In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Zusammenfassung

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT ( Tc TERT) und die Wiederherstellung der aktiven T. castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex In-vitro-.

Zusammenfassung

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) und die Wiederherstellung der aktiven T. castaneum Telomerase ribonucleoprotein (RNP)-Komplex in vitro.

Telomerase ist ein spezialisierter ^{Reverse-Transkriptase-1,} die kurze DNA-Wiederholungen, die Telomere, die 3 'Ende der linearen Chromosomen ^2, die ihnen von End-to-End-Fusion und Abbau zu schützen dienen hinzu. Nach DNA-Replikation, ein kurzes Segment am Ende des Chromosoms ³ und ohne Telomerase ist verloren, weiterhin Zellen, bis schließlich der Erreichung ihrer Hayflick Limit ⁴ geteilt. Darüber hinaus ist die Telomerase ruhend in den meisten somatischen Zellen ⁵ bei Erwachsenen, sondern ist aktiv in Krebszellen ^6, wo es fördert Zelle Unsterblichkeit ^7.

Die minimale Telomerase-Enzym besteht aus zwei Kernkomponenten: die Protein-Untereinheit (TERT), welche die katalytische Untereinheit des Enzyms und ein integraler RNA-Komponente (TER), der die Vorlage TERT verwendet, um Telomere ^8,9 synthetisieren enthält umfasst. Vor 2008 hatten nur Strukturen für einzelne Telomerase-Domänen ^10,11 gelöst. Ein wichtiger Durchbruch auf diesem Gebiet kamen aus der Bestimmung der Kristallstruktur der aktiven ^12, katalytische Untereinheit von T. castaneum Telomerase, Tc TERT ^1.

Hier stellen wir Verfahren zur Herstellung von großen Mengen des aktiven, löslichen Tc TERT für strukturelle und biochemische Untersuchungen, und die Wiederherstellung der Telomerase RNP-Komplex in vitro für Telomerase-Aktivität Assays. Eine Übersicht über die experimentellen Methoden ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

1. Expression von rekombinanten Tc TERT

1. Impfen 6 L von 2YT Medien (6 x 2 L Baffled Erlenmeyerkolben mit 1 l Brühe 2YT in jeder) aus sechs frische Platten von Rosetta (DE3) transformiert pLysS Zellen mit den synthetischen Tc TERT Plasmid mit einem TEV spaltbaren N-terminalen Hexa-Histidin- -Tag.
2. Wachsen Zellen bei 37 ° C unter Schütteln bei 220 Upm bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,5-0,6.
3. Induce Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG.
4. Temperatur reduzieren und 30 ° C, langsam schüttelnd zu 150 Umdrehungen pro Minute und lassen Zellen auf Protein für 4-5 h ausdrücken
5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C und 3500 rpm für 30 min.
6. Resuspendieren je 1 L Zellpellet in 20 ml Puffer mit 25 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 0,5 M KCl, 15 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 0,1 mM phenylmethyl Sulfonyl (PMSF) und Benzamidin.
7. Flash-Freeze resuspendiert Zellgemisch durch langsames Eintropfen der Zellen in eine 50 ml Kunststoff-konischen Rohr mit flüssigem Stickstoff gefüllt, so dass jeder Tropfen beim Aufprall gefriert in den flüssigen N _2. Shop gefrorenen Zellen bei -80 ° C bis bereit für die Proteinreinigung.

