High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

Zusammenfassung

Rapide steigende Bereichen wie der Systembiologie, erfordert die Entwicklung und Umsetzung neuer Technologien, so dass High-Throughput-und High-Fidelity-Messungen von großen Systemen. Mikrofluidik verspricht viele dieser Anforderungen erfüllen, wie zum Beispiel die Durchführung High-Throughput-Screening-Experimenten auf dem Chip, umfasst biochemischer, biophysikalischer und Zell-basierte Assays ^1. Seit den frühen Tagen der Mikrofluidik-Geräten, hat dieses Feld drastisch entwickelt, die zur Entwicklung von mikrofluidischen large-scale integration ^2,3. Diese Technologie ermöglicht die Integration von Tausenden von mikromechanischen Ventilen auf einem einzigen Gerät mit einem Porto-sized Fußabdruck (Abbildung 1). Wir haben einen hohen Durchsatz mikrofluidischen Plattform zur Erzeugung in vitro Expression von Protein Arrays (Abbildung 2) genannt PING (Protein Interaction Network Generator) entwickelt. Diese Arrays können als Template für viele Versuche dienenwie ^{Protein-Protein-4,} Protein-RNA ⁵ oder Protein-DNA-Wechselwirkungen ^6.

Das Gerät besteht aus Tausenden von Reaktionskammern, die individuell programmiert werden mit einer Microarrayer. Ausrichten dieser gedruckten Mikroarrays Mikrofluidik Vorrichtungen Programme jede Kammer mit einer einzigen Stelle eliminiert potentielle Kontamination oder Kreuzreaktivität Außerdem Erzeugen Mikroarrays unter Verwendung von Standard-Mikroarray Spotting Technik ist auch sehr modular, so dass für die Ordnungsabschnitt von Proteinen ^{7, 8} DNA, kleine Moleküle, und sogar kolloidalen Suspensionen. Die möglichen Auswirkungen der Mikrofluidik auf biologischen Wissenschaften ist signifikant. Eine Reihe von Mikrofluidik basierte Assays wurden bereits neue Einblicke in die Struktur und Funktion von biologischen Systemen vorgesehen und der Bereich der Mikrofluidik weiter Biologie beeinflussen.

Protokoll

Ein. Vorrichtung Fabrication

1. Gekaufte DTPA-D SU-8-Steuerung Schimmel und SPR220-7-Flow Form aus dem Stanford Microfluidics Foundry ( www.stanford.edu / group / Gießerei ).
2. Setzen Sie die Silikonformen zum Chlortrimethylsilan (TMCS) Dampf für 10 min bis Elastomer Release Nach dem Backen die Schritte ⁹ zu fördern.
3. Vorbereitung einer Mischung aus Silikon basierenden Elastomer und Härtungsmittel (gut mischen) in zwei verschiedenen Verhältnissen 5:1 und 20:1 für die Kontrolle und Strömung Schimmelpilze sind. Die unterschiedlichen Verhältnisse sind die für eine einwandfreie Verklebung von mehreren Schichten.
4. Gießen Sie die 5.01 PDMS über die Kontrolle Schicht (ca. 5 mm Höhe). Degas die Kontrolle Schicht und backen für 30 min bei 80 ° C. Schleuderbeschichten (Laurell, USA) die 20.01 PDMS-Gemisch auf die Strömung Schicht bei 2600 UpM für 60 Sekunden und dann backen bei 80 ° C für 30 min. Die Spin Coater Geschwindigkeit zur Ansteuerung des Ventils bei einem Druck optimiertvon 15 psi. Schneller drehenden wird in einer dünneren Schicht mit niedrigerem Druck und Aktivierung umgekehrt. Die Geräte verwenden wir eine Grenze von 25 psi in der Kontrollgruppe und 10 psi in Strömungsrichtung vor dem Ablösen vom Substrat auftreten können.
5. Trennen die Steuerschicht aus der Form. Machen Sie es langsam und vorsichtig sein, nicht schälen SU8 Muster. Dann schneiden die Vorrichtung um seinen Umfang und Stanzlöchern die Steuerkanäle zu übersetzen.
6. Richten Sie den Fluss und die Kontrolle Layer manuell unter einem Stereoskop. Beginnen Sie mit dem Ausrichten der oberen linken Ecke, die Schaltfläche Ventil (Control Layer) muss in der Mitte der Reaktionskammer (flow Schicht) sein. Danach richten Sie die erste Zeile und sanft die Steuerung freigeben Schicht Zeile für Zeile. Sicherstellen, dass alle Ventile Taste in der Mitte der Reaktionskammern sind und dass die Adresse und Einlaßventile kreuzen die Strömungskanäle in der korrekten Position. Das Verfahren kann vor Ort wiederholt werden, bis alle Reihen ausgerichtet sind. Am Ende, lassen Sie jede Spannung in der PDMS by heben Sie ihn vorsichtig von den Seiten und Ecken. Heben Sie nicht zu viel oder Versatz auftreten.
7. Backen für 2 Stunden bei 80 ° C.
8. Cut um den Umfang der Vorrichtung und Schale der beiden Schicht-Vorrichtung (Chip) aus dem Strom Form. Lochen, um die Strömungskanäle (Abbildung 1) zugreifen.

