המחקר שלנו מתמקד בשלפוחיות קטנות המיוצרות על ידי סוג של תאי חיסון היעילים באופן טבעי בהרג תאים סרטניים. שלפוחיות אלה טומנות בחובן פוטנציאל טיפולי מבטיח לטיפול בגידולים מוצקים, הן באתרים הראשוניים והן באתרים המשניים כגון המוח. במחקר זה, אנו משתמשים בשרף בימודאלי כדי לבודד שלפוחיות באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, למקסם את טוהר המוצר על ידי הפרדה פיזית של השלפוחיות ממזהמים תוך לכידה נוספת של מזהמים בתוך השרף באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים.
לאחר מכן אנו מעקרים, מרכזים וחוצצים מחליפים את השלפוחיות לפני השימוש פרטי זרימת העבודה של הייצור הביולוגי בסרטון זה משתמשים בתנאים רלוונטיים מבחינה קלינית וניתן להרחבה תמורת עלות, ומייצרים ביעילות כמויות גדולות של בועיות חוץ-תאיות בעלות טוהר גבוה. זה הופך את הטכניקה לנגישה למעבדות אקדמיות להשקיע בביטחון משאבים בלימוד טיפולים כאלה עם תהליך ייצור ובידוד אמין. אנו חוקרים כעת את הפוטנציאל הטיפולי של שלפוחיות ומודלים פרה-קליניים אלה ומחזקים עוד יותר את הבנתנו כיצד הם פועלים.
כדי להתחיל, לבצע אתחול מהיר של מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית בהתאם להוראות היצרן. בצע חיבורים בשיטת טפטוף לטפטוף כדי להבטיח שלא יוכנס אוויר לתוך העמודה. הגדר את אספן השברים עם צינורות איסוף מתאימים לאיסוף הדגימות.
שנה את הגדרות השבר לאמצעי האחסון הרצוי. הוציאו 40 עד 80 מיליליטר של שלפוחית חוץ-תאית שהוכנה בעבר או מדיה ממוזגת עשירה ברכב חשמלי מהמקפיא בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס והפשירו במהירות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סובב את הדגימה ב 10, 000 G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור חדש.
כדי להפחית את רמות הדנ"א הדו-גדילי, יש לטפל במצע הממוזג העשיר ברכב חשמלי עם חמישה מילימולים של מגנזיום כלורי ו-50 יחידות למיליליטר של אנדונוקלאז. לדגור על הדגימה במשך שעתיים עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתון. ברגע שמערכת הכרומטוגרפיה מוכנה, טען את המדיה הממוזגת העשירה ברכב חשמלי לתוך מזרק של 60 מיליליטר וחבר אותה לקו הדגימה.
לחץ על הפעלה ידנית כדי להפעיל את המערכת ולהגדיר את קצב הזרימה לאפס. פעל בהתאם להנחיות התוכנה כדי לשמור את ההפעלה מראש. לאחר מכן לחץ על התחל.
בחר Line Beat Double-Filtered PBS והפעל במהירות זרימה של שני מיליליטר לדקה, כדי להבטיח שהפתרון יעבור דרך העמודה. לאחר שהסופג מתייצב, לחץ על Auto Zero UV. שנה את נתיב הזרימה כדי להפנות את הדגימה לבקבוק הפסולת לפני העמודה. לאחר חמש עד 20 שניות, כוון את הדגימה לעמודה.
לאחר שקריאות UV מגיעות לכ- 230 יחידות ספיגה של מילי, לחץ על שבר. עם השלמת ההזרקה של הדגימה, העבר את מערכת החיץ ל- PBS מסונן כפול כדי להמשיך בטיהור. כאשר ערך UV מגיע כ 1, 600 יחידות ספיגה, שוב, לחץ על שבר.
לאחר הפסקת הריצה, שמור את הכרומטוגרמה כמסמך PDF. יש לשטוף כל רכיב של מנגנון סינון האולטרה עם 20 עד 30 מיליליטר של 90% אתנול. סובב ב 4, 000 G במשך חמש עד 10 דקות ולהשליך את הזרימה דרך.
