La nostra ricerca si concentra su piccole vescicole prodotte da un tipo di cellule immunitarie che sono naturalmente efficaci nell'uccidere le cellule tumorali. Queste vescicole hanno un potenziale terapeutico promettente per il trattamento dei tumori solidi, sia nei siti primari che secondari come il cervello. In questo studio, utilizziamo una resina bimodale per isolare le vescicole tramite cromatografia ad esclusione dimensionale, massimizzando la purezza del prodotto separando fisicamente le vescicole dai contaminanti e intrappolando ulteriormente i contaminanti all'interno della resina attraverso le forze elettrostatiche.
Quindi sterilizziamo, concentriamo e sostituiamo le vescicole prima dell'uso I dettagli del flusso di lavoro di bioproduzione in questo video utilizzano condizioni clinicamente rilevanti ed è scalabile in termini di costi, producendo efficacemente grandi quantità di vescicole extracellulari ad alta purezza. Ciò rende la tecnica accessibile ai laboratori accademici per investire con sicurezza le risorse nello studio di tali terapie con un processo di produzione e isolamento affidabile. Attualmente stiamo studiando il potenziale terapeutico di queste vescicole e dei modelli preclinici e rafforzando ulteriormente la nostra comprensione di come funzionano.
Per iniziare, eseguire l'avvio rapido del sistema di cromatografia liquida proteica secondo le istruzioni del produttore. Effettuare i collegamenti utilizzando il metodo drip-to-drip per garantire che non venga introdotta aria all'interno della colonna. Impostare il collettore di frazioni con provette di raccolta appropriate per raccogliere i campioni.
Modificare le impostazioni di frazionamento sul volume di raccolta desiderato. Rimuovere da 40 a 80 millilitri di vescicola extracellulare precedentemente preparata o di terreno condizionato ricco di EV dal congelatore a 80 gradi Celsius e scongelare rapidamente a 37 gradi Celsius. Centrifugare il campione a 10.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Per ridurre i livelli di DNA a doppio filamento, trattare il terreno condizionato ricco di EV con cinque millimoli di cloruro di magnesio e 50 unità per millilitro di endonucleasi. Incubare il campione per due-quattro ore a 37 gradi Celsius con una miscelazione moderata. Una volta che il sistema cromatografico è pronto, caricare il terreno condizionato ricco di EV in una siringa da 60 millilitri e collegarlo alla linea di campionamento.
Fare clic su Esecuzione manuale per avviare il sistema e impostare la portata su zero. Seguire le istruzioni del software per salvare preventivamente l'esecuzione. Quindi fare clic su Avvia.
Selezionare Line Beat Double-Filtered PBS ed eseguire a una velocità di flusso di due millilitri al minuto, assicurandosi che la soluzione scorra attraverso la colonna. Una volta che l'assorbente si è stabilizzato, premere Auto Zero UV. Modificare il percorso del flusso per indirizzare il campione verso la bottiglia di scarto prima della colonna. Dopo cinque-20 secondi, dirigere il campione verso la colonna.
Una volta che le letture UV raggiungono circa 230 unità di assorbanza, fare clic su Frazionamento. Al termine dell'iniezione del campione, passare il sistema tampone al PBS a doppio filtro per continuare la purificazione. Quando il valore UV raggiunge circa 1.600 unità di assorbanza, fare nuovamente clic su Frazionamento.
Una volta interrotta la corsa, salvare il cromatogramma come documento PDF. Sciacquare ogni componente dell'apparecchio di ultrafiltrazione con 20-30 millilitri di etanolo al 90%. Centrifugare a 4.000 g per cinque-10 minuti e scartare il flusso.
Eseguire quindi il risciacquo con PBS sterile per equilibrare il dispositivo e ripetere le fasi di centrifugazione come prima. Combina tutte le frazioni diluite di NK-EV. Per massimizzare la sterilità, filtrare la soluzione diluita di NK-EV utilizzando un filtro per siringa da 0,22 micrometri, pre-bagnato con PBS a doppio filtro.
Raccogliere il filtrato nell'apparecchio di concentrazione sterilizzato. Centrifugare il filtrato a 4.000 g per 15-40 minuti. Dopo la centrifuga, miscelare la soluzione all'interno dello scomparto superiore del filtro utilizzando una pipetta sierologica.
Anche in questo caso, centrifugare a 4.000 g per 10 minuti. Capovolgere il dispositivo di filtraggio e collegarlo al dispositivo di raccolta per raccogliere l'NK-EV. Centrifugare l'NK-EV a 2.000 g per due minuti e trasferire il prodotto purificato in una provetta sterile.
Avviare il sistema di analisi del tracciamento delle nanoparticelle secondo le istruzioni del produttore. Osservare la cella di flusso per le bolle d'aria. Se è presente una bolla d'aria, rimuoverla risciacquando la cella di flusso con etanolo al 20% e acqua filtrata due volte.
Una volta pulito, reinserire con cautela il modulo laser nello strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Chiudere lo sportello e fare clic su Avvia telecamera. Modificare le impostazioni di acquisizione impostando un guadagno dello schermo pari a due e un livello della fotocamera pari a 14.
Accendere il riscaldatore per stabilizzare la temperatura della cella di flusso. Fare clic su Misurazione standard per creare uno script nella scheda SOP per la raccolta di un'acquisizione nell'arco di un minuto a una velocità di flusso di 30 a 23 gradi Celsius. Aggiungere la cartella e il nome del file al nome del percorso per salvare i dati.
Agitare il prodotto NK-EV purificato e prepararne la diluizione utilizzando PBS a doppio filtro. Dopo aver agitato il campione diluito, caricarlo nella siringa di acquisizione da 1 millilitro senza introdurre bolle d'aria. Collegare con cautela la siringa alla linea di caricamento dello strumento.
Spingere lentamente metà del campione, lasciando circa 0,5 millilitri nella siringa. Una volta che le particelle sono visibili sullo schermo, metti a fuoco la fotocamera in modo da avere un massimo di un alone attorno a ciascuna particella, nella scheda Hardware, fai clic su Infondi e imposta una velocità di 1.000 per cinque secondi. Quindi abbassa il tasso a 30.
Premere Esegui script. Dopo esserti assicurato che le impostazioni siano corrette, fai clic su Sì e segui le istruzioni del software. Dopo aver completato l'acquisizione, fare clic su Annulla quando il software richiede di elaborare o esportare i file.
Dopo aver registrato cinque acquisizioni per diluizione, importare tutte e cinque le acquisizioni per l'analisi. Evidenziare i file e fare clic su Elabora file selezionati. Nella scheda Processo, regolare le impostazioni di analisi su un guadagno dello schermo di due e una soglia di rilevamento di 15.
Selezionare e fare clic su OK per l'analisi. Dopo l'elaborazione, fare clic su Sì senza fare clic su caselle aggiuntive oppure fare clic su Esporta per esportare i file. La dimensione delle particelle di NK-EV purificata variava da 76,30 a 174,30 nanometri con una concentrazione media di 1,39 volte 10 alla potenza di 12 EV per millilitro.
Inoltre, la quantificazione fluorimetrica ha mostrato una concentrazione proteica di circa 300 milligrammi per millilitro e una concentrazione di DNA a doppio filamento di 225 milligrammi per millilitro. Il trattamento con cellule leucemiche umane K562 con NK-EV ha mostrato una diminuzione dose-dipendente della vitalità cellulare con un EC 50 di 9,33 volte 10 alla potenza di nove EV per millilitro.