2. Reinigung von Tc TERT

1. Thaw Zellen bei Raumtemperatur, bis eine flüssige Konsistenz erreicht ist und dann Metallbecher bewegen auf dem Eis für die Beschallung.
2. Mit Ultraschall-Zellen auf Eis für 2 min in Intervallen von 30 Sekunden mit 30 Sekunden Pause, bei etwa 51 W Leistung.
3. Spin down lysierten Zellen bei 18.000 rpm für 20 min auf die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen trennen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand für Nickel-Affinitätschromatographie.
4. Äquilibrieren der Ni-NTA (Nickel-Nitrilotriessigsäure)-Säule mit Puffer mit 25 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 0,5 M KCl, 15 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF und Benzamidin.
5. Laden Überstand über dem Harz und sammeln Sie die Durchströmung.
6. Die Säule wird mit Puffer mit 25 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 500 mM KCl, 15 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol und 0,1 mM PMSF, um alle verbleibenden und nicht-spezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen.
7. Eluieren Tc TERT der Ni-NTA-Harz mit einem Imidazolgradienten von 15 bis 300 mM und sammeln 3 ml Fraktionen für SDS-PAGE-Analyse.
8. Verwenden Sie PAGE-Analyse, um festzustellen, welche Fraktionen enthalten Tc TERT Protein und konzentrieren diese Fraktionen in einer Amicon 30 kDa (Millipore-Filter).
9. Konzentrieren Sie sich Tc TERT Fraktionen auf ein Volumen von weniger als 10 ml zur weiteren Reinigung.
10. Die Tc TERT wird weiter über die KAT-Säule (HS poros, Applied Biosystems) voräquilibriert mit Puffer mit 25 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 500 mM KCl und 1 mM DTT gereinigt.
11. Laden Sie die Protein-Mix auf der HS poros Spalte und waschen Sie es für alle Protein-und Nukleinsäure-Verunreinigungen zu entfernen.
12. Die Säule wird mit Puffer mit 500 mM KCl und 700 mM KCl, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen.
13. Eluieren der Tc TERT Protein aus dem HS poros Säule mit 1 M KCl-Puffer. An diesem Punkt des Proteins sollte mehr als 99% rein.
14. Entfernen Sie alle Protein-Aggregate, indem das Protein über eine Superdex-200 Schlichte Spalte (Size Exclusion Chromatography - GE Healthcare), pre-äquilibriert mit Puffer mit 25 mM Tris, pH 7,5, 10% Glycerin, 500 mM KCl und 1 mM TCEP.

3. Tribolium castaneum Käfer Kultur

1. Die T. castaneum Käfer, wo zunächst als ein Geschenk von Dr. S. Brown, Division of Biology, Kansas State University zur Verfügung gestellt.
2. Starten Sie T. castaneum Kultur, indem hundert erwachsenen Käfer in einen Behälter mit 28,5 g Mehl und 1,5 g getrocknete Bäckerhefe.
3. Shop Käfer Kulturen bei Raumtemperatur und in einer dunklen, feuchten Umgebung für drei Minuten vor vier Wochen, um für die Reproduktion und das Wachstum zu ermöglichen. Legen Sie ein Becherglas mit Wasser in der Käfer Lagerfläche auf einer feuchten Umgebung zu gewährleisten.
4. Ernten Sie die Käferlarven wie für RNA-Isolierung benötigt. Lassen Sie die restlichen Larven zu Erwachsenen reifen, halten sie in der gleichen Kultur.
5. Jeden Monat, Transfer zu den aktivsten Käfer (nicht mehr als ein Hundert) in eine neue Flasche mit frischem Mehl und Hefe, um ihre Versorgung mit Lebensmitteln zu ergänzen.

4. T. castaneum Gesamt-RNA isoliert

1. Ernte 20 Käferlarven aus der Kultur (jede Kultur sollte zwischen 500-1000 Larven enthalten), indem Sie sie aus adulten Käfer und das Mehl / Hefekultur. Beseitigen Sie Mehl oder Hefepartikel an die Käfer vor dem Mahlen sie.
2. Sterilisieren der Bank-Bereich, die Mörser und Pistill (man denke an die Behandlung die Handschuhe auch) für dieses Verfahren mit RNaseZap (Ambion, Inc.) verwendet, um alle Spuren von Ribonukleasen vor dem Mahlen die Käfer zu entfernen.
3. Grind Larven in flüssigem N ₂ zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel und transfer das Pulver in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen unter Beibehaltung der flüssigen N _2, um sicherzustellen, dass das Pulver gefroren bleibt bis zum Extraktionspuffer zugegeben.
4. Lassen Sie überschüssige Flüssigkeit N ₂ aus dem Pulver verdampfen. Nachdem die Flüssigkeit verdampft ist N _2, Homogenisierung der Käfer Pulver in 200 ul Extraktionspuffer (je 20 Larven) mit 25 mM Tris-HCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EGTA, 0,1 mM Benzamidin, 200 mM KCl, 10 % Glycerin, 10 mM Imidazol und 20U der RNasin, pH 7,5 und Inkubation auf Eis für 30 Minuten.
5. Centrifuge das Homogenat bei 15.000 rpm für 20 Minuten bei 4 ° C, den Überstand und Flash-Freeze der Probe in flüssigem N _2. Falls erforderlich, können die Proben bei -80 ° C über Nacht aufbewahrt werden.
6. Entpacken Sie die Gesamt-RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen).

