يركز بحثنا على الحويصلات الصغيرة التي ينتجها نوع من الخلايا المناعية الفعالة بشكل طبيعي في قتل الخلايا السرطانية. تحمل هذه الحويصلات إمكانات علاجية واعدة لعلاج الأورام الصلبة ، في كل من المواقع الأولية والثانوية مثل الدماغ. في هذه الدراسة ، نستخدم راتينجا ثنائي النمط لعزل الحويصلات عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، مما يزيد من نقاء المنتج عن طريق فصل الحويصلات جسديا عن الملوثات مع زيادة حبس الملوثات داخل الراتنج من خلال القوى الكهروستاتيكية.
ثم نقوم بتعقيم الحويصلات وتركيزها وتبادلها قبل الاستخدام تستخدم تفاصيل سير عمل التصنيع الحيوي في هذا الفيديو ظروفا ذات صلة سريريا وقابلة للتطوير من حيث التكلفة ، مما ينتج بشكل فعال كميات كبيرة من الحويصلات خارج الخلية عالية النقاء. هذا يجعل هذه التقنية في متناول المختبرات الأكاديمية لاستثمار الموارد بثقة في دراسة مثل هذه العلاجات من خلال عملية إنتاج وعزل موثوقة. نحن ندرس حاليا الإمكانات العلاجية لهذه الحويصلات والنماذج قبل السريرية ونعزز فهمنا لكيفية عملها.
للبدء ، قم بإجراء بدء نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء التوصيلات باستخدام طريقة التنقيط إلى التنقيط لضمان عدم إدخال أي هواء داخل العمود. قم بإعداد مجمع الكسور باستخدام أنابيب التجميع المناسبة لجمع العينات.
قم بتغيير إعدادات التجزئة إلى وحدة تخزين المجموعة المطلوبة. قم بإزالة 40 إلى 80 مل من الحويصلة خارج الخلية المعدة مسبقا أو الوسائط المكيفة الغنية بالمركبات الكهربائية من الفريزر 80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج بسرعة عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينة عند 10،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
لتقليل مستويات الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل ، عالج الوسائط المكيفة الغنية بالمركبات الكهربائية بخمسة ملليمول من كلوريد المغنيسيوم و 50 وحدة لكل مليلتر من نوكلياز الإندونوكلياز. احتضان العينة لمدة ساعتين إلى أربع ساعات عند 37 درجة مئوية مع الخلط المعتدل. بمجرد أن يصبح نظام الكروماتوغرافيا جاهزا ، قم بتحميل الوسائط المكيفة الغنية بالمركبات الكهربائية في حقنة سعة 60 مليلتر وقم بتوصيلها بخط العينة.
انقر فوق التشغيل اليدوي لبدء تشغيل النظام وتعيين معدل التدفق إلى الصفر. اتبع مطالبات البرنامج لحفظ التشغيل بشكل استباقي. ثم انقر فوق ابدأ.
حدد Line Beat Double-Filtered PBS وقم بتشغيله بسرعة تدفق تبلغ ملليلترين في الدقيقة ، مما يضمن تشغيل المحلول عبر العمود. بمجرد استقرار المادة الماصة ، اضغط على Auto Zero UV. قم بتغيير مسار التدفق لتوجيه العينة إلى زجاجة النفايات قبل العمود. بعد خمس إلى 20 ثانية، قم بتوجيه العينة إلى العمود.
بمجرد أن تصل قراءات الأشعة فوق البنفسجية إلى حوالي 230 وحدة امتصاص ، انقر فوق التجزئة. عند الحقن الكامل للعينة ، قم بتبديل نظام المخزن المؤقت إلى Double-Filtered PBS لمواصلة التنقية. عندما تصل قيمة الأشعة فوق البنفسجية إلى حوالي 1 ، 600 وحدة امتصاص ، انقر مرة أخرى فوق التجزئة.
بمجرد توقف التشغيل ، احفظ الكروماتوجرام كمستند PDF. اشطف كل مكون من مكونات جهاز الترشيح الفائق ب 20 إلى 30 مل من 90٪ من الإيثانول. قم بالدوران عند 4,000 جم لمدة خمس إلى 10 دقائق وتخلص من التدفق من خلاله.
