활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

요약

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT의 절연 (대한 방법을 제시 TC TERT)와 활성의 reconstitution T. castaneum telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한 체외에서.

초록

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT (TC TERT)의 분리 및 활성 T.의 reconstitution에 대한 방법을 제시 체외에서 castaneum의 telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한.

Telomerase는 엔드 - 투 - 엔드의 융합과 파괴로부터 그들을 보호하기 위해 제공 선형 염색체 ^2의 3 '끝에 telomeres라는 짧은 DNA의 반복을, 추가 전문 역방향 transcriptase ^1입니다. DNA 복제에 따라, 짧은 세그먼트는 염색체 ^3의 끝에와 telomerase없이 손실, 세포는 결국 자신의 헤이 플릭 한계 ^4에 도달하기 전까지 나누어 진행합니다. 또한, telomerase는 성인에서 가장 체세포 ⁵ 휴면이지만, 그것이 세포 영생에게 ⁷ 증진 암세포 ⁶ 활성화됩니다.

효소의 촉매 subunit와 템플릿 TERT가 telomeres ^8,9를 합성하는 데 사용하는 포함하는 필수적인 RNA 구성 요소 (터)를 구성되어 단백질 subunit (TERT) : 최소한의 telomerase 효소는 두 핵심 구성 요소로 구성되어 있습니다. 이전 2008 개별 telomerase 도메인에 대해서만 구조는 ^10,11을 해결했다. 이 분야에 주요 돌파구는 활성 ¹² 결정 구조의 결정, T.의 촉매 subunit에서 온 castaneum의 telomerase, TC TERT ^1.

여기서는 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 적극적인, 용해 TC의 TERT, 그리고 telomerase 활동 assays에 대한 체외에서 telomerase의 RNP 복합 reconstitution의 대량 생산을위한 방법을 제시한다. 사용된 실험 방법의 개요는 그림 1에 표시됩니다.

프로토콜

1. 재조합 TC TERT의 표현

1. TEV cleavable N - 터미널로 합성 TC TERT 플라스미드를 포함하는 (DE3) 로제타 변환 pLysS 세포 여섯 신선한 접시에서 2YT 미디어 6 패 (6 X 2 L은 각 2YT 국물 1 L를 포함 Erlenmeyer의 Flasks들을 당황하게)를 예방 hexahistidine - 태그.
2. 37 세포를 성장 ° C 0.5-0.6의 OD _600-220 rpm으로 흔들어 동안.
3. 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도.
4. 30 온도를 감소 ° C, 150 RPM에 떨고 천천히, 그리고 세포가 4-5 H. 위해 단백질을 표현하는 수
5. 4 원심 분리하여 세포를 수확 ° C 30 분 3,500 RPM.
6. 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 0.5 M KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM phenylmethyl sulphonyl 불화 (PMSF)와 benzamidine를 포함하는 버퍼의 20 ML 각 1 패 세포 펠렛을 Resuspend.
7. 플래시 고정 천천히 각 드롭 액체 N ₂ 미치는 영향에 멈추도록 액체 질소로 가득 50 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 세포를 흘리지하여 세포 혼합물을 resuspended. -80에서 냉동 세포를 보관 ° C 단백질 정화 준비까지.