2. DNA Anordnen und Device Alignment

1. Produzieren synthetischer Gene durch Montage PCR. Die synthetischen Gene sind aus T7-Promotor, Ribosomenbindungsstelle (RBS), ORF mit zwei Epitop-Tags (eine an jedem Ende), und T7-Terminator ⁴ komponieren. Die Gene können in der Länge von 100 bp bis zu variieren, zumindest, 5,000 bp.
2. Bereiten Sie die synthetischen Gene zum Anordnen: Ausarbeitung einer Mischung aus Poly Ethylen Glykol (1,25%) und D-Trehalosedihydrat (125 mg / ml) und verzichten 2 ul pro Reaktion in 384 Vertiefungen Platte. Diese Lösung wird irreversible Bindung der DNA an die Glas sowie zur Visualisierung während der Ausrichtung ^{10 zu} reduzieren.
3. Übertragen Sie die synthetischen Gene an die 384 Wells Platte. Normalerweise DNA Konzentrationen von 10 ng / ul bis 100 ng / ul Endkonzentration reichen. Hinzufügen dH ₂ O auf ein Endvolumen von 20 ul (abhängig Microarrayer und Pin-Typ).
4. Spot eine Reihe von synthetischen Genen auf Epoxy beschichtete Glassubstrate mit einem Microarray. Wir verwenden MicroGrid 610 (Bio Robotics) mit SMT-S75 Silikon-Pins (Parallel Synthesis, USA). Kontaktieren des DNA-Druckverfahren, mit diesen speziellen Stiften, resultiert in Spots mit einem Durchmesser von etwa 100 um auf der Glasoberfläche. Jeder Pin Last reicht für ca. 100 Plätze. Stellen Sie sicher, dass die Spalte und Zeile Stellplätze auf den spezifischen Gerät verwendet entsprechen. Das Gerät, das wir verwenden, enthält 16 Spalten und 40 Reihen mit einem Abstand von 680 um durch 320 &mgr; m.
5. Manuelle Ausrichtung des mikrofluidischen Vorrichtung zur Gen-Array unter einem Stereoskop. Die DNA-Spot sollte in der Mitte der Kammern DNA sein. Beginn der Angleichung, indem Sie die erste Zeile von Punkten below die erste Reihe von DNA-Kammern. Dann, in Einklang zu bringen die restlichen Zeilen Schlichten mit Feinabstimmung des gesamten Gerätes. Sobald das Array ausgerichtet ist darauf zu achten, um eine Belastung in der PDMS lindern, durch Anheben lokal werden. Wenn es Spannungen in der PDMS es kann nicht gut auf dem Mikroarray verlassen.
6. Schließlich Bindung des Geräts an den Glasobjektträger durch Inkubation über Nacht auf einer Heizplatte bei 80 ° C