ثم قم بإجراء الشطف باستخدام PBS معقم لموازنة الجهاز وتكرار خطوات الطرد المركزي كما كان من قبل. اجمع بين جميع الكسور المخففة من NK-EVs. لزيادة العقم إلى أقصى حد، قم بتصفية محلول NK-EV المخفف باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر، مبلل مسبقا باستخدام PBS مزدوج التصفية.
اجمع المرشح في جهاز التركيز المعقم. قم بتدوير المرشح عند 4،000 جم لمدة 15 إلى 40 دقيقة. بعد الدوران ، امزج المحلول داخل حجرة الترشيح العلوية باستخدام ماصة مصلية.
مرة أخرى ، قم بالدوران في 4 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. اقلب جهاز الترشيح وقم بتوصيله بجهاز التجميع لتجميع NK-EV. قم بتدوير NK-EV عند 2,000 جم لمدة دقيقتين وانقل المنتج المنقى إلى أنبوب معقم.
ابدأ نظام تحليل تتبع الجسيمات النانوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. راقب خلية التدفق بحثا عن فقاعات الهواء. في حالة وجود فقاعة هواء ، قم بإزالتها عن طريق شطف خلية التدفق بنسبة 20٪ من الإيثانول والماء المزدوج المفلترة.
بمجرد أن تصبح واضحة ، أعد إدخال وحدة الليزر بعناية في أداة تحليل تتبع الجسيمات النانوية. أغلق الباب وانقر فوق بدء الكاميرا. قم بتغيير إعدادات الالتقاط إلى كسب شاشة اثنين ومستوى كاميرا 14.
قم بتشغيل السخان لتثبيت خلية التدفق في درجة الحرارة. انقر فوق القياس القياسي لإنشاء برنامج نصي ضمن علامة التبويب إجراءات التشغيل القياسية لجمع لقطة واحدة على مدار دقيقة واحدة بمعدل تدفق 30 عند 23 درجة مئوية. أضف المجلد واسم الملف إلى اسم المسار لحفظ البيانات.
قم بتدوير منتج NK-EV المنقى وإعداد تخفيفه باستخدام PBS مزدوج التصفية. بعد دوامة العينة المخففة ، قم بتحميلها في حقنة الاستحواذ سعة 1 مليلتر دون إدخال فقاعات هواء. قم بتوصيل المحقنة بعناية بخط تحميل الأداة.
ادفع نصف العينة ببطء ، مع ترك ما يقرب من 0.5 مل في المحقنة. بمجرد ظهور الجسيمات على الشاشة ، قم بتركيز الكاميرا بحيث يكون لها هالة واحدة كحد أقصى حول كل جسيم ، ضمن علامة التبويب "الأجهزة" ، انقر فوق Infuse وقم بتعيين معدل 1 ، 000 لمدة خمس ثوان. ثم اخفض المعدل إلى 30.
اضغط على تشغيل البرنامج النصي. بعد التأكد من صحة الإعدادات، انقر فوق نعم واتبع مطالبات البرنامج. بعد الانتهاء من الالتقاط ، انقر فوق إلغاء عندما يطلب البرنامج معالجة الملفات أو تصديرها.
عند تسجيل خمس لقطات لكل تخفيف ، قم باستيراد جميع اللقطات الخمسة للتحليل. قم بتمييز الملفات وانقر فوق معالجة الملفات المحددة. ضمن علامة التبويب "معالجة"، اضبط إعدادات التحليل على كسب شاشة قدره اثنين وعتبة اكتشاف تبلغ 15.
تحقق وانقر فوق موافق للتحليل. بعد المعالجة، انقر فوق نعم دون النقر فوق مربعات إضافية أو انقر فوق تصدير لتصدير الملفات. تراوح حجم جسيمات NK-EV المنقى من 76.30 إلى 174.30 نانومتر بمتوسط تركيز 1.39 في 10 أس 12 EVs لكل مليلتر.
بالإضافة إلى ذلك ، أظهر القياس الكمي لمقياس الفلور تركيز بروتين يبلغ حوالي 300 ملليغرام لكل مليلتر وتركيز الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل يبلغ 225 ملليغرام لكل مليلتر. أظهر علاج خلايا سرطان الدم البشرية K562 باستخدام NK-EVs انخفاضا يعتمد على الجرعة في بقاء الخلية مع EC 50 من 9.33 في 10 إلى قوة تسعة EVs لكل مليلتر.
