使用活小鼠进行简化的股骨内注射允许连续骨髓分析

该技术旨在通过安全地将有价值的患者样本口内注射和移植到小鼠体内，然后抽吸骨髓，帮助我们更好地了解骨髓中正常造血和疾病的生物学特性。人们早就知道，将少量有价值的样本直接移植到小鼠的骨髓中，用于静脉注射进行的实验效率更高。但是，没有实际的技术视频，因此通常认为这是一种高门槛技术。

我们的方案能够轻松安全地将任何有价值的样品移植到具有少量细胞的小鼠中。对这项技术的需求很高，借助此视频，任何人都可以快速学习。我们希望每个人都能掌握这项技术，并为科学的进步做出重大贡献。

首先，使用 20 μL FACS 缓冲液或解冻培养基制备多达 300 万个样品细胞的细胞悬液。注射前将它们放在冰上。使用聚维酮碘或洗必泰磨砂膏和 70% 乙醇浸泡的纱布海绵，用三组交替的磨砂膏对包含股骨的腿部进行消毒。

用拇指和食指捏住股骨来稳定腿部。用无名指或无名指推动胫骨，以保持胫骨从股骨弯曲。确保正确定位以成功注射。

使用空的无菌 27G 针头的边缘啄股骨顶部的髌腱。为确保最佳插入点，请将带有连接注射器的 27G 针头插入髌腱正下方。将其牢固地放在股骨的两个髁之间，向外和向上旋转针头，使其与股骨干平行。

将针头绕圈旋转，同时将其推进股骨髓腔。插入针头，直到阻力明显降低。通过横向移动确认针头位置正确。

通过在骨髓腔内移动针头的同时将针柱塞向后拉来产生负压。检查注射器中的血液或骨髓，以确保针头在骨髓腔内。确保针头位置正确后，将其缓慢取出，并将含有注射器的细胞插入同一根部。

更换新针头时，记住第一次注射的根部和角度很重要。将细胞成功注射到股骨后，小心地取出针头和注射器，同时保持注射器上的压力。然后将鼠标从鼻锥中取出，放在干净的纸巾上，以防止吸入床上用品。

为了恢复，请将鼠标放在加热垫或其他受控表面上。确保从麻醉中恢复，然后再将它们放回鼠标架上。在接下来的 24 小时内观察小鼠是否有痛苦或感染的迹象。

首先在抽吸骨髓之前准备手术，通过填充和排出 CSM 两到三次，用 CSM 润湿 0.5 毫升 27G 注射器。然后轻轻地从麻醉的小鼠中吸出骨髓，产生 20 至 50 微升的骨髓。然后从股骨上完全取出针头，并将吸出的样品悬浮在 500 微升 CSM 中。

将鼠标从鼻锥中取出，放在干净的纸巾上，以防止在恢复过程中吸入被褥。在将小鼠放在鼠标架的背面之前，监测所有小鼠以验证麻醉恢复情况。从 骨髓 沉淀细胞，在 4 摄氏度下以 300G 旋转 5 分钟。

吸出上清液并向每个试管中加入 ACK 裂解缓冲液。涡旋细胞以重新悬浮它们，并将它们放在冰上 5 到 10 分钟。通过尼龙网将细胞悬液过滤到新管中。

用 FACS 缓冲液冲洗原管，使其通过尼龙网，在 4 摄氏度下以 300G 旋转 5 分钟再次沉淀细胞。从沉淀的细胞中吸出上清液，并加入含有所需抗体的染色溶液。将试管置于冰上 20 分钟。

洗涤细胞并按照实验设置继续分析它们。使用生物发光图像可以很容易地评估移植技术，只需将小鼠侵袭降至最低。在这里，在注射股骨一侧的异种移植小鼠模型中观察到带有 Acalook 的人源 K562 细胞系的移植。

CD34 阳性 HSPC 的移植导致移植后 8 周超过 10% 至 20% 的人类细胞植入。同样，移植脐带血来源的 HSC 在移植后 8 周导致高达 10% 的人植入。使用该程序进一步成功移植了成人骨髓来源的 HSPC、白血病干细胞、CRISPR Cas9 编辑的脐带血来源的 HSPC 和患者来源的 AML iPSC。