Esta técnica destina-se a nos ajudar a entender melhor a biologia da hematopoiese normal e da doença na medula óssea, injetando e transplantando com segurança amostras valiosas de pacientes nos camundongos por via intraoral, seguida de aspiração da medula óssea. Há muito se sabe que é mais eficiente transplantar pequenas quantidades de amostras valiosas diretamente para a medula óssea de camundongos para experimentos feitos por injeção intravenosa. No entanto, não há vídeos técnicos reais, por isso geralmente era considerada uma técnica de alto obstáculo.
Nosso protocolo permite que qualquer amostra valiosa seja enxertada com facilidade e segurança no camundongo com um pequeno número de células. Há uma alta demanda por essa tecnologia e, com a ajuda deste vídeo, qualquer pessoa pode aprendê-la rapidamente. Esperamos que todos possam dominar essa tecnologia e contribuir significativamente para o avanço da ciência.
Para começar, prepare suspensões celulares com até 3 milhões de células de amostra usando 20 microlitros de tampão FACS ou meio de descongelamento. Mantenha-os no gelo antes da injeção. Desinfete a perna que contém o fêmur a ser injetado com três conjuntos de esfoliantes alternados usando um esfoliante de iodopovidona ou clorexidina e esponjas de gaze embebidas em etanol a 70%.
Estabilize a perna beliscando o fêmur com o polegar e o indicador. Empurre a tíbia com o dedo anelar ou o quinto dedo para manter a tíbia dobrada em relação ao fêmur. Garanta o posicionamento adequado para uma injeção bem-sucedida.
Use a ponta de uma agulha 27G estéril vazia para bicar o tendão patelar no topo do fêmur. Para garantir o melhor ponto de inserção, insira a agulha 27G com uma seringa acoplada logo abaixo do tendão patelar. Alojando-o com segurança entre os dois côndilos do fêmur, gire a agulha para fora e para cima para alinhá-la paralelamente à diáfise do fêmur.
Gire a agulha em círculos enquanto a avança para a cavidade da medula femoral. Insira a agulha até que haja uma redução perceptível na resistência. Confirme o posicionamento correto da agulha por movimento lateral.
Crie pressão negativa puxando o êmbolo da agulha para trás enquanto move a agulha dentro da cavidade da medula óssea. Verifique se há sangue ou medula na seringa para garantir que a agulha esteja na cavidade da medula óssea. Depois de garantir a colocação correta da agulha, remova-a lentamente e insira a célula contendo a seringa pela mesma raiz.
É importante lembrar a raiz e o ângulo da primeira injeção ao mudar para uma nova agulha. Assim que as células forem injetadas com sucesso no fêmur, remova cuidadosamente a agulha e a seringa, mantendo a pressão na seringa. Em seguida, remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da roupa de cama.
Para recuperação, mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ou outra superfície controlada. Garanta a recuperação da anestesia antes de colocá-los de volta no suporte do mouse. Observe os ratos em busca de sinais de angústia ou infecção nas próximas 24 horas.
Comece se preparando para o procedimento antes de aspirar a medula óssea, molhe uma seringa 27G de 0,5 mililitro com CSM enchendo e expelindo CSM duas a três vezes. Em seguida, aspire suavemente a medula óssea do camundongo anestesiado, produzindo 20 a 50 microlitros de medula óssea. Em seguida, remova totalmente a agulha do fêmur e suspenda a amostra aspirada em 500 microlitros de CSM.
Remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da cama durante a recuperação. Monitore todos os camundongos para verificar a recuperação da anestesia antes de colocá-los na parte de trás do rack do mouse. Células pellets da medula óssea com um giro de cinco minutos a 300G a quatro graus Celsius.
Aspire o sobrenadante e adicione tampão de lise ACK a cada tubo. Vortex as células para ressuspendê-las e coloque-as no gelo por 5 a 10 minutos. Filtre a suspensão celular através de malha de nylon em um novo tubo.
Enxágue o tubo original com tampão FACS e passe-o pela malha de náilon, pellet células novamente girando por cinco minutos a 300G a quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante das células peletizadas e adicionar a solução de coloração contendo os anticorpos desejados. Mantenha os tubos no gelo por 20 minutos.
Lave as células e prossiga para analisá-las de acordo com a configuração experimental. As técnicas de transplante podem ser facilmente avaliadas com invasão mínima de camundongos usando uma imagem de bioluminescência. Aqui, o transplante de uma linhagem celular K562 derivada humana com Acalook foi observado em um modelo de camundongo xenoenxerto no lado do fêmur injetado.
O transplante de HSPCs CD34 positivos resultou em mais de 10 a 20% do enxerto de células humanas oito semanas após o transplante. Da mesma forma, o transplante de HSCs derivados do sangue do cordão umbilical resultou em até 10% de enxerto humano oito semanas após o transplante. O transplante bem-sucedido adicional de HSPCs derivados da medula óssea adulta, células-tronco de leucemia, HSPCs derivados do sangue do cordão umbilical editados por CRISPR Cas9 e iPSCs de LMA derivados de pacientes foi alcançado usando este procedimento.