3. Grundierung und Gerät aktivieren

1. Die Ventile in der Steuerungsschicht werden vom Computer mittels LabVIEW betätigt. Die LabVIEW-Skript steuert eine Reihe von Magneten Mikroventile über ein elektronisches Steuergerät (erworben von Stanford Microfluidics Foundry). Das Magnetventil Verteiler mit Druckluft, die den Luftstrom und Druck in die Steuerventile an der Vorrichtung steuern.
2. Schließen Sie das Gerät an die Magnetventile Verteiler mit einem flexiblen Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,02 "(Tygon) Und Edelstahl-Stift (New England Small Tubes Corporation).
3. Füllen Sie die Röhrchen mit DDW und stecken Sie den Stift in die Zugang Löcher der Steuerungsebene. Sicherstellen, dass jedes Rohr an seinen entsprechenden Steuerkanal angeschlossen ist.
4. Führen Sie die LabVIEW-Anwendung auf dem Computer, um die Steuerkanäle aktivieren. Durch die Aktivierung des Ventils aus der LabVIEW-Skript, wenden wir Luftdrucks, die wiederum das Wasser in die PDMS-Steuerung Kanäle schieben. Stellen Sie den Luftdruck bis 5 psi. Es wird empfohlen, die "Sandwich" und die Adresse Ventilen ersten füllen, um cross-Gespräche zwischen Steuerkanäle defekte Geräte zu identifizieren. Im Falle eines Cross-Talks, wird die Betätigung der "Sandwich"-Steuerleitung mit der Betätigung entweder des Halses oder Taste Steuerleitungen führen. Dies ist ähnlich wie bei einem Kurzschluss in einer elektrischen Schaltung. Ein Gerät mit Übersprechen ist defekt und kann nicht verwendet werden.
5. Nachdem alle Kanäle und Ventile voll von DDW sind, werden die Ventile grundiert und ready die Strömungskanäle unter ihnen zu blockieren. Erhöhen Sie den Luftdruck bis 15 psi. Ventilansteuerung wird aus einer LabVIEW-Programm durch einen Satz von Ein / Aus-Schalter verbunden ist, um einzelnen Magnetventile gesteuert. Jeder Schalter steuert eine spezielle Steuerleitung durch die entsprechende Magnetventil. Einschalten der Schaltknopf (im Skript) gilt Luftdruck in dem entsprechenden Rohr. Der Luftdruck wird die DDW in der Steuerleitung schieben und wird in den Ausbau der mikrofluidischen Ventilen führen, die Blockierung der Kanal unterhalb. Ausschalten ein Regelventil, löst den Luftdruck und anschließend loslassen Blockierung des jeweiligen Strömungskanal.
6. Um sicherzustellen, dass alle Ventile offen sind, einen Schlauch mit einem der Eingänge und Strömung Strömung Luft in die Vorrichtung bei 4-5 psi. Dies setzt keine klebrige Ventile aus dem Glasträger.
7. Schließlich wird das Gerät grundiert und bereit. Alle schließen die Eingabe und "Hals"-Ventile, um die Oberflächenchemie starten.

4. Surface Chemistry

1. Um die Selbstorganisation eines Protein-Arrays auf der Oberfläche zu erleichtern und zu verhindern, unspezifische Adsorption innerhalb der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Oberfläche chemisch modifiziert:
2. Um eine Komponente durch die Vorrichtung fließen, schließen ein neues Rohr mit der erforderlichen Lösung für eines der Strömungskanäle in der Vorrichtung. Verbinden Sie das freie Seite des Rohres in der Bedienungsanleitung vielfältig und öffnen Sie den Luftdruck Flow (5 psi).
3. Legen Sie 40 ul Biotinylated-BSA (1 ug / ul) in ein neues Röhrchen und fließen etwa die Hälfte davon für 20 min durch das Gerät wird die BSA zu dem Epoxid Oberfläche binden.
4. Verwenden Hepes (50 mM) zum Waschen unreagierten Substrats zwischen jeder der verschiedenen Schritte Oberflächenchemie.
5. Flow 25 ul Strepavidin (0,5 ug / ul) für 20 min auf der Oberseite des biotinylierten BSA.
6. Waschen mit Hepes für 5 min.
7. Schließen Sie die "Taste" Ventil und fließen den Rest des biotinylierten-BSA (wie beschrieBett oben), Passivierung der Oberfläche rund um die Taste.
8. Waschen mit Hepes für 5 min.
9. Lassen Sie die "Taste" Ventil und Flow 30 ul penta-His-Biotin (0,16 ug / ul) für 20 min. Der Antikörper wird an den exponierten Strepavidin binden; spezifisch an die Fläche unter der "Taste" Erzeugen eines anti-His-Tag-Array.

