Наши исследования сосредоточены на небольших везикулах, производимых иммунными клетками, которые естественным образом эффективны в уничтожении раковых клеток. Эти везикулы обладают многообещающим терапевтическим потенциалом для лечения солидных опухолей, как в первичных, так и во вторичных областях, таких как головной мозг. В этом исследовании мы используем бимодальную смолу для изоляции везикул с помощью эксклюзионной хроматографии, максимизируя чистоту продукта за счет физического отделения везикул от загрязняющих веществ и дальнейшего улавливания загрязняющих веществ внутри смолы с помощью электростатических сил.
Затем мы стерилизуем, концентрируем и заменяем пузырьки перед использованием Детали рабочего процесса биопроизводства в этом видео используют клинически значимые условия и масштабируются по стоимости, эффективно производя большое количество внеклеточных везикул высокой чистоты. Это делает методику доступной для академических лабораторий, чтобы они могли уверенно вкладывать ресурсы в изучение таких терапевтических средств с надежным процессом производства и изоляции. В настоящее время мы исследуем терапевтический потенциал этих везикул и доклинических моделей и углубляем наше понимание того, как они работают.
Для начала проведите быструю инициацию системы жидкостной хроматографии белка в соответствии с инструкциями производителя. Выполняйте соединения методом «капля-капля», чтобы убедиться, что воздух не попадает внутрь колонны. Установите сборщик фракций с соответствующими сборными трубками для сбора проб.
Измените настройки фракционирования на желаемый объем сбора. Извлеките от 40 до 80 миллилитров предварительно подготовленных внеклеточных везикул или кондиционированной среды, богатой EV, из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия и быстро разморозьте при температуре 37 градусов Цельсия. Вращайте образец при температуре 10 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку.
Чтобы снизить уровень двухцепочечной ДНК, обрабатывайте кондиционированную среду, богатую EV, пятью миллимолями хлорида магния и 50 единицами эндонуклеазы на миллилитр. Инкубируйте образец в течение двух-четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия при умеренном перемешивании. Как только хроматографическая система будет готова, загрузите кондиционированную среду, богатую EV, в шприц объемом 60 миллилитров и подключите ее к линии для отбора образцов.
Нажмите кнопку Ручной запуск, чтобы запустить систему и установить скорость потока равной нулю. Следуйте инструкциям программного обеспечения, чтобы заранее сохранить прогон. Затем нажмите «Начать».
Выберите Line Beat Double-Filtered PBS и работайте со скоростью потока два миллилитра в минуту, гарантируя, что решение пройдет через колонку. Как только абсорбент стабилизируется, нажмите Auto Zero UV. Измените траекторию потока, чтобы направить пробу в бутылку для отходов перед колонной. Через пять-20 секунд направьте образец в колонку.
Когда показания УФ-излучения достигнут примерно 230 единиц поглощения, нажмите «Фракционирование». После полного впрыска образца переключите буферную систему в режим PBS с двойной фильтрацией, чтобы продолжить очистку. Когда значение УФ-излучения достигнет приблизительно 1 600 единиц поглощения, снова нажмите кнопку Фракционирование.
После остановки выполнения сохраните хроматограмму в формате PDF. Промойте каждый компонент ультрафильтрационного аппарата 20-30 миллилитрами 90% этанола. Вращайте при давлении 4 000 G в течение пяти-10 минут и отбросьте поток.
Затем выполните промывку стерильным PBS, чтобы сбалансировать устройство, и повторите этапы центрифугирования, как и раньше. Соедините все разбавленные фракции NK-EVs. Для обеспечения максимальной стерильности разведенный раствор NK-EV следует отфильтровать с помощью шприцевого фильтра толщиной 0,22 микрометра, предварительно смоченного двойным фильтром PBS.
Соберите фильтрат в стерилизованный концентрационный аппарат. Вращайте фильтрат при 4 000 G в течение 15–40 минут. После отжима смешайте раствор в верхнем отсеке фильтра с помощью серологической пипетки.
Снова вращайте при 4 000 G в течение 10 минут. Переверните фильтрующее устройство и присоедините его к сборному устройству для сбора НК-ЭВ. Вращайте NK-EV при температуре 2 000 G в течение двух минут и переложите очищенный продукт в стерильную пробирку.
Запустите систему анализа отслеживания наночастиц в соответствии с инструкциями производителя. Следите за ячейкой потока на наличие пузырьков воздуха. Если присутствует пузырь воздуха, удалите его, промыв проточную ячейку 20% этанолом и дважды отфильтрованной водой.
После очистки осторожно вставьте лазерный модуль обратно в прибор для анализа отслеживания наночастиц. Закройте дверцу и нажмите «Запустить камеру». Измените настройки съемки на два и уровень камеры 14.
Включите нагреватель, чтобы стабилизировать температуру проточной ячейки. Нажмите «Стандартное измерение», чтобы создать скрипт на вкладке «СОП» для сбора данных одного захвата в течение одной минуты при расходе 30 при температуре 23 градуса Цельсия. Добавьте имя папки и файла к имени пути, чтобы сохранить данные.
Вихревые очистки продукта НК-ЭВ и приготовление их разбавления с помощью двойных фильтров PBS. После вортексирования разведенного образца загрузите его в 1-миллилитровый шприц для сбора без введения пузырьков воздуха. Осторожно подсоедините шприц к линии загрузки инструмента.
Медленно протолкните половину образца, оставив в шприце примерно 0,5 миллилитра. Как только частицы станут видны на экране, сфокусируйте камеру так, чтобы вокруг каждой частицы было максимум одно ореоло, На вкладке «Оборудование» нажмите «Влить» и установите скорость 1 000 в течение пяти секунд. Затем убавьте ставку до 30.
Нажмите Run Script. Убедившись в правильности настроек, нажмите «Да» и следуйте инструкциям программного обеспечения. После завершения захвата нажмите кнопку «Отмена», когда программное обеспечение попросит обработать или экспортировать файлы.
После записи пяти захватов за одно разведение импортируйте все пять захватов для анализа. Выделите файлы и нажмите «Обработать выбранные файлы». На вкладке Процесс настройте параметры анализа до коэффициента усиления экрана, равного двум, и порога обнаружения, равного 15.
Проверьте и нажмите OK для анализа. После обработки нажмите «Да», не нажимая дополнительные поля, или нажмите «Экспорт», чтобы экспортировать файлы. Размер частиц очищенного NK-EV варьировался от 76,30 до 174,30 нанометров со средней концентрацией 1,39 умножить на 10 в степени 12 EV на миллилитр.
Кроме того, количественное определение флуориметра показало концентрацию белка примерно 300 миллиграммов на миллилитр и концентрацию двухцепочечной ДНК 225 миллиграммов на миллилитр. Лечение клеток лейкемии человека K562 NK-EV показало дозозависимое снижение жизнеспособности клеток при EC 50 в 9,33 раза по 10 в степени девяти EV на миллилитр.