5. In vitro Rekonstitution der Tribolium castaneum Telomerase

1. Mix 20 ug rekombinante His-Tag Tc TERT mit 50 ul T. castaneum Gesamt-RNA in den Bindungspuffer mit 25 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 10% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol und 10 mM Imidazol, pH 7,5.
2. Inkubieren Sie die Tc TERT - Gesamt-RNA-Gemisch zwei Stunden bei 22 ° C in T. castaneum Lysat in Anwesenheit von RNasin Inhibitor RNA-Abbau zu verhindern.
3. Purify der Komplex über eine Ni-NTA-Säule zu Lysat Verunreinigungen und überschüssige RNA zu entfernen.

6. Telomerase wiederholen Amplifikationsprotokoll (TRAP)-Assays

1. Mix 4 pg Ni-NTA gereinigt T. castaneum Telomerase in 50 ul Dehnung Puffer mit 20 mM Tris-HCl (pH - 8,3), 7,5 mM MgCl _2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EGTA, 0,01% BSA, 0,5 mM dNTPs, 1 uM TCAS-TS DNA-Primer (5'-AAGCCGTCGAGCAGAGTC-3 '), und inkubieren Sie die Lösung bei 30 ° C für 60 Minuten Verlängerung des TCAS-TS DNA-Primer durch die rekonstituierte T. ermöglichen castaneum Telomerase.
2. Entpacken Sie die längliche Einzelstrang-DNA (ssDNA) durch Zugabe eines gleichen Volumen Phenol Chloroform zur Reaktionsmischung. Schütteln Sie die Mischung leicht, bis die Emulsion homogen ist.
3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C, die ssDNA von Verunreinigungen zu trennen.
4. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht der Probe auf ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie eine Endkonzentration von 10 mM NaOAc (pH 5,0), 1 mM MgCl _2, und 66,4% EtOH und danach lässt man die Probe auf Niederschlag über Nacht bei -20 ° C.
5. Drehen Sie die Probe bei 15.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C bis Pellet das ausgefallene ssDNA. Dekantieren der Lösung mit einer Pipette und dann mit 200 ul 70% EtOH auf die Probe, um die verbleibenden NaOAc und MgCl ₂ aus der Probe zu waschen. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten bei der gleichen Geschwindigkeit und Temperatur wieder Pellet der Probe.
6. Dekantieren der EtOH-Lösung mit einer Pipette und entfernen die letzten Spuren von Ethanol, indem sie die Eppendorf-Röhrchen, um bei Raumtemperatur inkubieren offen für drei Minuten. Nachdem Ethanol in der Probe vorhanden wird mit der PCR-Amplifikation Schritt stören.
7. Resuspendieren ssDNA Pellet (enthält die Telomerase verlängert Produkt und das TCAS-TS-Primer) in 50 ul PCR-Reaktion Puffer mit 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 2 mM MgCl _2, 100 uM dNTPs (dATP, dGTP und dTTP), 10 uM ^[32 P] dCTP, 1 uM TCAS-CX-Primer (5'-GTGTGACCTGACCTGACC-3 ') und 1,25 U Taq DNA Polymerase.
8. PCR verstärken die Telomerase Dehnung Produkte (29 Zyklen von 94 ° C für 30 Sekunden, 50 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute), so dass sie sichtbar auf einem 12% Polyacrylamidgel werden.
9. Pre-run 12% Gel mit Tris-Borat-EDTA (TBE) Laufpuffer mit 44,5 mm Tris, 44,5 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8 für 30 Minuten vor der Ausführung des PCR-Proben. Nach einer Vorauswahl läuft und das Laden des Gels mit den PCR-Reaktionen, führen Sie das Gel bei 185 Volt für 1,5-2 Stunden bei 4 ° Celsius oder auf Eis.
10. Trocknen Sie das Gel und die Phosphor-Speicherfolien, um die Aktivität zu visualisieren.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Beispiel für das gereinigte Tc TERT nach Größenausschlusschromatographie ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Protein nach der Reinigung konzentrierte sich auf einem 12% SDS-Polyacrylamidgel laufen und wird gezeigt, dass mehr als 99% rein (Abbildung 2a). Die Größe Ausgrenzung (S200) Chromatogramm steht ebenfalls zur Verfügung (Abbildung 2B), um die Reinheit und das Fehlen von Aggregaten aus dem gereinigten Protein Probe zu demonstrieren. Eine Ausbeute von 5 mg Protein, nachdem alle Reinigungsschritte sind abgeschlossen ist in der Regel erhalten, obwohl die endgültige Ausbeute variieren kann.