5. Proteinexpression

1. Drücken die Proteine ​​auf dem Gerät mit Kaninchen-Retikulozyten schnelle gekoppelten Transkription und Translation Reaktion. Proteinexpression von den gefleckten synthetischer Gene auf dem Gerät erstellt ein Array von Proteinen einsatzbereit. Beispielsweise ist eine solche Verwendung für eine Proteinbindung Bildschirm.
2. Öffnen die "Hals"-Ventile und Durchfluss Kaninchenretikulozyten praktischen gekoppelte Transkription und Translation Reaktion durch die Vorrichtung in die DNA Kammer. Als nächstes schließen Sie die "Sandwich"-Ventile und trennen Sie die einzelnen Gens von seiner Umgebung. Inkubieren der Vorrichtung auf einer heißen Platte für 2,5 h bei 30 ° C. Expressed proteins wird von der DNA-Kammer in die Reaktionskammer spontan (Hals Ventil offen) und Binden an den Anti-His-Antikörper diffundieren unter der "Taste" Ventil Immobilisieren des Proteins über seinen C-Terminus-Tag.
3. Beschriften Sie die Proteine ​​mit C-myc Cy3 Antikörper. Der Antikörper wird auf seiner entsprechenden Epitop auf dem Protein N-Terminus lokalisiert binden.
4. Bestimmen Proteinexpression Ebenen mit einem Microarray-Scanner (LS Reloaded, Tecan) mit einem 532-nm-Laser und 575 nm Emission Filter.

6. Repräsentative Ergebnisse

Ein. Vorrichtung Fabrication

Ein Grafik-Design für das Gerät wurde von AutoCAD auf der Grundlage unserer experimentellen Anforderungen erstellt. Die Konstruktion wurde auf eine transparente Folie von einer hochauflösenden Bildeinstelleinrichtung gedruckt. Diese Transparenz dient als Photomaske in Berührung Photolithographie. Eine Oberflächen-Mikromechanik-Technik wurde verwendet, um 3-D-Templates auf einem Silizium-Wafer, der durch die Muster auf t eingeschrieben bestimmt erstellenEr Masken verwendet.

Die Mikrofluidik-Vorrichtung wurde am Silikonform hergestellt Gießen Silikonelastomer Polydimethylsiloxan (PDMS, SYLGARD 184, Dow Corning, USA) (Abbildung 1). Jede Vorrichtung besteht aus zwei ausgerichteten PDMS Schichten, die Strömung und die Hemmschicht. Die Form wurde zum ersten Mal Chlortrimethylsilan (TMCS, Aldrich) Dampf für 10 min zu Elastomer-Freisetzung nach den Backschritte Förderung ausgesetzt. Ein Gemisch aus Silikon basierenden Elastomer und Härtungsmittel wurde in zwei unterschiedlichen Verhältnis 5:1 und 20:1 für die Kontrolle und Strömung Formen, jeweils hergestellt. Die Steuerungsschicht wurde entgast und für 30 min bei 80 ° C. Die Strömung Schicht wurde zunächst aufgeschleudert (Laurell, USA) bei 2600 UpM für 60 Sekunden gebacken und bei 80 ° C für 30 min. Die Steuerung Schicht wurde aus seiner Form getrennt und Steuerkanal Zugang Löcher wurden ausgestanzt. Als nächstes wurden die Fluss und Steuerschichten manuell unter einem Stereoskop ausgerichtet bedeckt und für 2 Stunden bei 80 ° C. Die zweischichtige Gerät wurde f geschältrom die Strömung Schimmel und Strömungskanäle Zugang Löcher gestanzt.

