Этот метод призван помочь нам лучше понять биологию нормального кроветворения и заболевания в костном мозге путем безопасного введения и трансплантации ценных образцов пациента мышам внутриорально с последующей аспирацией костного мозга. Давно известно, что более эффективно пересаживать небольшое количество ценных образцов непосредственно в костный мозг мышей для экспериментов, проводимых путем внутривенного введения. Тем не менее, нет никаких реальных технических видео, поэтому обычно считалось, что это техника с высоким барьером.
Наш протокол позволяет легко и безопасно приживить мышь любой ценный образец с помощью небольшого количества клеток. Существует высокий спрос на эту технологию, и с помощью этого видео любой желающий сможет быстро ее освоить. Мы надеемся, что каждый сможет освоить эту технологию и внести существенный вклад в развитие науки.
Для начала приготовьте клеточные суспензии с использованием до 3 миллионов образцов клеток с использованием 20 микролитров буфера FACS или размораживаемой среды. Держите их на льду перед инъекцией. Продезинфицируйте ногу, содержащую бедренную кость, с помощью трех наборов чередующихся скрабов с использованием скраба с повидон-йодом или хлоргексидином и марлевых губок, пропитанных на 70% этанолом.
Стабилизируйте ногу, зажав бедренную кость большим и указательным пальцами. Надавите на большеберцовую кость безымянным или пятым пальцем, чтобы большеберцовая кость была согнута от бедренной кости. Обеспечьте правильное положение для успешной инъекции.
Используйте край пустой стерильной иглы 27G, чтобы проклевать сухожилие надколенника на верхней части бедренной кости. Чтобы обеспечить наилучшую точку введения, введите иглу 27G с прикрепленным шприцем прямо под сухожилие надколенника. Надежно засунув его между двумя мыщелками бедренной кости, поверните иглу наружу и вверх, чтобы выровнять ее параллельно стержню бедренной кости.
Вращайте иглу по кругу, продвигая ее в полость бедренного мозга. Вводите иглу до тех пор, пока не произойдет заметное снижение сопротивления. Подтвердите правильное положение иглы боковым движением.
Создайте отрицательное давление, оттягивая поршень иглы назад, перемещая иглу в полость костного мозга. Проверьте наличие крови или костного мозга в шприце, чтобы убедиться, что игла находится в полости костного мозга. Убедившись в правильном размещении иглы, медленно извлеките ее и вставьте ячейку со шприцем через тот же корень.
Важно помнить о корне и угле первого укола при переходе на новую иглу. После того, как клетки будут успешно введены в бедренную кость, осторожно извлеките иглу и шприц, поддерживая давление на шприц. Затем снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки.
Для восстановления держите мышь на грелке или другой контролируемой поверхности. Обеспечьте восстановление после анестезии, прежде чем положить их обратно на стойку для мышей. Наблюдайте за мышами на предмет признаков дистресса или инфекции в течение следующих 24 часов.
Начните с подготовки к процедуре перед аспирацией костного мозга, смочите 0,5 миллилитровый шприц 27G с CSM, заполнив и вытеснив CSM два-три раза. Затем осторожно отсасывайте костный мозг от мыши, находящейся под наркозом, с получением от 20 до 50 микролитров костного мозга. Затем полностью извлеките иглу из бедренной кости и суспензируйте аспирированный образец в 500 микролитрах CSM.
Снимите мышь с носового конуса и положите ее на чистое бумажное полотенце, чтобы предотвратить аспирацию подстилки во время восстановления. Наблюдайте за всеми мышами, чтобы убедиться в восстановлении после анестезии, прежде чем помещать их на заднюю часть стойки для мышей. Пеллеты клеток из костного мозга с пятиминутным вращением при 300G при четырех градусах Цельсия.
Отсадите надосадочную жидкость и добавьте буфер для лизиса ACK в каждую пробирку. Сделайте ячейки вихревыми для их суспензии и поместите их на лед на 5-10 минут. Отфильтруйте клеточную суспензию через капроновую сетку в новую пробирку.
Промойте исходный тюбик буфером FACS и пропустите его через нейлоновую сетку, снова грануляционные ячейки, вращая в течение пяти минут при 300G при четырех градусах Цельсия. Отсадите надосадочную жидкость из гранулированных клеток и добавьте окрашивающий раствор, содержащий нужные антитела. Держите трубочки на льду в течение 20 минут.
Промойте клетки и приступайте к их анализу в соответствии с экспериментальной установкой. Методы трансплантации могут быть легко оценены с минимальной инвазией мышей с помощью биолюминесцентного изображения. В данном случае трансплантация клеточной линии K562 человеческого происхождения с помощью Acalook наблюдалась в мышиной модели ксенотрансплантата на стороне инъецированной бедренной кости.
Трансплантация CD34-положительных HSPC привела к приживлению более 10-20% клеток человека через восемь недель после трансплантации. Аналогичным образом, трансплантация ГСК, полученных из пуповинной крови, привела к приживлению до 10% человека через восемь недель после трансплантации. С помощью этой процедуры была достигнута дальнейшая успешная трансплантация ГСКХ, полученных из костного мозга взрослого человека, стволовых клеток лейкемии, CRISPR Cas9, полученных из пуповинной крови, и ОМЛ, полученных от пациента.