לאחר מכן בצע את השטיפה עם PBS סטרילי כדי לאזן את המכשיר ולחזור על שלבי הצנטריפוגה כמו קודם. שלב את כל השברים המדוללים של NK-EVs. כדי למקסם את הסטריליות, סנן את פתרון NK-EV המדולל באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר, רטוב מראש עם PBS מסונן כפול.
אוספים את התסנין למנגנון הריכוז המעוקר. סובב את התסנין ב 4, 000 גרם במשך 15 עד 40 דקות. לאחר הסיבוב, מערבבים את התמיסה בתוך תא המסנן העליון באמצעות פיפטה סרולוגית.
שוב, להסתובב ב 4, 000 G במשך 10 דקות. הפוך את התקן הסינון וחבר אותו למכשיר האיסוף כדי לאסוף את ה- NK-EV. סובב את NK-EV ב 2, 000 G במשך שתי דקות ולהעביר את המוצר מטוהר לצינור סטרילי.
הפעל את מערכת ניתוח מעקב הננו-חלקיקים בהתאם להוראות היצרן. התבוננו בתא הזרימה של בועות אוויר. אם קיימת בועת אוויר, הסר אותה על ידי שטיפת תא הזרימה עם 20% אתנול ומים מסוננים כפול.
לאחר הניקוי יש להכניס מחדש בזהירות את מודול הלייזר למכשיר ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. סגור את הדלת ולחץ על Start Camera. שנה את הגדרות הצילום לרווח מסך של שניים ורמת מצלמה של 14.
הפעל את תנור החימום כדי לייצב בטמפרטורה את תא הזרימה. לחץ על מדידה רגילה כדי ליצור סקריפט תחת הכרטיסיה SOP לאיסוף לכידה אחת במשך דקה אחת בקצב זרימה של 30 ב- 23 מעלות צלזיוס. הוסף את התיקיה ואת שם הקובץ לשם הנתיב כדי לשמור את הנתונים.
מערבלים את מוצר ה-NK-EV המטוהר ומכינים את הדילול שלהם באמצעות PBS בסינון כפול. לאחר ערבוב הדגימה המדוללת, לטעון אותו לתוך מזרק רכישת 1 מיליליטר מבלי להכניס בועות אוויר. חבר בזהירות את המזרק לקו טעינת המכשיר.
לדחוף לאט מחצית הדגימה, משאיר כ 0.5 מיליליטר מזרק. ברגע שהחלקיקים גלויים על המסך, מקד את המצלמה כך שתהיה לה הילה אחת לכל היותר סביב כל חלקיק, תחת הכרטיסיה חומרה, לחץ על Infuse והגדר קצב של 1, 000 למשך חמש שניות. לאחר מכן הורידו את התעריף ל-30.
לחץ על הפעל קובץ Script. לאחר שווידאת שההגדרות נכונות, לחץ על כן ופעל בהתאם להנחיות התוכנה. לאחר השלמת הלכידה, לחץ על ביטול כאשר התוכנה מבקשת לעבד או לייצא קבצים.
לאחר רישום חמש לכידות בכל דילול, ייבא את כל חמש הלכידות לניתוח. סמן את הקבצים ולחץ על עבד קבצים נבחרים. תחת הכרטיסיה תהליך, התאם את הגדרות הניתוח לרווח מסך של שניים ולסף זיהוי של 15.
סמן ולחץ על אישור לניתוח. לאחר העיבוד, לחץ על כן מבלי ללחוץ על תיבות נוספות או לחץ על ייצוא כדי לייצא את הקבצים. גודל חלקיקי NK-EV מטוהרים נע בין 76.30 ל-174.30 ננומטר עם ריכוז ממוצע של פי 1.39 פי 10 להספק של 12 כלי רכב חשמליים למיליליטר.
בנוסף, כימות פלואורומטר הראה ריכוז חלבון של כ-300 מיליגרם למיליליטר וריכוז DNA דו-גדילי של 225 מיליגרם למיליליטר. טיפול בתאי לוקמיה K562 אנושיים עם NK-EV הראה ירידה תלוית מינון בכדאיות התא עם EC 50 של 9.33 כפול 10 להספק של תשעה EV למיליליטר.