2. Device Description

Die Vorrichtung Kapazität von 500 bis 10.000 Einheitszellen (Abbildung 2) reichen. Das Gerät besteht aus zwei Schichten, von strömenden Schicht (grau) und Control Layer (Farbe). Die Steuerungsschicht enthalten eine Vielzahl von Ventilen mit unterschiedlichem Funktion. Jede Einheitszelle in Strömungsrichtung Schicht wird von einem DNA und eine Reaktionskammer zusammengesetzt und wird durch drei Typen von mikromechanischen Ventilen gesteuert wird; "Hals", "Taste", und "Sandwich" (Abbildung 2A). Ein gefleckter 'synthetischen Gens' abgeschieden innerhalb der DNA-Kammer wird von der Reaktionskammer durch den "Hals" Ventil (grün) blockiert. Einfangen und mechanischen Waschen von Oberfläche gebundenen Proteine ​​in der Reaktionskammer wird durch den "Tasten"-Ventil (blau) durchgeführt. Die "Sandwich"-Ventil ermöglicht jede Reaktion in einer eigenen Einheitszelle (rot) auftreten. Die Adresse Ventile aufgeteilt das Gerät bis zu 8 unabhängigen Abschnitten, für different Zustand Assay. Darüber hinaus enthalten die Steuerschicht Eingang Ventile, die den Fluss des Fluids in den ausgewählten Strömungsschicht aktivieren. Die PDMS Steuerkanäle sind voll mit DDW. Wenn ein Ventil der Druckanstieg wird betätigt (15 psi) führt zur Ausdehnung des PDMS. Dort, wo die Membran ausreichend dünn ist (dh Überschreiten der Kontrolle und Fließlinien) ist dies ausreichend, um vollständig die Strömungsleitung. Durchschnittliche Elementarzelle beträgt 10 um, und die durchschnittliche Zellvolumen beträgt weniger als 1 nl.

3. Proteine ​​Expression und Nachweis

Die Proteine ​​wurden auf dem Gerät mit Kaninchen-Retikulozyten schnelle gekoppelten Transkription und Translation Reaktion (Promega) ausgedrückt. Die Expression der Proteine ​​erzeugt eine Reihe von Proteinen bereit für den Einsatz in einem verbindlichen (Abbildung 3). Ein Ausdruck Mix (12,5 ul) wurde in das Gerät geladen und dann in die DNA geflutet Kammern durch Öffnen der "Hals"-Ventile. Als nächstes wurden die "Sandwich"-Ventilengeschlossen Verlassen jede Einheitszelle von ihren benachbarten Zellen und der Vorrichtung getrennt auf einer heißen Platte für 2,5 h bei 30 ° C inkubiert Exprimierten Proteine ​​durch das Gen Kammer in die Reaktionskammer, wo ihren C-Terminus His tag binden die Anti-His-Antikörper (Qiagen) unter der "Taste" Ventil Immobilisieren des Proteins auf der Oberfläche lokalisiert könnte diffundiert. Proteine ​​wurden mit einem C-myc Cy3 (Sigma), das zu seinem entsprechenden Epitop auf dem Protein N-Terminus lokalisiert gebunden und markiert sie markiert ist. Protein-Expressionsniveaus wurden mit einer Mikroarray-Abtastvorrichtung (LS Reloaded, Tecan) unter Verwendung eines 532-nm-Laser und 575 nm-Filter bestimmt. Das resultierende Protein-Array besteht aus unterschiedlichem Proteinexpression. Üblicherweise scheitern etwa 20% einer Genbank zu nachweisbaren Mengen exprimieren. Keine Korrelation mit Größe des Proteins wurde ³ beobachtet. Hintergrund wurden unter Verwendung Kammern, die nicht mit DNA wurden gesichtet. Somit sind Signale aus den entsprechenden Kammern Proteins aufgrund entweder noise oder unspezifische Adsorption der Markierung von Antikörpern.