2. TC TERT의 정화

1. 액체 일관성 때까지 실온에서 해동 세포에 도달 후 sonication을 위해 얼음 금속 비커로 이동합니다.
2. 30초 권력의 약 51 W에서 일시 중지 30 초 간격으로 2 분 얼음에 세포를 Sonicate.
3. 가용성과 불용성 단백질 분수를 별도 조심스럽게 니켈 친화성 크로마 토그래피를위한 뜨는을 제거 20 분 18,000 rpm으로 lysed 세포를 스핀 다운.
4. 니켈 - NTA (니켈 - nitrilotriacetic 산성) 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 0.5 M KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM PMSF 및 benzamidine를 포함하는 버퍼로 열을 평형.
5. 수지 위에 뜨는을로드하고를 통해 흐름을 수집합니다.
6. 모든 잔류 및 비 특별히 바운드 단백질을 제거하는 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM PMSF를 포함하는 버퍼로 컬럼을 씻으십시오.
7. Elute TC 15 이미다졸 그라데이션을 사용하여 니켈 NTA 수지의 TERT - 300 MM 및 SDS 페이지 분석을위한 3 ML 분수를 수집합니다.
8. 어떤 분수가 TC TERT의 단백질을 포함하고 결정하고 Amicon 30 KDA (Millipore) 필터에 분수 집중 PAGE 분석을 사용합니다.
9. 볼륨 더 정화를 위해 미만 10 ML에 TC TERT의 분수를 집중.
10. TC TERT은 더욱 양이온 교환 컬럼 (HS poros, 응용 Biosystems) 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM의 KCl, 1 MM의 DTT를 포함하는 버퍼로 사전 equilibrated을 통해 정화됩니다.
11. HS poros 칼럼에있는 단백질 믹스를로드하고 모든 단백질과 핵산의 오염 물질을 제거하기 위해 그것을 씻으십시오.
12. 남아있는 오염 물질을 제거하는 KCl 700 MM 500 MM 다음의 KCl을 포함하는 버퍼로 컬럼을 씻으십시오.
13. 1 M KCl 버퍼와 HS poros 칼럼에서 TC TERT의 단백질을 Elute. 이 시점에서 단백질 이상 99% 순수해야합니다.
14. Superdex - 200 크기 조정 칼럼 (크기 배제 크로마 토그래피 - GE 헬스케어) 위에 단백질을 통과하여 단백질 집계를 제거, 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM KCl, 1 MM의 TCEP를 포함하는 버퍼로 사전 equilibrated.

3. Tribolium castaneum 비틀 문화

1. T. castaneum 처음 박사 S. 브라운, 생물 학부, 캔사스 주립 대학에서 선물로 제공 어디 딱정벌레.
2. 시작 T. 밀가루의 28.5 g, 말린 베이커의 효모 1.5 g과 컨테이너 백 성인 딱정벌레를 추가하여 castaneum 문화.
3. 상온에서와 3~4주에 대한 어두운, 습한 환경에서 저장 충 문화 재생산 및 성장 수 있도록. 습한 환경을 보장하기 위해 충 저장 영역에 물이 들어있는 비커를 놓습니다.
4. 로 RNA 분리에 필요한 충 유충을 수확. 나머지 애벌레 같은 문화에서 그들을 유지, 어른 성숙한 수 있습니다.
5. 매월, 그들의 식량 공급을 보충하기 위해 신선한 밀가루와 효모를 포함하는 새로운 플라스크에 가장 적극적으로 딱정벌레를 (더 이상 수백 이상) 전송.

4. T. castaneum 총 RNA 분리

1. 성인 딱정벌레와 밀가루 / 효모 문화를 분리하여 문화에서 수확 20 충 유충 (각 문화가 500-1000 애벌레 사이에 포함되어야합니다). 밀가루하거나 분쇄하기 전에 딱정벌레에 연결된 효모 입자를 제거합니다.
2. 벤치 지역, 박격포 및 딱정벌레를 분쇄하기 전에 ribonucleases의 모든 흔적을 제거하는 RNaseZap (앰비온 주식 회사)이 절차에 사용된 유봉을 (물론 장갑을 치료 고려) 소독.
3. 절구와 유봉과 T를 사용하여 미세 분말로 액체 N _2에 애벌레를 갈다추출 버퍼가 추가 때까지 가루가 냉동 유지하도록 액체 N _2를 유지하면서 50 ML의 원심 분리기 튜브에 분말 ransfer.
4. 초과 액체 N ₂ 분말에서 증발 수 있습니다. 액체 N ₂ 증발 후, 25 MM 트리스 - HCL, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올, 1 MM EGTA, 0.1 당연 benzamidine 200 MM KCl, 10를 포함하는 추출 버퍼 200 μl의 충 분말 (20 충 유충 당) 균질 %의 글리세롤, 30 분 얼음 RNasin, 산도 7.5과 부화 10 MM 이미다졸 및 20U.
5. 4 20 분 동안 15,000 rpm으로 homogenate를 원심 ° C는 뜨는와 플래시를 수집하는 액체 N _2의 샘플을 동결. 필요한 경우, 샘플은 -80 ° C 하룻밤에 저장할 수 있습니다.
6. RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출합니다.

