High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Riepilogo

Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.

Abstract

Campi in rapida crescita, come la biologia dei sistemi, richiedono lo sviluppo e l'applicazione di nuove tecnologie, per misure ad elevata capacità e ad alta fedeltà dei sistemi di grandi dimensioni. Microfluidica promette di soddisfare molte di queste esigenze, ad esempio per eseguire esperimenti di high-throughput screening di on-chip, che comprende saggi biochimici, biofisici, e cellulare ^1. Poiché i primi giorni di dispositivi microfluidici, questo campo è drasticamente evoluta, portando allo sviluppo di microfluidica larga scala di integrazione ^2,3. Questa tecnologia consente l'integrazione di migliaia di valvole micromeccanici su un unico dispositivo con una affrancatura dimensioni footprint (Figura 1). Abbiamo sviluppato un high-throughput piattaforma microfluidica per la generazione di espressione in vitro di allineamenti della proteina (Figura 2) nome PING (Protein Interaction Network Generator). Queste matrici possono servire come modello per molti esperimenticome proteina-proteina ^4, proteina-RNA ⁵ o proteina-DNA ⁶ interazioni.

Il sistema consiste di migliaia di camere di reazione, che sono individualmente programmati utilizzando un micro-distributore. Allineamento di questi microarray stampati a dispositivi di microfluidica programmi di ciascuna camera con un solo punto eliminando potenziale contaminazione o cross-reattività, inoltre, la generazione di microarray utilizzando tecniche standard di microarray avvistamento è molto modulare, che consente di formare gli array di proteine ​​DNA ^{7, 8,} piccole molecole, e anche sospensioni colloidali. Il potenziale impatto di microfluidica nel campo delle scienze biologiche è significativo. Un certo numero di saggi basati microfluidica già fornito intuizioni nuove nella struttura e funzione dei sistemi biologici, e il campo di microfluidica continueranno a incidere biologia.

Protocollo

1. Dispositivo Fabrication

1. Acquistato DTPA-D SU-8 stampo controllo e SPR220-7 flusso stampo dal Microfluidica Stanford Fonderia ( www.stanford.edu / group / fonderia ).
2. Esporre gli stampi in silicone per clorotrimetilsilano (TMCS) vapore per 10 minuti per promuovere il rilascio elastomero dopo i passi di cottura ^9.
3. Preparare una miscela a base di elastomeri di silicone e l'agente reticolante (mescolare bene) in due diversi rapporti 5:1 e 20:1 per il controllo di flusso e stampi, rispettivamente. I diversi rapporti sono necessari per il legame corretto di strati multipli.
4. Versare il 05:01 PDMS sul livello di controllo (circa 5 mm di altezza). Degassare il livello di controllo e cuocere per 30 min a 80 ° C. Coat Spin (Laurell, USA) la miscela 20:01 PDMS sullo strato flusso a 2.600 rpm per 60 sec e poi cuocere a 80 ° C per 30 min. La velocità rivestitore a rotazione è ottimizzata per l'azionamento della valvola a pressionedi 15 psi. Veloci filatura si tradurrà in uno strato sottile con pressione di attivazione inferiore e viceversa. I dispositivi che utilizziamo hanno un limite di 25 psi nel controllo e 10 psi nel flusso, sopra il quale distacco dal substrato.
5. Separare il livello di controllo dallo stampo. Fallo lentamente e fare attenzione a non sbucciare il modello SU8. Poi tagliare il dispositivo attorno al suo perimetro e fori di perforazione per accedere ai canali di controllo.
6. Allineare il flusso e livelli di controllo manualmente in uno stereoscopio. Avviare allineando l'angolo superiore sinistro, il pulsante di valvola (livello di controllo) deve essere al centro della camera di reazione (strato di flusso). Quindi, allineare la prima fila e delicatamente rilasciare il livello di controllo riga per riga. Assicurarsi che tutte le valvole di pulsante sono al centro delle camere di reazione e che le valvole di ingresso e di indirizzo attraversare i canali di flusso nella posizione corretta. Il processo può essere ripetuto fino localmente tutte le righe sono allineate. Alla fine, decontratturante nel b PDMSy sollevandolo con cura dai lati e gli angoli. Non sollevare troppo o disallineamento possono verificarsi.
7. Cuocere per 2 ore a 80 ° C.
8. Tagliare lungo il perimetro del dispositivo e il dispositivo buccia due strati (chip) dallo stampo flusso. Perforare per accedere ai canali di flusso (Figura 1).

