Nossa pesquisa se concentra em pequenas vesículas produzidas por um tipo de células imunológicas que são naturalmente eficazes em matar células cancerígenas. Essas vesículas possuem potencial terapêutico promissor para o tratamento de tumores sólidos, tanto nos locais primários quanto secundários, como o cérebro. Neste estudo, usamos uma resina bimodal para isolar vesículas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, maximizando a pureza do produto separando fisicamente as vesículas dos contaminantes enquanto retemos ainda mais os contaminantes dentro da resina por meio de forças eletrostáticas.
Em seguida, esterilizamos, concentramos e trocamos as vesículas antes de usar Os detalhes do fluxo de trabalho de biofabricação neste vídeo usam condições clinicamente relevantes e são escaláveis em termos de custo, produzindo efetivamente grandes quantidades de vesículas extracelulares de alta pureza. Isso torna a técnica acessível para que os laboratórios acadêmicos invistam recursos com confiança no estudo de tais terapêuticas com um processo confiável de produção e isolamento. Atualmente, estamos investigando o potencial terapêutico dessas vesículas e modelos pré-clínicos e fortalecendo ainda mais nossa compreensão de como eles funcionam.
Para começar, execute o início rápido do sistema de cromatografia líquida de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Faça as conexões usando o método gotejamento para gotejamento para garantir que nenhum ar seja introduzido dentro da coluna. Configure o coletor de frações com tubos de coleta apropriados para coletar as amostras.
Altere as configurações de fracionamento para o volume de coleta desejado. Remova 40 a 80 mililitros de vesícula extracelular previamente preparada ou meio condicionado rico em EV do freezer de 80 graus Celsius e descongele rapidamente a 37 graus Celsius. Girar a amostra a 10 000 G durante 30 minutos a quatro graus Celsius e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
Para reduzir os níveis de DNA de fita dupla, trate o meio condicionado rico em EV com cinco milimoles de cloreto de magnésio e 50 unidades por mililitro de endonuclease. Incube a amostra por duas a quatro horas a 37 graus Celsius com mistura moderada. Quando o sistema de cromatografia estiver pronto, carregue o meio condicionado rico em EV em uma seringa de 60 mililitros e conecte-o à linha de amostra.
Clique em Execução manual para iniciar o sistema e definir a taxa de fluxo como zero. Siga as instruções do software para salvar a execução preventivamente. Em seguida, clique em Iniciar.
Selecione PBS de filtragem dupla de batimento de linha e funcione a uma velocidade de fluxo de dois mililitros por minuto, garantindo que a solução passe pela coluna. Assim que o absorvente estabilizar, pressione Auto Zero UV. Altere o caminho do fluxo para direcionar a amostra para o frasco de resíduos antes da coluna. Após cinco a 20 segundos, direcione a amostra para a coluna.
Quando as leituras de UV atingirem aproximadamente 230 unidades de miliabsorbância, clique em Fracionamento. Após a injeção completa da amostra, mude o sistema tampão para PBS com filtro duplo para continuar a purificação. Quando o valor de UV atingir aproximadamente 1.600 unidades de miliabsorbância, clique novamente em Fracionamento.
Quando a execução for interrompida, salve o cromatograma como um documento PDF. Enxágue todos os componentes do aparelho de ultrafiltração com 20 a 30 mililitros de etanol a 90%. Centrifugar a 4 000 G durante cinco a 10 minutos e rejeitar o fluxo.
Em seguida, execute o enxágue com PBS estéril para equilibrar o dispositivo e repita as etapas de centrifugação como antes. Combine todas as frações diluídas de NK-EVs. Para maximizar a esterilidade, filtre a solução diluída de NK-EV usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro, pré-umedecido com PBS de filtro duplo.
Recolher o filtrado para o aparelho de concentração esterilizado. Centrifugar o filtrado a 4 000 g durante 15 a 40 minutos. Depois de centrifugar, misturar a solução no compartimento superior do filtro com uma pipeta serológica.
Novamente, gire a 4.000 G por 10 minutos. Inverta o dispositivo de filtragem e conecte-o ao dispositivo coletor para coletar o NK-EV. Gire o NK-EV a 2.000 G por dois minutos e transfira o produto purificado para um tubo estéril.
Inicie o sistema de análise de rastreamento de nanopartículas de acordo com as instruções do fabricante. Observe a célula de fluxo quanto a bolhas de ar. Se houver uma bolha de ar, remova-a enxaguando a célula de fluxo com etanol a 20% e água filtrada duplamente.
Uma vez limpo, reinsira cuidadosamente o módulo de laser no instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas. Feche a porta e clique em Iniciar câmera. Altere as configurações de captura para um ganho de tela de dois e um nível de câmera de 14.
Ligue o aquecedor para estabilizar a temperatura da célula de fluxo. Clique em Medição padrão para criar um script na guia SOP para coletar uma captura em um minuto a uma taxa de fluxo de 30 a 23 graus Celsius. Adicione a pasta e o nome do arquivo ao nome do caminho para salvar os dados.
Vortex o produto purificado NK-EV e prepare sua diluição usando PBS com filtro duplo. Depois de fazer o vórtice da amostra diluída, carregue-a na seringa de aquisição de 1 mililitro sem introduzir bolhas de ar. Conecte cuidadosamente a seringa à linha de carregamento do instrumento.
Empurre lentamente metade da amostra, deixando aproximadamente 0,5 mililitros na seringa. Quando as partículas estiverem visíveis na tela, foque a câmera para ter no máximo um halo ao redor de cada partícula, na guia Hardware, clique em Infundir e defina uma taxa de 1.000 por cinco segundos. Em seguida, reduza a taxa para 30.
Pressione Executar script. Depois de verificar se as configurações estão corretas, clique em Sim e siga as instruções do software. Depois de concluir a captura, clique em Cancelar quando o software solicitar o processamento ou exportação de arquivos.
Ao registrar cinco capturas por diluição, importe todas as cinco capturas para análise. Realce os arquivos e clique em Processar arquivos selecionados. Na guia Processo, ajuste as configurações de análise para um ganho de tela de dois e um limite de detecção de 15.
Marque e clique em OK para análise. Após o processamento, clique em Sim sem clicar em caixas adicionais ou clique em Exportar para exportar os arquivos. O tamanho de partícula purificada de NK-EV variou de 76,30 a 174,30 nanômetros com uma concentração média de 1,39 vezes 10 elevado a 12 EVs por mililitro.
Além disso, a quantificação do fluorômetro mostrou uma concentração de proteína de aproximadamente 300 miligramas por mililitro e uma concentração de DNA de fita dupla de 225 miligramas por mililitro. O tratamento com células de leucemia K562 humana com NK-EVs mostrou uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular com um EC 50 de 9,33 vezes 10 elevado a nove EVs por mililitro.
