アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

要約

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（単離するための方法を提示 TC TERT）とアクティブの再構成 T. castaneumテロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体 in vitroで。

要約

テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（Tcは TERT）の単離とアクティブなTの再構成のための方法を提示in vitroでcastaneumのテロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体。

テロメラーゼは、エンドツーエンドの融合や劣化から守るために役立つ線形染色体²の3'末端にテロメアと呼ばれる短いDNAの繰り返しを、追加する特殊な逆転写酵素¹です。 DNA複製の後、短いセグメントは^3番染色体の端にとテロメラーゼなしで失われ、細胞は最終的に彼らのヘイフリック制限を^4に達するまで分割し続けます。さらに、テロメラーゼは、成人のほとんどの体細胞⁵に休止状態ですが、がん細胞では細胞の不死^7を促進する⁶アクティブになります。

酵素とTERTがテロメア^8,9を合成するために使用するテンプレートが含まれている不可欠なRNA成分（TER）の触媒サブユニットを含むタンパク質のサブユニット（TERT）、：最小限のテロメラーゼの酵素は、2つのコアコンポーネントで構成されています。前の2008年まで、個々のテロメラーゼのドメイン用の唯一の構造は^10,11を解決していた。この分野で大きなブレークスルーは、アクティブな¹²の結晶構造の決定、T.の触媒サブユニットから来たcastaneumのテロメラーゼ、Tcは TERT ^1。

ここで、我々は、構造的および生化学的研究のためのアクティブな、水溶性のTcの TERT、およびテロメラーゼ活性のアッセイのためのin vitroでのテロメラーゼRNP複合体の再構成を大量に製造する方法を提示する。使用した実験方法の概要を図1に示されています。

プロトコル

1。組換えTcは TERTの発現

1. TEV切断可能なN -末端で合成Tcは TERTプラスミドを含む（DE3）ロゼッタ変換pLysSを細胞六新鮮なプレートから2YTメディアの6リットル（6 × 2、Lはそれぞれの2YTブイヨン1Lを含む三角フラスコをバッフル）を植菌ヒスチジン-タグ。
2. 0.5から0.6のOD _600、220 rpmで振盪しながら37℃で細胞を成長させる。
3. 1mMのIPTGを添加することによりタンパク質の発現を誘導。
4. ° C、遅い150rpmの振とうし30に温度を下げ、そして細胞は4から5時間にわたってタンパク質を発現することができます
5. 4℃で遠心分離により細胞を回収℃、30分間3500 rpmで。
6. 25mMのトリス、pH 7.5、10％グリセロール、0.5 MのKCl、15mMのイミダゾール、5mMのβ-メルカプトエタノール、および0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及びベンズアミジンを含有する緩衝液20mlに各1 L細胞ペレットを再懸濁します。
7. フラッシュ凍結は徐々に各ドロップは、液体N ₂で衝撃にフリーズするように液体窒素を充填した50ミリリットルのプラスチックコニカルチューブに細胞を滴下して細胞の混合物を再懸濁した。 -80凍結細胞を保存° Cタンパク質精製の準備ができるまで。