2. DNA formare gli array e allineamento del dispositivo

1. Produrre geni sintetici di gruppo del PCR. I geni sintetici sono comporre di promotore T7, sito di legame di ribosoma (RBS), ORF con due tag epitopi (uno ad ogni estremità), e terminatore T7 ^4. I geni possono variare in lunghezza da 100 bp a, almeno, 5000 bp.
2. Preparare i geni sintetici per formare gli array: preparare una miscela di etilene glicole poli (1,25%) e D-trealosio diidrato (125 mg / ml) ed erogare 2 microlitri per reazione in 384 pozzetti della piastra. Questa soluzione ridurrà legame irreversibile del DNA per il vetro e per visualizzazione durante allineamento ^10.
3. Trasferire i geni sintetici alla piastra a 384 pozzetti. Solitamente concentrazioni di DNA può variare da 10 ng / pl a 100 ng / pl concentrazione finale. Aggiungi dH ₂ O ad un volume finale di 20 microlitri (dipende dal tipo di micro-distributore e pin).
4. Spot di una serie di geni sintetici su substrati di vetro con rivestimento epossidico con un micro-distributore. Usiamo microgrid 610 (Bio Robotica) con SMT-S75 perni in silicone (sintesi parallela, USA). Contattare la stampa del DNA, con questi pin specifici, i risultati in macchie con diametro di circa 100 micron sulla superficie del vetro. Ogni carico pin è sufficiente per circa 100 posti auto. Assicurarsi che i campi riga e di colonna coincidere con il dispositivo utilizzato. Il dispositivo che usiamo contiene 16 colonne e 40 righe con un passo di 680 micron per 320 micron, rispettivamente.
5. Manualmente allineare il dispositivo a microfluidi alla matrice gene sotto uno stereoscopio. Lo spot DNA dovrebbe essere al centro delle camere di DNA. Avviare l'allineamento individuando la prima fila di punti below la prima fila di camere di DNA. Poi, ravvicinare il resto delle righe finitura con regolazione fine dell'intero dispositivo. Una volta che l'array è allineato occorre prestare attenzione per alleviare qualsiasi stress nel PDMS, sollevandola localmente. Se vi è tensione lasciato nel PDMS non possono legarsi bene al microarray.
6. Infine, il dispositivo di vincolo al vetrino da incubazione per una notte su una piastra calda a 80 ° C.