Ein Vertreter TRAP-Assay für die rekonstituierte T. castaneum Telomerase ist in Abbildung 3 dargestellt, wie zuvor von Mitchell et al. ^12. Die stufenweise Leiter der Telomerase-Produkte können in Spur 1 zu sehen ist, jedochsie fehlen in den beiden RNase behandelt Telomerase und die TERT aktiven Zentrum Mutante (D251A) Proben in den Spuren 2 und 3 jeweils.

Abbildung 1. Flussdiagramm der Schritte in der Rekonstitution des rekombinanten Tc TERT beteiligt. Zuerst wird das rekombinante Tc TERT in E. überexprimiert coli. Das Protein wird dann durch Nickel, Kationenaustauschkapazität und Size-Exclusion-Chromatographie gereinigt. Die T. castaneum Käfer sind im Haus kultiviert und ihre Larven werden verwendet, um die Gesamt-RNA zu isolieren. Das gereinigte Tc TERT und der Gesamt-RNA werden dann gemischt zur Wiederherstellung der Telomerase RNP-Komplex und einem anschließenden TRAP-Assay verwendet, um die RNP-Komplex zu bestätigen ist eine aktive Telomerase.

Abbildung 2. Größe Chromatogramm und SDS-PAGE-Analyse von Tc TERT Protein. (A) 12% SDS-Polyacrylamidgel der Tc TERT Protein nach Größenausschlusschromatographie. Die Tc TERT Protein (70 kDa) wandert schneller auf dem SDS-PAGE-Gel, weil es einen hohen isoelektrischen Punkt (pI - 9,8) hat. (B) Größe Chromatogramm (Superdex S200) des Tc TERT Protein.

Abbildung 3. TRAP-Assays der in vitro rekonstituiert Tribolium castaneum Telomerase von Mitchell et al angepasst. ^12. Spur 1: Wildtyp-Tc TERT und Gesamt-RNA aus Käferlarven isoliert. Spur 2: Wildtyp-Tc TERT und RNase behandelt Larven Gesamt-RNA und Zellextrakten. Lane 3: aktive Zentrum mutierte Tc TERT (D251A) und Käferlarven insgesamt Larven RNA.

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Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Produktion von großen Mengen der katalytischen Untereinheit von T. castaneum Telomerase TERT in lösliche aktive Form für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Die Methode der Tc TERT Überexpression empfindlich auf subtile Veränderungen in Temperatur oder Zelldichte von den oben dargestellten und können dramatisch beeinflussen die Höhe der Proteinexpression. Insbesondere haben wir festgestellt, dass Induktion der Zellen für die Proteinexpress...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Catalog Number
Rosetta (DE3) pLysS Cells	Novagen	70956
2YT Broth	Teknova	Y0215
IPTG	Gold-Biotechnologie	I2481C
MISONIX Sonicator 3000	Qsonica, LLC.
ÄKTA Purifier FPLC	GE Life Sciences
Ni-NTA Superflow Resin	Qiagen	30410
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Geräte	Millipore	UFC903008
POROS 50 HS starken Kationenaustausch Verpackung	Applied Biosystems	1-3359-06
POROS 50 HQ starken Kationenaustausch Verpackung	Applied Biosystems	1-2559-06
Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Spalte	GE Life Sciences	17-5175-01
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol 25:24:1 mit 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA	Sigma	P3803-100 mL
RNaseZap	Ambion	AM9780
Rekombinante RNasin Ribonucleaseinhibitor	Promega	N251B
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
DNA-Oligonukleotide	Integrated DNA Technologies