Questa tecnica ha lo scopo di aiutarci a comprendere meglio la biologia della normale emopoiesi e della malattia nel midollo osseo iniettando e trapiantando in modo sicuro campioni di pazienti preziosi nei topi per via intraorale, seguiti dall'aspirazione del midollo osseo. È noto da tempo che è più efficiente trapiantare piccole quantità di campioni preziosi direttamente nel midollo osseo dei topi per esperimenti eseguiti mediante iniezione endovenosa. Tuttavia, non ci sono video tecnici veri e propri, quindi era generalmente considerata una tecnica ad alto ostacolo.
Il nostro protocollo consente di innestare facilmente e in sicurezza qualsiasi campione prezioso nel topo con un numero ridotto di cellule. C'è una forte domanda per questa tecnologia e, con l'aiuto di questo video, chiunque può impararla rapidamente. Ci auguriamo che tutti possano padroneggiare questa tecnologia e contribuire in modo significativo al progresso della scienza.
Per iniziare, preparare le sospensioni cellulari con un massimo di 3 milioni di cellule campione utilizzando 20 microlitri di tampone FACS o terreno di scongelamento. Tenerli sul ghiaccio prima dell'iniezione. Disinfettare la gamba contenente il femore da iniettare con tre serie di scrub alternati utilizzando uno scrub allo iodio povidone o alla clorexidina e spugne di garza imbevute di etanolo al 70%.
Stabilizzare la gamba pizzicando il femore con il pollice e l'indice. Spingi la tibia con l'anulare o il quinto dito per mantenere la tibia piegata dal femore. Assicurarsi che il posizionamento sia corretto per una corretta iniezione.
Usa il bordo di un ago sterile da 27 G vuoto per beccare il tendine rotuleo sopra il femore. Per garantire il miglior punto di inserimento, inserire l'ago 27G con una siringa attaccata appena sotto il tendine rotuleo. Alloggiandolo saldamente tra i due condili del femore, ruotare l'ago verso l'esterno e verso l'alto per allinearlo parallelamente all'asta del femore.
Ruotare l'ago in cerchio mentre lo si avanza nella cavità del midollo femorale. Inserire l'ago fino a quando non si verifica una notevole riduzione della resistenza. Confermare il corretto posizionamento dell'ago con un movimento laterale.
Creare una pressione negativa tirando indietro lo stantuffo dell'ago mentre si sposta l'ago all'interno della cavità del midollo osseo. Controllare la presenza di sangue o midollo nella siringa per assicurarsi che l'ago sia nella cavità del midollo osseo. Dopo essersi assicurati del corretto posizionamento dell'ago, rimuoverlo lentamente e inserire la cellula contenente la siringa attraverso la stessa radice.
È importante ricordare la radice e l'angolo della prima iniezione quando si passa a un nuovo ago. Una volta che le cellule sono state iniettate con successo nel femore, rimuovere con cautela l'ago e la siringa, mantenendo la pressione sulla siringa. Quindi rimuovere il mouse dal cono del naso e posizionarlo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto.
Per il recupero, tenere il mouse su un termoforo o su un'altra superficie controllata. Assicurarsi che si riprenda dall'anestesia prima di rimetterli sul supporto per mouse. Osserva i topi per segni di angoscia o infezione nelle prossime 24 ore.
Inizia preparandoti per la procedura prima di aspirare il midollo osseo, bagna una siringa da 0,5 millilitri da 27 G con CSM riempiendo ed espellendo CSM due o tre volte. Quindi aspirare delicatamente il midollo osseo dal topo anestetizzato, producendo da 20 a 50 microlitri di midollo osseo. Quindi rimuovere completamente l'ago dal femore e sospendere il campione aspirato in 500 microlitri di CSM.
Rimuovi il mouse dal cono del naso e posizionalo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto durante il recupero. Monitora tutti i mouse per verificare il recupero dall'anestesia prima di posizionarli sul retro del supporto per mouse. Pellet di cellule dal midollo osseo con una centrifuga di cinque minuti a 300G a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e aggiungere il tampone di lisi ACK a ciascuna provetta. Agitare le cellule per risospenderle e metterle sul ghiaccio per 5-10 minuti. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon in un nuovo tubo.
Sciacquare il tubo originale con il tampone FACS e passarlo nuovamente attraverso la rete di nylon, le celle del pellet centrifugando per cinque minuti a 300 G a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante dalle celle pellettate e aggiungere la soluzione colorante contenente gli anticorpi desiderati. Tenere i tubi sul ghiaccio per 20 minuti.
Lavare le cellule e procedere ad analizzarle secondo la configurazione sperimentale. Le tecniche di trapianto possono essere facilmente valutate con un'invasione minima di topi utilizzando un'immagine a bioluminescenza. Qui è stato osservato il trapianto di una linea cellulare K562 di derivazione umana con Acalook in un modello murino xenotrapianto sul lato del femore iniettato.
Il trapianto di HSPC CD34 positivi ha comportato oltre il 10-20% dell'attecchimento di cellule umane a otto settimane dal trapianto. Allo stesso modo, il trapianto di HSC derivate dal sangue del cordone ombelicale ha portato a un attecchimento umano fino al 10% a otto settimane dopo il trapianto. Utilizzando questa procedura è stato ottenuto un ulteriore trapianto di HSPC derivati da midollo osseo adulto, cellule staminali leucemiche, HSPC derivate da sangue cordonale modificate CRISPR Cas9 e iPSC AML derivate da pazienti.