3. Adescamento e attivazione del dispositivo

1. Le valvole del livello di controllo sono azionati dal computer utilizzando LabVIEW. Lo script LabVIEW controlla una serie di elettrovalvole micro tramite una centralina elettronica (acquistato da Stanford Microfluidica Foundry). Il collettore elettrovalvola è collegata ad aria compressa, che controllano il flusso d'aria e la pressione nelle valvole di controllo del dispositivo.
2. Collegare il dispositivo al collettore elettrovalvole utilizzando un tubo flessibile di plastica con diametro interno di 0,02 "(Tygon) E spillo in acciaio inox (New England piccoli tubi Corporation).
3. Riempire i tubi con DDW e inserire il perno nei fori di accesso del livello di controllo. Assicurarsi che ogni tubo è collegato al suo canale di controllo corrispondente.
4. Eseguire l'applicazione LabVIEW sul computer per attivare i canali di controllo. Attivando la valvola dallo script LabVIEW, si applica pressione dell'aria, che a sua volta spingere l'acqua nei canali di controllo PDMS. Impostare la pressione dell'aria a 5 psi. Si raccomanda di riempire il 'sandwich' e le valvole primo indirizzo, al fine di individuare incrociati colloqui tra canali di controllo di dispositivi difettosi. In caso di cross-colloqui, attuazione della linea di 'sandwich' di controllo comporterà l'azionamento o al collo o linee di controllo pulsante. Questo è simile a un corto in un circuito elettrico. Un dispositivo con cross-talk è difettoso e non può essere utilizzato.
5. Dopo che tutti i canali di controllo e le valvole sono pieni di DDW, le valvole sono preparati e Ready per bloccare i canali di flusso sotto di loro. Aumentare la pressione dell'aria a 15 psi. Attivazione della valvola è controllata da un programma LabVIEW attraverso una serie di on / off switch collegati a singole elettrovalvole. Ogni interruttore controlla una specifica linea di comando attraverso la elettrovalvola corrispondente. Accendere l'interruttore (nello script) si applica pressione dell'aria nel tubo corrispondente. La pressione dell'aria spingerà la DDW nella linea di comando e provocherà espansione delle valvole microfluidica, bloccando il canale sottostante. Spegnere una valvola di controllo, riduce la pressione dell'aria e successivamente rilasciare il blocco del canale rispettivo flusso.
6. Per garantire che tutte le valvole sono aperte, collegare un tubo ad uno degli ingressi di flusso e il flusso d'aria nel dispositivo al 4-5 psi. Questo rilascerà le eventuali valvole appiccicose dal vetrino.
7. Infine, il dispositivo è innescata e pronta. Chiudere tutti gli input e 'collo' valvole, per avviare la chimica di superficie.

4. Superficie Chimica

1. Per facilitare l'auto-assemblaggio di una matrice proteica sulla superficie e prevenire adsorbimento non specifico all'interno del dispositivo microfluidico, la superficie è modificata chimicamente:
2. Un componente di fluire attraverso il dispositivo, collegare un tubo nuovo con la soluzione richiesta ad uno dei canali di flusso del dispositivo. Collegare il lato libero del tubo al collettore manuale e aprire il flusso di pressione dell'aria (5 psi).
3. 40 pl di caricare biotinilato-BSA (1 mg / mL) in una nuova provetta e flusso di circa la metà per 20 min attraverso il dispositivo, la BSA si legano alla superficie epossidica.
4. Utilizzare Hepes (50 mM) per il lavaggio del substrato non reagito tra ciascuna delle diverse fasi chimica di superficie.
5. Flusso 25 Strepavidin pl (0,5 pg / pl) per 20 min in cima alla biotinilato-BSA.
6. Lavare con Hepes per 5 min.
7. Chiudere la valvola di 'pulsante' e scorrere il resto del biotinilato-BSA (come descrittoletto sopra), la passivazione della superficie intorno al pulsante.
8. Lavare con Hepes per 5 min.
9. Rilasciare la valvola 'pulsante' e flusso 30 ml di penta-His-biotina (0,16 mg / mL) per 20 min. L'anticorpo si legherà alla strepavidin esposta; specificamente per l'area sotto il 'pulsante' la creazione di un anti His-tag matrice.

5. L'espressione della proteina

1. Esprimere le proteine ​​sul dispositivo utilizzando coniglio reticolociti rapida trascrizione accoppiata e la reazione di traduzione. L'espressione proteica dai geni maculate sintetiche sul dispositivo crea una matrice di proteine ​​pronte per l'uso. Per esempio, un tale uso è per uno schermo legame proteico.
2. Aprire il 'collo' valvole e coniglio trascrizione flusso reticolociti rapido accoppiato e la reazione di traduzione attraverso il dispositivo nella camera di DNA. Quindi, chiudere le valvole di "sandwich" e separare ogni gene dal suo ambiente. Incubare il dispositivo su una piastra calda per 2,5 ore a 30 ° C. Espresso proteins diffonderà dalla camera di DNA alla reazione spontanea camera (collo valvola è aperta) e si legano al suo anticorpo anti-sotto la valvola 'pulsante' immobilizzare la proteina attraverso il suo C-terminale tag.
3. Etichettare le proteine ​​con C-myc anticorpo Cy3. L'anticorpo si lega al suo epitopo corrispondente trova alla proteina N-terminale.
4. Determinare i livelli di espressione della proteina con un scanner per microarray (LS Reloaded, Tecan) utilizzando un laser a 532 nm e 575 nm di emissione del filtro.