2。 Tcは TERTの精製

1. 液体の一貫性に達するまで室温で細胞を融解し、超音波処理のために氷の上に金属製のビーカーに移動します。
2. 電力の約51 Wで30秒の停止時間を30秒間隔、2分間氷上で細胞を超音波処理してください。
3. 可溶性および不溶性タンパク質画分を分離し、慎重にニッケルアフィ​​ニティークロマトグラフィーのための上清を除去するために20分18,000 rpmで溶解した細胞をスピンダウンします。
4. のNi - NTA（ニッケル - ニトリロ三酢酸）25 mMトリス、pH 7.5、10％グリセロール、0.5 MのKCl、15mMのイミダゾール、5mMのβ-メルカプトエタノール、および0.1mMのPMSF及びベンズアミジンを含むバッファーでカラムを平衡化する。
5. 樹脂を介して上清をロードし、フロースルーを収集する。
6. すべての残留と非特異的に結合したタンパク質を除去するために25mMのトリス、pH 7.5、10％グリセロール、500mMのKClを、15mMのイミダゾール、5mMのβ-メルカプトエタノール、および0.1mMのPMSFを含む緩衝液でカラムを洗浄。
7. 15のイミダゾール勾配を用いてNi - NTAレジンの溶出Tcは TERT - 300 mMのとSDS PAGE分析のために3 mlの画分を集めた。
8. どの分画が Tc TERTの蛋白質が含まれているかを判断し、アミコン30kDaの（ミリポア）フィルタにこれらの画分を濃縮するためにPAGE分析を使用してください。
9. ボリュームをさらに精製するために以下10mlにTcは TERTの分画を集中。
10. Tcは TERTは、さらに25 mMトリス、pH 7.5、10％グリセロール、500mMのKClを、および1mMのDTTを含む緩衝液で予め平衡化陽イオン交換カラム（HSポロス、Applied Biosystems社）で精製される。
11. HSポロスのカラム上のタンパク質ミックスをロードし、すべての蛋白質と核酸の汚染物質を除去するために、それを洗う。
12. 残りの汚染物質を除去するためにKClを700ミリメートルに続いて500mMのKClを含む緩衝液でカラムを洗浄。
13. 1 M KClをバッファーでHSポロスの列からのTc TERTの蛋白質を溶出させる。この時点で、蛋白質は、純粋な99％以上でなければなりません。
14. スーパーデックス- 200サイジングカラム（サイズ排除クロマトグラフィー - GEヘルスケア）を介して蛋白質を渡すことによって、任意のタンパク質の凝集物を除去、25mMのトリス、pH 7.5、10％グリセロール、500mMのKClを、および1 mM TCEPを含有する緩衝液で予め平衡化。

3。コクヌストモドキカブトムシの文化

1. T. castaneumは、最初に博士S.ブラウン、生物学、カンザス州立大学の部門別の贈り物として提供されている場所カブトムシ。
2. スタートT.小麦粉の28.5グラムと乾燥パン酵母1.5gを使ってコンテナに百成人カブトムシを追加することによってcastaneumの文化。
3. 生殖と成長を可能にするために3〜4週間室温で、暗い、湿気のある環境でカブトムシの文化を保存する。湿度の高い環境を確保するためにカブトムシの記憶領域内に水を入れたビーカーを置きます。
4. RNAの分離の必要に応じて、カブトムシの幼虫を収穫。残りの幼虫は同じ文化の中でそれらを維持、大人に成熟することができます。
5. 毎月、彼らの食糧供給を補充するために新鮮な小麦粉や酵母を含む新しいフラスコに最も活発なカブトムシを（数百を超えない）に転送。

（4）T. castaneumトータルRNA分離

1. 大人のカブトムシや小麦粉/酵母培養液から、それらを分離することにより培養物から収穫20カブトムシの幼虫（各文化は500から1000まで幼虫の間に含まれている必要があります）。それらを粉砕する前にカブトムシに接続された小麦粉や酵母粒子を除去する。
2. ベンチエリア、モルタル、およびカブトムシを研削する前にリボヌクレアーゼのすべてのトレースを削除するRNaseZap（Ambion社、（株））で、この手順で使用する乳棒を（同様に手袋を扱う考慮）滅菌する。
3. 乳鉢と乳棒とtを用いて微粉末に液体N ₂中の幼虫を挽く粉は抽出緩衝液が追加されるまで凍結とどまることを保証するために液体N _2を維持しながら、50 ml遠心チューブにパウダーをケース温度。
4. 過剰な液体N _2は、粉体から蒸発することができます。液体N _2が蒸発した後、25mMトリス- HClを含む抽出緩衝液200μl（20カブトムシの幼虫あたり）、5mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEGTA、0.1 mMのベンズアミジン、200mMのKClを、10のカブトムシの粉末を均質化％グリセロール、RNasinの10mMイミダゾールおよび20U、pH7.5および30分間氷上でインキュベートする。
5. 4℃で20分間15,000 rpmでホモジネートを遠心° Cは、上清とフラッシュを集めて液体N ₂でサンプルを凍結する。必要に応じて、サンプルは-80℃で一晩保存することができます。
6. RNeasyミニキット（キアゲン）を用いてトータルRNAを抽出する。

