates+mapk+signaling+in+human+cancer.">Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer.</a> Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).</li><li>Snijders, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAM83+family+oncogenes+are+broadly+involved+in+human+cancers:+an+integrative+multi-omics+approach.">FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach.</a> Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).</li><li>Gan, J., Meng, Q., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corrigendum:+systematic+analysis+of+expression+profiles+and+prognostic+significance+for+fam83+family+in+non-small-cell+lung+cancer.">Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer.</a> Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).</li><li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+expression,+prognostic+significance,+and+function+of+fam83+family+members+in+breast+cancer.">Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer.</a> World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prognostic+biomarkers+among+fam83+family+genes+in+human+ovarian+cancer+through+bioinformatic+analysis+and+experimental+verification.">Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification.</a> Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+prognostic+and+therapeutic+biomarkers+among+fam83+family+members+for+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+cervical+RNA-binding+proteins+identifies+human+papillomavirus+regulation+of+rnaseh2a+expression+by+viral+e7+and+e2f1.">Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1.</a> mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).</li><li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer:+from+pathogenesis+to+treatment.">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal Of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).</li><li>Bonora, M., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+cancer:+molecular+mechanisms+involved+in+cell+death.">The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death.</a> Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).</li><li>Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALAT1+promotes+cisplatin+resistance+in+cervical+cancer+by+activating+the+pi3k/akt+pathway.">MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).</li><li>Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphatidylinositol+3-kinase+(pi3k)-akt+pathway+suppresses+bax+translocation+to+mitochondria.">The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria.</a> Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).</li><li>Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+cancer+chemoresistance.">Mitochondria and cancer chemoresistance.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).</li><li>Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+mitochondria+in+cancer:+current+concepts+and+immunotherapy+approaches.">Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches.</a> Translational Research. 202, 35-51 (2018).</li></ol>

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l'identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l'uso dell'analisi d...

Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne1. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli2. Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero e identificare potenziali bersagli terapeutici per la prevenzione e il trattamento di questa malattia.
L'identificazione dei geni bersaglio coinvolti nella progressione del cancro e la ricerca di modi per inibirne l'espressione o l'azione presentano opzioni terapeutiche promettenti. In questo studio, abbiamo identificato FAM83 come gene cancerogeno e abbiamo ulteriormente studiato i suoi effetti inibitori sulle cellule C33a e HeLa. Gli oncogeni della famiglia FAM83 (FAM83A-H) sono ampiamente riportati nei tumori umani 3,4. Recentemente, FAM83A è stato segnalato per essere upregolato nei tumori del polmone5, della mammella6, dell'ovaio7 e del pancreas8, indicando che FAM83A svolge un ruolo importante nella progressione del cancro attraverso la promozione della proliferazione, dell'invasione, dei tratti simili alle cellule staminali e della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali. È importante sottolineare che FAM83A è stato identificato come uno dei nuovi geni candidati associati alla progressione della lesione cervicale e alla carcinogenesi9. Nonostante la conferma di un'elevata espressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali umane, l'impatto specifico e i meccanismi sottostanti di FAM83A nel cancro cervicale rimangono poco chiari.
In questo studio, delineiamo i protocolli coinvolti nell'identificazione di FAM83A come gene bersaglio del tumore nel cancro cervicale e utilizziamo un piccolo RNA interferente (siRNA) per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . La colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) è stata eseguita per determinare gli effetti sulla proliferazione delle cellule tumorali, mentre la guarigione delle ferite e i saggi di inserimento della membrana porosa hanno contribuito a valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.
Il Western blotting è stato eseguito per determinare i livelli di proteine correlate all'apoptosi e la colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Pertanto, abbiamo riferito che FAM83A svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, nelle metastasi e nell'invasione nel cancro cervicale. Attraverso la disfunzione mitocondriale e l'apoptosi associate alla via PI3K/AKT, il knockdown di FAM83A ha sensibilizzato le cellule tumorali cervicali al cisplatino (diamminesdicloroplatino, DDP). Questo studio fornisce un nuovo bersaglio per il cancro cervicale e possibilmente altri tumori e un riferimento per lo sviluppo di strategie per superare la resistenza delle cellule tumorali a determinati farmaci chemioterapici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td colspan="4" >Cells and Medium Formulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C33a</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hela</td>
			<td >American Type Culture Collection</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Modified medium</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibody Information</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AKT</td>
			<td >4691, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bcl2&#160;</td>
			<td >26593-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caspase 3</td>
			<td >19677-1-AP, Proteintech Group, Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cleaved-caspase3</td>
			<td >abs132005; Absin Bioscience Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cytc</td>
			<td >10993-1-AP; Proteintech Group</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GAPDH&#160;</td>
			<td >10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:8,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mTOR</td>
			<td >2983, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI3K</td>
			<td >4292, Cell Signaling Technology Inc</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-AKT&#160;</td>
			<td >4060, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-mTOR (Ser2448)</td>
			<td >#5536, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p-PI3K p85 subunit</td>
			<td >17366, Cell Signaling Technology Inc.</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:1,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Secondary antibodies</td>
			<td >GB23303, Servicebio</td>
			<td ></td>
			<td >&#8216;1:2,000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Materials</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plate</td>
			<td >Corning, NPY</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555</td>
			<td >Beyotime</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China&#160;</td>
			<td ></td>
			<td >P0011</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ChemiDoc XRS Imager System&#160;</td>
			<td >BioRad</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enhanced chemiluminescence detection kit&#160;</td>
			<td >Servicebio, Inc.,China</td>
			<td ></td>
			<td >cat. no. G2014</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td >Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix&#160;</td>
			<td rowspan="2" >11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inverted microscope&#160;</td>
			<td >Olympus, Tokyo, Japan;</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Millicell transwell inserts&#160;</td>
			<td >Millipore,Bedford, MA, USA</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mitochondrial membrane potential assay kit&#160;</td>
			<td >Beyotime, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PMSF&#160;</td>
			<td >ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td >#ST506</td>
		</tr>
		<tr >
			<td rowspan="2" >Real-time quantitative PCR instrument&#160;</td>
			<td rowspan="2" >Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.</td>
			<td rowspan="2" ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPA Lysis Buffer&#160;</td>
			<td >Beyotime Biotech, Jiangsu, China</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td >15596026</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol reagent&#160;</td>
			<td >Takara Bio Inc., Otsu, Japan</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="2" >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Image-Pro</td>
			<td >&#160;plus 6.0&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

knockdown of fam83a to verify its role in cervical cancer cell growth and cisplatin sensitivity

L'esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell'identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l'espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.
Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all'apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l'intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.

Cervical cancer is a global concern as it is one of the leading types of gynecological malignancy worldwide and is the major cause of cancer-related mortality in women1. Radical surgery and chemoradiotherapy are associated with high cure rates at the primary stage. However, treatment outcomes for patients at the advanced stage of cervical cancer who develop metastatic disease are very unfavorable2. Therefore, it is crucial to further understand the biological mechanisms underlying the migration and invasion of cervical cancer cells and identify potential therapeutic targets for the prevention and treatment of this disease.
Identifying target genes involved in cancer progression and finding ways to inhibit their expression or action present promising treatment options. In this study, we identified FAM83 as a cancer-causing gene and further investigated its inhibitory effects on C33a and HeLa cells. FAM83 family oncogenes (FAM83A-H) are widely reported in human cancers3,4. Recently, FAM83A was reported to be upregulated in lung5, breast6, ovarian7, and pancreatic8 cancers,indicating that FAM83A plays an important role in cancer progression via promoting the proliferation, invasion, stem-cell-like traits, and drug resistance in the tumor cells. Importantly, FAM83A was identified as one of the novel candidate genes associated with cervical lesion progression and carcinogenesis9. Despite the confirmation of elevated FAM83A expression in human cervical cancer cells, the specific impact and underlying mechanisms of FAM83A in cervical cancer remain unclear.
In this study, we outline the protocols involved in the identification of FAM83A as a tumor target gene in cervical cancer and use a small interfering RNA (siRNA) for the knockdown of the FAM83A gene in HeLa and C33a cells. 5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) staining was performed to determine the effects on tumor cell proliferation, while wound healing and porous membrane insert assays helped evaluate tumor cell migration and invasion abilities.
Western blotting was performed to determine the levels of apoptosis-related proteins, and JC-1 staining was employed to evaluate mitochondrial function alterations. Thus, we reported that FAM83A plays a critical role in cell proliferation, metastasis, and invasion in cervical cancer. Through PI3K/AKT-pathway-associated mitochondrial dysfunction and apoptosis, FAM83A knockdown sensitized cervical cancer cells to cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP). This study provides a new target for cervical cancer and possibly other cancers and a reference for the development of strategies to overcome the resistance of cancer cells to certain chemotherapeutic drugs.