6. Risultati rappresentativi

1. Dispositivo Fabrication

Disegno grafico del dispositivo è stato creato da AutoCAD in base alle nostre esigenze sperimentali. Il disegno è stato stampato su una pellicola trasparente da una alta risoluzione setter immagine. Questa trasparenza serve come fotomaschera in contatto fotolitografia. Una tecnica di surface micromachining stato usato per creare modelli 3-D su un wafer di silicio determinato dai modelli incisi su tegli maschere utilizzate.

Il dispositivo microfluidico è stato fabbricato in silicone stampo di colata elastomero siliconico polidimetilsilossano (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, USA) (Figura 1). Ogni dispositivo è costituito da due strati allineati PDMS, il flusso e lo strato di controllo. Lo stampo è stato mostrato clorotrimetilsilano (TMCS, Aldrich) vapore per 10 min per promuovere il rilascio elastomero dopo le fasi di cottura. Una miscela di elastomero a base di silicone e catalizzatore è stato preparato in due diverso rapporto 5:1 e 20:1 per il controllo di flusso e stampi, rispettivamente. Lo strato di controllo è stata degassata e cotto per 30 min a 80 ° C. Lo strato flusso inizialmente rivestita per centrifugazione (Laurell, USA) a 2.600 rpm per 60 sec e cotto a 80 ° C per 30 min. Lo strato di controllo è stato separato dal suo stampo e di controllo di accesso al canale fori sono stati perforati. Successivamente, gli strati di flusso e di controllo sono stati allineati manualmente in uno stereoscopio e cotto per 2 ore a 80 ° C. I due dispositivo di strato è stato pelato from lo stampo flusso e canali di flusso di accesso fori sono stati perforati.

2. Descrizione periferica

La capacità del dispositivo può variare da 500 fino a 10.000 celle unitarie (Figura 2). Il dispositivo è costituito da due strati: strato di flusso (grigio) e lo strato di controllo (colore). Lo strato di controllo contiene una serie di valvole con funzione diversa. Ciascuna cella unitaria, nello strato di flusso, è composto da un DNA e una camera di reazione e viene controllata da tre tipi di valvole micromeccanici; 'collo', 'pulsante', e 'sandwich' (Figura 2A). 'Gene sintetico' A maculato depositato all'interno della camera di DNA è bloccato dalla camera di reazione dalla valvola 'collo' (verde). Lavaggio cattura e meccanica di proteine ​​di superficie associati in camera di reazione viene eseguita dalla valvola 'pulsante' (blu). La valvola di 'sandwich' permette ad ogni reazione avvenga in una cella propria unità (rosso). Le valvole di indirizzo può dividere il dispositivo fino a 8 sezioni indipendenti, per different condizione di test. Inoltre, il livello di controllo contengono valvole di ingresso che permettono il flusso di fluido selezionato nello strato flusso. I canali di controllo PDMS sono pieni di DDW. Quando una valvola viene azionata l'aumento di pressione (15 psi) provoca l'espansione del PDMS. In luoghi dove la membrana è sufficientemente sottile (cioè attraversamento di comando e linee di flusso) è sufficiente a bloccare completamente la linea di flusso. Media altezza cella unitaria è di 10 micron, e il volume medio cella unitaria è inferiore a 1 nl.

