Diese Technik soll uns helfen, die Biologie der normalen Hämatopoese und Krankheit im Knochenmark besser zu verstehen, indem wertvolle Patientenproben sicher intraoral in die Mäuse injiziert und transplantiert werden, gefolgt von der Aspiration des Knochenmarks. Es ist seit langem bekannt, dass es effizienter ist, kleine Mengen wertvoller Proben direkt in das Knochenmark von Mäusen zu transplantieren, um Experimente durchzuführen, die durch intravenöse Injektion durchgeführt werden. Es gibt jedoch keine eigentlichen technischen Videos, so dass es allgemein als Hochhürdentechnik galt.
Unser Protokoll ermöglicht es, jede wertvolle Probe mit einer kleinen Anzahl von Zellen einfach und sicher in die Maus zu transplantieren. Es gibt eine hohe Nachfrage nach dieser Technologie, und mit Hilfe dieses Videos kann jeder sie schnell erlernen. Wir hoffen, dass jeder diese Technologie beherrschen und wesentlich zum Fortschritt der Wissenschaft beitragen kann.
Zu Beginn bereiten Sie Zellsuspensionen mit bis zu 3 Millionen Probenzellen unter Verwendung von 20 Mikrolitern FACS-Puffer oder Auftaumedium vor. Bewahren Sie diese vor der Injektion auf Eis auf. Desinfizieren Sie das Bein mit dem zu injizierenden Oberschenkelknochen mit drei abwechselnden Peelings mit einem Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peeling und 70 % Ethanol-getränkten Mullschwämmen.
Stabilisieren Sie das Bein, indem Sie den Oberschenkelknochen mit Daumen und Zeigefinger einklemmen. Drücke das Schienbein entweder mit dem Ring oder dem fünften Finger, um das Schienbein vom Oberschenkelknochen weg gebogen zu halten. Stellen Sie sicher, dass die richtige Positionierung für eine erfolgreiche Injektion gewährleistet ist.
Verwende die Kante einer leeren sterilen 27G-Nadel, um die Patellasehne auf den Oberschenkelknochen zu picken. Um den besten Einführpunkt zu gewährleisten, führen Sie die 27G-Nadel mit einer aufgesetzten Spritze direkt unter der Patellasehne ein. Platzieren Sie sie sicher zwischen den beiden Kondylen des Oberschenkelknochens und schwenken Sie die Nadel nach außen und oben, um sie parallel zum Oberschenkelschaft auszurichten.
Drehen Sie die Nadel im Kreis, während Sie sie in die Oberschenkelmarkhöhle schieben. Führen Sie die Nadel so lange ein, bis der Widerstand merklich nachlässt. Bestätigen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch seitliche Bewegung.
Erzeugen Sie Unterdruck, indem Sie den Nadelkolben zurückziehen, während Sie die Nadel in der Knochenmarkhöhle bewegen. Überprüfen Sie, ob sich die Spritze auf Blut oder Knochenmark befindet, um sicherzustellen, dass sich die Nadel in der Knochenmarkhöhle befindet. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Nadel richtig platziert ist, entfernen Sie sie langsam und führen Sie die Spritze mit der Zelle durch dieselbe Wurzel ein.
Es ist wichtig, sich bei der Umstellung auf eine neue Nadel an die Wurzel und den Winkel der ersten Injektion zu erinnern. Sobald die Zellen erfolgreich in den Oberschenkelknochen injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und die Spritze und halten Sie den Druck auf die Spritze aufrecht. Nehmen Sie dann die Maus aus dem Nasenkonus und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen von Einstreu zu verhindern.
Bewahren Sie die Maus zur Wiederherstellung auf einem Heizkissen oder einer anderen kontrollierten Oberfläche auf. Stellen Sie sicher, dass Sie sich von der Narkose erholen, bevor Sie sie wieder auf das Mausgestell legen. Beobachten Sie Mäuse in den nächsten 24 Stunden auf Anzeichen von Stress oder Infektionen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung auf den Eingriff, bevor Sie das Knochenmark aspirieren, befeuchten Sie eine 0,5-Milliliter-27G-Spritze mit CSM, indem Sie CSM zwei- bis dreimal füllen und ausstoßen. Aspirieren Sie dann vorsichtig das Knochenmark aus der anästhesierten Maus, wodurch 20 bis 50 Mikroliter Knochenmark gewonnen werden. Entfernen Sie dann die Nadel vollständig aus dem Oberschenkelknochen und suspendieren Sie die aspirierte Probe in 500 Mikrolitern CSM.
Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen der Einstreu während der Genesung zu verhindern. Überwachen Sie alle Mäuse, um die Genesung von der Anästhesie zu überprüfen, bevor Sie sie auf die Rückseite des Mausracks legen. Pelletzellen aus dem Knochenmark mit einer fünfminütigen Drehung bei 300 G bei vier Grad Celsius.
Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie jedem Röhrchen ACK-Lysepuffer hinzu. Wirbeln Sie die Zellen zur Resuspendierung vor und legen Sie sie für 5 bis 10 Minuten auf Eis. Filtern Sie die Zellsuspension durch das Nylonnetz in einen neuen Schlauch.
Spülen Sie das Originalrohr mit FACS-Puffer und führen Sie es durch das Nylonnetz, die Pelletzellen erneut, indem Sie es fünf Minuten lang bei 300 G bei vier Grad Celsius drehen. Aspirieren Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und fügen Sie die Färbelösung mit den gewünschten Antikörpern hinzu. Lassen Sie die Röhren 20 Minuten lang auf Eis.
Waschen Sie die Zellen und fahren Sie mit der Analyse gemäß dem Versuchsaufbau fort. Transplantationstechniken können mit minimaler Mausinvasion anhand eines Biolumineszenzbildes leicht und bewertet werden. Hier wurde die Transplantation einer humanen K562-Zelllinie mit Acalook in einem Xenotransplantat-Mausmodell an der Seite des injizierten Femurs beobachtet.
Die Transplantation von CD34-positiven HSPCs führte acht Wochen nach der Transplantation zu mehr als 10 bis 20 % der humanen Zelltransplantationen. In ähnlicher Weise führte die Transplantation von aus Nabelschnurblut gewonnenen HSCs acht Wochen nach der Transplantation zu einer Transplantation von bis zu 10 % beim Menschen. Mit diesem Verfahren wurde eine weitere erfolgreiche Transplantation von adulten HSPCs aus dem Knochenmark, Leukämie-Stammzellen, CRISPR Cas9-editierten HSPCs aus Nabelschnurblut und von Patienten stammenden AML-iPSCs erreicht.
