我们的研究重点是由一种免疫细胞产生的小囊泡，这些小囊泡天然可有效杀死癌细胞。这些囊泡在治疗原发性和继发性部位（如大脑）的实体瘤方面具有广阔的治疗潜力。在本研究中，我们使用双峰树脂通过尺寸排阻色谱分离囊泡，通过物理分离囊泡与污染物来最大限度地提高产品纯度，同时通过静电力进一步将污染物捕获在树脂内。
然后，我们在使用前对囊泡进行消毒、浓缩和缓冲交换本视频中的生物制造工作流程使用临床相关条件，并且可以根据成本进行扩展，从而有效地生产大量高纯度细胞外囊泡。这使得学术实验室能够使用该技术，自信地投入资源，通过可靠的生产和分离过程研究此类疗法。我们目前正在研究这些囊泡和临床前模型的治疗潜力，并进一步加强我们对它们工作原理的理解。
首先，根据制造商的说明进行快速蛋白质液相色谱系统启动。使用滴滴法进行连接，以确保塔内没有空气引入。使用适当的收集管设置馏分收集器以收集样品。
将分馏设置更改为所需的收集体积。从 80 摄氏度冰箱中取出 40 至 80 毫升先前制备的细胞外囊泡或富含 EV 的条件培养基，并在 37 摄氏度下快速解冻。将样品在 4 摄氏度下以 10， 000 G 离心 30 分钟，然后将上清液转移到新试管中。
为了降低双链 DNA 水平，用 5 毫摩尔氯化镁和 50 单位/毫升核酸内切酶处理富含 EV 的条件培养基。将样品在 37 摄氏度下孵育 2 至 4 小时，并适度混合。层析系统准备就绪后，将富含 EV 的调节培养基装入 60 毫升注射器中，并将其连接到样品管线。
单击 Manual Run 启动系统并将流速设置为零。按照软件提示抢先保存运行。然后单击 Start。
选择 Line Beat 双滤 PBS，以每分钟 2 mL 的流速运行，确保溶液流经色谱柱。吸收剂稳定后，按 Auto Zero UV。更改流路，将样品引导至色谱柱前的废液瓶。5 到 20 秒后，将样品对准色谱柱。
当 UV 读数达到大约 230 毫吸光度单位时，单击 Fractionation（分馏）。样品完全进样后，将缓冲系统切换到双滤 PBS 以继续纯化。当 UV 值达到大约 1， 600 毫吸光度单位时，再次单击 Fractionation（分馏）。
运行停止后，将色谱图另存为 PDF 文档。用 20 至 30 毫升 90% 乙醇冲洗超滤仪的每个组件。以 4， 000 G 离心 5 到 10 分钟，然后丢弃流出物。
然后用无菌 PBS 进行冲洗以平衡设备并像以前一样重复离心步骤。混合所有稀释的 NK-EV 组分。为了最大限度地提高无菌性，使用 0.22 微米针式过滤器过滤稀释的 NK-EV 溶液，用双重过滤的 PBS 预湿。
将滤液收集到灭菌的浓缩装置中。将滤液以 4， 000 G 离心 15 至 40 分钟。旋转后，使用血清移液管在顶部过滤室内混合溶液。
再次以 4， 000 G 离心 10 分钟。倒置过滤装置并将其连接到收集装置以收集 NK-EV。将 NK-EV 以 2， 000 G 离心 2 分钟，然后将纯化产物转移到无菌管中。
根据制造商的说明启动纳米粒子跟踪分析系统。观察流通池是否有气泡。如果存在气泡，请用 20% 乙醇和双重过滤水冲洗流通池以将其去除。
清除后，小心地将激光模块重新插入纳米粒子跟踪分析仪器中。关上门，然后单击 Start Camera。将捕捉设置更改为 2 的屏幕增益和 14 的摄像机级别。
打开加热器以稳定流通池的温度。单击 Standard Measurement（标准测量）在 SOP 选项卡下创建一个脚本，用于在 23 摄氏度下以 30 的流速在一分钟内收集一次捕获。将文件夹和文件名添加到路径名称中以保存数据。
涡旋纯化的 NK-EV 产物，并使用双过滤 PBS 制备其稀释液。涡旋稀释的样品后，将其加载到 1 mL 采集注射器中，不要引入气泡。小心地将注射器连接到仪器加载线。
缓慢推动一半的样品，在注射器中留下大约 0.5 毫升。一旦粒子在屏幕上可见，聚焦相机以在每个粒子周围最多有一个光晕，在“硬件”选项卡下，单击“注入”并将速率设置为 1， 000，持续五秒钟。然后将速率降低到 30。
按 Run Script。确保设置正确后，单击 有 并按照软件提示进行作。完成捕获后，单击 取消 当软件要求处理或导出文件时。
每次稀释记录 5 次捕获后，导入所有 5 次捕获进行分析。突出显示文件，然后单击 Process Selected Files（处理所选文件）。在 Process 选项卡下，将分析设置调整为 Screen Gain （屏幕增益） 为 2，检测阈值为 15。
检查并单击 OK 进行分析。处理后，单击 Yes （是） 而不单击其他框，或单击 Export 导出文件。纯化的 NK-EV 粒径范围为 76.30 至 174.30 纳米，平均浓度为 1.39 乘以 10 至每毫升 12 EV 的幂。
此外，荧光计定量显示蛋白质浓度约为 300 毫克/毫升，双链 DNA 浓度为 225 毫克/毫升。用 NK-EV 处理人 K562 白血病细胞显示细胞活力呈剂量依赖性降低，EC 50 为 9.33 乘以 10，是每毫升 9 个 EV 的幂。