5 Triboliumのcastaneumのテロメラーゼの in vitro再構成で

1. T.50μlと組換えHisタグTcは TERTの20μgを混ぜる25mMのトリス- HCl、200mMのKClを、10％グリセロール、5mMのβ-メルカプトエタノール、及び10mMのイミダゾール、pH7.5を含む結合バッファーでcastaneumトータルRNA。
2. 22℃で2時間トータルRNAの混合物° T.のC - TC TERTをインキュベートRNA分解を防ぐために、RNasin阻害剤の存在下でcastaneumライセート 。
3. ライセート不純物や余分なRNAを除去するためのNi - NTAカラムにコンプレックスを清める。

6。テロメラーゼリピート増幅プロトコール（TRAP）アッセイ

1. のNi - NTA精製T.4μgのを混ぜて50μlの伸長緩衝液中のcastaneumのテロメラーゼが20mMを含むトリス- HCl（pH - 8.3）、7.5 mMのMgCl _2、63 mMの塩化カリウム、0.05％ツイーン20、1mMのEGTA、0.01％BSA、0.5 mMのdNTPsを、1μMのTCAS - TS DNAプライマー（5' - AAGCCGTCGAGCAGAGTC - 3'）、および30℃混合物をインキュベート℃で60分間、再構成されたTでTCAS - TSのDNAプライマーの伸長を可能にするcastaneumのテロメラーゼ。
2. 反応混合物にフェノールクロロホルムの等量を追加することにより、細長い一本鎖DNA（ssDNAを）抽出する。エマルジョンが均質になるまで静かに混合物を振る。
3. 4℃で5分間12,000 rpmでサンプルを遠心° Cは、汚染物質からssDNAを分離する。
4. 1.5mlのエッペンドルフチューブにサンプルの上部の水層を移し、10mMのNaOAc（pH5.0）を最終濃度、MgCl ₂を1mMの、そして66.4パーセントエタノール、その後-20℃で一晩を沈殿させるために、サンプルを可能にするを追加° C.
5. 4℃で30分間15,000 rpmでサンプルをスピン° Cをペレット沈殿のssDNAに。ピペッターを使用してソリューションをデカントし、サンプルから、残りのNaOAc及びMgCl _2を洗浄するためにサンプルに70％エタノール200μlを加える。再ペレットサンプルに同じ速度と温度で5分間サンプルを遠心分離します。
6. ピペッターを使用してEtOH溶液をデカントし、エッペンドルフチュー​​ブが3分間、室温で開いてインキュベートすることにより、エタノールの残りのトレースを削除。サンプル中のエタノールの存在を持つことは、PCR増幅のステップに干渉します。
7. 10mMトリス- HCl（pH8）に、50mMの塩化カリウム、2mMのMgCl _2、100μMのdNTPを（dATPを含むPCR反応緩衝液50μlのssDNAのペレットを（テロメラーゼ細長い製品とTCA - TSプライマーを含む）再懸濁しdGTPおよび^{dTTP）、10μM[32} P] dCTPを、1μMのTCAS - CXのプライマー（5' - GTGTGACCTGACCTGACC - 3'）および1.25 UのTaq DNAポリメラーゼ。
8. PCRは、12％ポリアクリルアミドゲル上に表示されるように、テロメラーゼの伸長製品（94℃30秒、50℃30秒、72℃で1分間の29サイクル）を増幅する。
9. 前のPCRサンプルを実行するために、30分間44.5 mMトリス、44.5 mMのホウ酸、1mMのEDTA、pHが8を含むトリス - ホウ酸- EDTA（TBE）を実行してバッファーを持つ12％のゲルを事前に実行してください。事前に実行し、PCR反応でゲルをロードした後、摂氏または氷上で4℃で1.5〜2時間、185ボルトで泳動する。
10. ゲルを乾燥させ、活動を可視化する蛍光体イメージングプレートを使用してください。