Tribolium의 castaneum의 telomerase 5.에서는 체외의 reconstitution

1. T. 50 μl와 재조합 그의 - TC 태그 TERT 20 μg 믹스 25 MM 트리스 - HCL, 200 MM KCl, 10 % 글리세롤, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올, 10 MM 이미다졸, 산도 7.5를 포함하는 바인딩 버퍼에 castaneum 총 RNA.
2. 22 두 시간 동안 총 RNA 혼합물 ° T.에 C - TC TERT을 품어 RNA 저하를 방지하기 위해 RNasin 억제제의 존재에 castaneum의 lysate.
3. lysate 불순물 및 과도한 RNA를 제거하는 니켈 - NTA 칼럼을 통해 복잡한 정화.

6. Telomerase의 반복 증폭 프로토콜 (트랩)는 assays

1. 니켈 - NTA 정화 T. 4 μg를 섞어 50 μl 신장 버퍼에 castaneum의 telomerase 20 MM를 포함 트리스 - HCL (산도 - 8.3), 7.5 MM MgCl _2, 63 MM KCl, 0.05 % 트윈 20, 1 ㎜ EGTA, 0.01 % BSA, 0.5 MM의 dNTPs, 1 μm의 Tcas - TS DNA 프라이머 (5' - AAGCCGTCGAGCAGAGTC - 3 '), 그리고 60 분 ° C의 재구성 T.하여 Tcas - TS의 DNA 프라이머의 연신율을 허용하는 30 혼합물을 품어 castaneum의 telomerase.
2. 반응 혼합물을 페놀 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하여 길쭉한 단일 좌초된 DNA (ssDNA)을 추출합니다. 유제가 균질는 부드럽게 될 때까지 섞은 쉐이크.
3. 4 5 분 동안 12,000 rpm으로 샘플을 원심 ° C는 오염 물질의 ssDNA 분리 수 있습니다.
4. 1.5 ML eppendorf 튜브에 샘플의 정상 수성 층을 전송, 10 MM NaOAc (산도 5.0)의 최종 농도, MgCl ₂ 1 ㎜와 66.4 % EtOH 후 -20에서 하룻밤을 촉진하기 위해 샘플을 허용을 추가 ° C.
5. 4 삼십분을 위해 15,000 RPM에서 샘플을 스핀 ° C를 펠렛 시켰던 ssDNA 수 있습니다. pipettor를 사용하여 솔루션을 가만히 따르다 다음 예제에서 남은 NaOAc 및 MgCl ₂ 씻어 샘플을 70 % EtOH 200 μl를 추가합니다. 다시 펠렛 샘플에 동일한 속도와 온도에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기.
6. pipettor를 사용하여 EtOH 솔루션을 가만히 따르다하여 eppendorf 튜브 세 분 상온에서 열 부화함으로써 에탄올의 남은 흔적을 제거합니다. 예제에서 에탄올 선물 것은 PCR의 증폭 단계에 방해가됩니다.
7. 10 MM 트리스 - HCL (산도 8), 50 MM KCl, 2 MM MgCl _2, 100 μm의 dNTPs를 (dATP, 포함하는 PCR 반응 버퍼의 50 μl의 ssDNA 펠렛을 (telomerase 길쭉한 제품과 Tcas - TS의 프라이머를 포함) Resuspend dGTP 및 dTTP), 10 μm의 ^[32 P] dCTP, 1 μm의 Tcas - CX 프라이머 (5' - GTGTGACCTGACCTGACC - 3 ')와 1.25 U DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소.
8. PCR들은 12 % polyacrylamide 젤에서 볼 수 있도록 telomerase의 연신율 제품 (94 ° 30 초 동안 C, 50 ° 30 초 동안 C, 72 ° C에 대한 일분의 29 사이클)을 증폭.
9. 트리스 - Borate - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TBE)이 44.5 MM 트리스, 44.5 MM 붕산, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 서른 분 산도 8 전에 PCR 샘플을 실행하기를 포함하는 버퍼를 실행과 함께 12 % 젤을 미리 실행합니다. 사전 실행 및 PCR 반응으로 젤로드 후, 섭씨 또는 얼음에 4 명이에서 1.5-2 시간 동안 185 볼트에서 젤을 실행합니다.
10. 젤 건조하고 활동을 시각화하기 위해 형광체 이미징 플레이트를 사용합니다.