Abbildung 1. Chipfertigungstechnologie. (A) Formen wurden mit TMCS Dämpfe für 10 min behandelt. (B) PDMS basiert auf Kontrolle und Flow Silikonformen gegossen. (C) Beide Steuerung und Flow Formen werden in 80 ° C für 30 min gebacken. (D) Die Steuerung Schicht der Form geschält, geschnitten, um Größe und Steuereingänge gestanzt. (E) Das Control-Schicht ist mit dem Strömungsschicht unter einem Stereoskop ausgerichtet und dann in 80 º C für 2 Stunden. Parallel zur PDMS Bauelementherstellung wird eine Reihe von synthetischen Genen auf Epoxy beschichtete Glassubstrate (CEL Associates) microarrayed. (F) Die Vorrichtung wird dann mit der DNA-Mikroarray Einfangen der 'synthetische Gene' innerhalb der DNA Kammern ausgerichtet sind.

Abbildung 2. Ein Foto des PING Device. (A) Das Gerät consist von zwei aligned PDMS Schichten (Steuerung und Durchfluss). Der Fluss Schicht enthält parallel DNA und Reaktionskammern (grau) mit mikromechanischen Ventilen ("button", "sandwich" und "Hals") in der Kontrollgruppe Schicht gesteuert. (B) Die Schichten werden auf einer gedruckten Microarrays, die Programme, die jeweils DNA Kammer mit einem einzigen Punkt ausgerichtet. Dadurch entfällt eine mögliche Verunreinigung.

Abbildung 3. Fluoreszierende Bilder eines Protein-Arrays mit einem Mikrofluidik-Chip erstellt. Die bedruckten Stelle Gene wurden mit Proteinen innerhalb der Vorrichtung (in der DNA-Kammer) ausgedrückt und wurden bis auf die Oberfläche gezogen wird (unterhalb der "Button", das in der Reaktionskammer) durch ihre C-Terminus His-Tag. Proteinexpression wurde unter Verwendung ihrer C-myc-Tag N-Terminus und einer spezifischen fluoreszierenden Antikörper. Unterschiedlichen Signalintensitäten zeigen unterschiedliche Proteinexpression Ebenen. Un-spotted Kammern dienten als Kontrollen für Hintergrund levels.

Diskussion

In diesem Papier stellen wir eine Methode zur Erzeugung Protein-Arrays im High-Throughput mit einer mikrofluidischen Plattform. Das Array Generation ist auf Microarray Bedrucken von DNA-Matrizen und in vitro-Proteinexpression von der DNA innerhalb der Mikrofluidik-Vorrichtung basiert.

Unser neuartiger Mikrofluidik-Plattform hat mehrere wichtige Vorteile gegenüber derzeit verwendeten Methoden, die es zu einem vielversprechenden und allgemeines Werkzeug für die Proteomik zu machen. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz / Equipment	Firma	Katalog-Nummer
PDMS-SYLGARD 184	Dow Corning USA	ESSEX-DC
Chlortrimethylsilan (TMCS	Sigma-Aldrich	C72854
Epoxy beschichtete Glassubstrate	CEL Associates USA	VEPO-25C
Poly Ethylen Glykol (PEG)	Sigma-Aldrich	81260
D-Trehalosedihydrat	Sigma-Aldrich	T9531
Biotinyliert-BSA	Durchstechen	PIR-29130
Neutravidin	Durchstechen	31050
penta-His-Biotin	Qiagen	34440
Hepes	Biological Industries	03-025-1B
TNT-T7	Promega	L5540
C-myc-Antikörper Cy3	Sigma-Aldrich
Kontrollkästchen	Stanford Microfluidics Foundry
Form	Stanford Microfluidics Foundry
Merken	New England Small Tubes Konzern
Tygon microbore Schlauch	Tygon	S-54-HL
Microarrayer	Bio Robotics	MicroGrid 610
Silikon Stifte	Parallel SynThese	SMT-S75