7。代表的な結果：

サイズ排除クロマトグラフィー後の精製Tcは TERTの例を図2に示されています。精製後の濃縮タンパク質を12％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で実行されており（図2A）、純粋な99％以上であることが示されている。サイズ排除（S200）クロマトグラムは、純度や精製されたタンパク質試料からの凝集性の欠如を証明する（図2B）が用意されています。最終的な収率が変化するものの、すべての精製工程が完了した後に5 mgのタンパク質の収量は、通常、得られる。

再構成されたTの代表的なのTRAPアッセイ以前Mitchellらによって報告されたcastaneumのテロメラーゼを図3に示されています^。12。テロメラーゼの製品の段階的なラダーはしかし、レーン1で見ることができます彼らは、レーン2とそれぞれ3内に含まれるRNase処理テロメラーゼとTERT活性部​​位変異体（D251A）サンプルの両方には存在しない。

図1。組換えTcは TERTの再構成に必要な手順のフローチャート 。最初に、組換えTcは TERTは、E.で過剰発現され大腸菌 。タンパク質は、ニッケル、陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。 T. castaneumのカブトムシは、家の中で培養され、その幼虫は、トータルRNAを分離するために使用されています。精製Tcは TERTとトータルRNAを再構成するテロメラーゼRNP複合体を混合し、その後のTRAPアッセイは、RNP複合体が活性テロメラーゼであることを確認するために使用されます。

図2。 Tcは TERTの蛋白質のサイズ排除クロマトグラムとSDS PAGE分析。サイズ排除クロマトグラフィー後のTcは TERTの蛋白質の（A）12％SDS -ポリアクリルアミドゲル。それが高い等電点（pI - 9.8）があるため、Tcは TERTの蛋白質（70 kDa）はSDS PAGEゲル上で高速に移行されます。Tcは TERTの蛋白質の（B）サイズ排除クロマトグラム（スーパーデックスS200）。

図3。 in vitroでのTRAPアッセイは、コクヌストモドキのテロメラーゼは、Mitchellらから適応再構成^12。レーン1：野生型Tcは TERTとカブトムシの幼虫から単離した全RNA。レーン2：野生型Tcは TERTとRNaseは、幼虫のトータルRNAと細胞抽出物を処理した。レーン3：活性部位変異体のTc TERT（D251A）とカブトムシの幼虫の合計の幼虫のRNA。

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ディスカッション

ここで紹介する方法はT.の触媒サブユニットの大量の製造を可能にする構造的および生化学的研究のための水溶性、アクティブなフォームでcastaneumのテロメラーゼTERT。 Tcは TERTの過剰発現の方法は、上記のものから、温度や細胞密度の微妙な変化に敏感で、飛躍的にタンパク質の発現レベルに影響を与える可能性があります。具体的には、光学密度が600nmで0.5に到達する前...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
ロゼッタ（DE3）pLysSを細胞	Novagen社	70956
2YTスープ	Teknova	Y0215
IPTG	ゴールドのバイオテクノロジー	I2481C
MISONIXソニケーター3000	Qsonica、LLC。
AKTA清浄FPLC	GEライフサイエンス
のNi - NTA Superflowレジン	キアゲン	30410
アミコンウルトラ- 15遠心フィルターデバイス	ミリポア	UFC903008
POROS 50 HS強陽イオン交換パッキ​​ング	アプライドバイオシステムズ	1-3359-06
POROS 50 HQ強陽イオン交換パッキ​​ング	アプライドバイオシステムズ	1-2559-06
スーパーデックス200 300分の10サイズ排除カラム	GEライフサイエンス	17-5175-01
フェノール：クロロホルム：10mMのトリス、pHを8、1mMのEDTAとイソアミル25:24:1	シグマ	P3803 - 100mLの
RNaseZap	アンビオン	AM9780
組換えRnasinのリボヌクレアーゼインヒビター	プロメガ	N251B
RNeasyミニキット	キアゲン	74104
DNAオリゴヌクレオチド	統合されたDNAの技術