Autore in primo piano: Esplorare il ruolo di FAM83A nel cancro cervicale 

Knockdown di FAM83A per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino

The scope of our research as focus are investigating the role of FAM83A in cervical cancer growths and cisplatin sensitivity. By addressing this question, we hope to contribute to the scientific understanding of the cervical cancer biology and potentially identify real therapeutic targets for this disease. We found LA sentencing FAM83A expirations as a scientist, cervical cancer cells uses platin treatment.Enhancing the drug satisfies a factor, and inhibiting the cell viability and migration. Our laboratory will focus and foreign research question in the future illustrating the medical mechanisms of FAM83A of FAM83A in cervical cancer. FAM83A in cervical cancer.Developing FAM83A inhibitors or technicalities. Developing FAM83A inhibitors or technicalities. The therapies starting the correlation between FAM83A and the patient prognosis between FAM83A and the patient prognosis and investigating the role of FAM83A in and investigating the role of FAM83A and investigating the orle of FAM83A in other types of cancer.

Analisi del database TCGA e validazione PCR
Dall'analisi del database TCGA, abbiamo condotto un'analisi comparativa dei livelli di espressione dell'mRNA in 306 campioni di cellule di cancro cervicale e 13 campioni di cellule normali per studiare l'espressione differenziale di FAM83A. FAM83A è stato sovraregolato nel cancro cervicale, mentre la sua espressione nel tessuto cervicale normale era ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring the Role of FAM83A in Cervical Cancer at JoVE.com

Qui, mostriamo le procedure per l'abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.

The exploration of tumor target genes holds paramount importance for the prevention and treatment of cervical cancer. In this study, we outline the steps ...

L'obiettivo della nostra ricerca è quello di indagare il ruolo di FAM83A nella crescita del cancro cervicale e nella sensibilità al cisplatino. Rispondendo a questa domanda, speriamo di contribuire alla comprensione scientifica della biologia del cancro cervicale e potenzialmente identificare veri bersagli terapeutici per questa malattia. Abbiamo trovato LA condanna FAM83A scadenze come scienziato, le cellule tumorali cervicali utilizzano il trattamento con platino.Il miglioramento del farmaco soddisfa un fattore e inibisce la vitalità e la migrazione cellulare. Il nostro laboratorio si concentrerà su una domanda di ricerca estera in futuro illustrando i meccanismi medici di FAM83A o FAM83A nel cancro cervicale. FAM83A nel cancro cervicale.Sviluppo di inibitori o tecnicismi di FAM83A. Sviluppo di inibitori o tecnicismi di FAM83A. Le terapie iniziano la correlazione tra FAM83A e la prognosi del paziente tra FAM83A e la prognosi del paziente e studiano il ruolo di FAM83A e studiano il ruolo di FAM83A e studiano l'orle di FAM83A in altri tipi di cancro.

knockdown-fam83a-to-verify-its-role-cervical-cancer-cell-growth

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Knockdown of FAM83A to Verify Its Role in Cervical Cancer Cell Growth and Cisplatin Sensitivity

510 Views.  Yangtze University. L'obiettivo della nostra ricerca è quello di indagare il ruolo di FAM83A nella crescita del cancro cervicale e nella sensibilità al cisplatino. Rispondendo a questa domanda, speriamo di contribuire alla comprensione scientifica della biologia del cancro cervicale e potenzialmente identificare veri bersagli terapeutici per questa malattia. Abbiamo trovato LA condanna FAM83A scadenze come scienziato, le cellule tumorali cervicali utilizzano il trattamento con platino.Il miglioramento d...