7. 대표 결과 :

크기 배제 크로마 토그래피 후 정화 TC TERT의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 정제 후 농축 단백질은 12% SDS - polyacrylamide 젤에서 실행되며 순수 이상 99% (그림 2A)로 표시됩니다. 크기는 제외 (S200) 크로마토 그램은 또한 순수와 정화 단백질 샘플에서 집계 부족을 설명하기 (그림 2B) 제공됩니다. 최종 생산량은 달라질 수 있지만 완료된 모든 정화 단계 후 5 MG 단백질의 수율은 보통 얻어진다.

재구성 T.에 대한 대표적인 함정 분석 이전 미첼 외 의해 보고된로 castaneum의 telomerase는 그림 3에 표시됩니다. ^12. telomerase 제품의 단계 현명한 사다리는하지만, 레인 1에서 볼 수있다그들은 차선이 각각 3 RNase 취급 telomerase 및 TERT 활성 사이트에 돌연변이 (D251A) 샘플 모두에 결석하고 있습니다.

그림 1. 재조합 TC TERT의 reconstitution에 관련된 단계 플로우 차트. 첫째, 재조합 TC TERT는 E. 언덕에 표시됩니다 대장균. 단백질은 다음 니켈, 양이온 교환 및 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 정화됩니다. T. castaneum 딱정벌레는 집안에 교양하고 그들의 애벌레는 총 RNA를 분리하는 데 사용됩니다. 정화 TC TERT와 총 RNA는 다음 reconstitute telomerase의 RNP 단지를 혼합하고 있으며, 후속 트랩 분석이 RNP 복합을 확인하는 데 사용되는 것은 활성 telomerase입니다.

그림 2. TC TERT 단백질의 크기 제외 크로마토 그램 및 SDS 페이지 분석. 크기 배제 크로마 토그래피 후 TC TERT 단백질의 (A) 12% SDS - polyacrylamide 젤. 그것이 높은 isoelectric 포인트 (PI - 9.8)를 가지고 있기 때문에 TC TERT 단백질 (70 KDA)는 SDS 페이지 젤에 신속하게 마이 그 레이션합니다. TC TERT의 단백질 (B) 사이즈 제외 크로마토 그램 (Superdex S200).

그림 3. 체외에의 트랩 assays는 Tribolium castaneum의 telomerase가 미첼 외에서 맞게 재구성. ^12. 레인 1 : 야생 타입 TC TERT와 총 RNA는 벌레의 유충으로부터 격리. 레인 2 : 야생 유형 TC TERT와 RNase는 애벌레의 총 RNA와 세포 추출물을 처리. 레인 3 : 활성화된 사이트의 돌연변이 TC TERT (D251A)와 벌레의 유충의 총 애벌레의 RNA.

토론

여기서 제시하는 방법은 T.의 촉매 subunit의 대량 생산을 허용 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 가용성, 적극적인 형태로 castaneum의 telomerase의 TERT. TC TERT 통해 표현의 방법은 위에서 언급한 이들의 온도 또는 셀 밀도에 미묘한 변화에 민감하고 극적으로 단백질 표현의 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 특히, 우리는 광학 밀도가 600 나노미터에서 0.5에 도달하기 전에 단백질 발현을...

자료

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NI - NTA의 Superflow 수지	Qiagen	30,410
Amicon 울트라 - 15 원심 필터 장치	Millipore	UFC903008
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Superdex 200 3백분의 10 사이즈 - 제외 칼럼	GE 생명 과학	17-5175-01
페놀 : 클로로포름 : 10mM 트리스, 산도 8, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 Isoamyl 25:24:1	시그마	P3803 - 100mL
RNaseZap	앰비온	AM9780
재조합 Rnasin의 Ribonuclease 억제제	Promega	N251B
RNeasy 미니 키트	Qiagen	74,104
의 DNA oligonucleotides	통합 DNA 기술