3. Proteine ​​Espressione e di rilevamento

Le proteine ​​sono state espresse sul dispositivo utilizzando coniglio reticolociti rapida trascrizione accoppiati e reazione traduzione (Promega). L'espressione delle proteine ​​creato un array di proteine ​​pronti per l'uso in una schermata vincolante (Figura 3). Un mix di espressione (12,5 pl) è stato caricato nel dispositivo e quindi allagato nelle camere di DNA aprendo le valvole di 'collo'. Poi, i "sandwich" valvole eranochiusa lasciando ciascuna cella unitaria separato dalle cellule vicine e il dispositivo è stato incubato su una piastra calda per 2,5 ore a 30 ° C. Proteine ​​espresse diffusi attraverso la camera gene nella camera di reazione, dove il loro C-terminale His potrebbe impegnare la sua anti-anticorpo (Qiagen) localizzata sotto la valvola 'pulsante' immobilizzare la proteina alla superficie. Le proteine ​​sono state marcate con un C-myc Cy3 (Sigma), che legato al suo epitopo corrispondente trova alla proteina N-terminale ed etichettato esso. Livelli di espressione di proteine ​​sono state determinate con uno scanner microarray (LS Reloaded, Tecan) utilizzando un laser a 532 nm e 575 nm filtro. La matrice risultante proteina consiste di diversi livelli di espressione della proteina. Solitamente, circa il 20% di una libreria genica non esprimono a livelli rilevabili. Alcuna correlazione con dimensioni proteina è stata osservata ^3. Livelli di fondo sono stati determinati utilizzando camere che non sono stati macchiati con il DNA. Pertanto, i segnali dalle camere proteine ​​corrispondenti sono dovuti a noise o adsorbimento non specifico degli anticorpi etichettatura.

Figura 1. Fabbricazione di chip. (A) stampi sono stati trattati con vapori TMCS per 10 min. (B) PDMS è colato sul controllo e stampi in silicone flusso. (C) Sia il controllo di flusso e stampi, cotta a 80 ° C per 30 min. (D) Il livello di controllo dello stampo pelati, tagliati a misura e ingressi di controllo sono un pugno. (E) Il livello di controllo è allineato al livello del flusso sotto uno stereoscopio e poi cotto in 80 ° C per 2 h. In parallelo alla fabbricazione del dispositivo PDMS, una serie di geni sintetici sono microarrayed su substrati di vetro rivestita epossidica (Associates CEL). (F) Il dispositivo viene quindi allineato al DNA microarray intrappolando i geni "sintetici" all'interno delle camere di DNA.

Figura 2. Una foto del dispositivo PING. (A) Il dispositivo consist di due strati allineati PDMS (controllo e di flusso). Lo strato di flusso contiene parallele camere di DNA e reazione (grigio) controllati da valvole micromeccanici ("bottone", "panino" e "collo") nel livello di controllo. (B) Gli strati sono allineati ad un microarray stampati, quali programmi ciascuna camera di DNA con un singolo punto. Ciò elimina qualsiasi potenziale contaminazione.

Figura 3. Le immagini fluorescenti di una matrice di proteina creata con un chip. Microfluidic I geni in loco stampate sono state espresse le proteine ​​all'interno del dispositivo (nella camera di DNA) e sono stati tirati fino alla superficie (sotto la valvola "bottone" nella camera di reazione), attraverso la loro C-terminale la sua tag. Espressione della proteina è stata rilevata utilizzando il loro C-myc N-terminale tag e uno specifico anticorpo fluorescente. Intensità di segnale diverse indicano diversi livelli di espressione della proteina. Un-spotted camere servito come controlli per sfondo levels.

Discussione

In questo articolo presentiamo un metodo per la generazione di matrici proteiche ad alto rendimento che utilizzano una piattaforma microfluidica. La generazione matrice si basa sulla stampa microarray di DNA e modelli in vitro espressione della proteina dal DNA nel dispositivo microfluidico.

La nostra nuova piattaforma microfluidica ha diversi importanti vantaggi rispetto ai metodi attualmente in uso, che lo rendono uno strumento promettente e generale per la proteomica. Un vantaggi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo
PDMS-SYLGARD 184	Dow Corning USA	ESSEX-DC
Clorotrimetilsilano (TMCS	Sigma-Aldrich	C72854
Substrati di vetro con vernice epossidica	CEL Associates USA	VEPO-25C
Poli etilene glicole (PEG)	Sigma-Aldrich	81260
D-trealosio diidrato	Sigma-Aldrich	T9531
Biotinilato-BSA	Perforare	PIR-29130
Neutravidina	Perforare	31050
penta-His-biotina	Qiagen	34440
Hepes	Industrie biologici	03-025-1B
TNT-T7	Promega	L5540
C-myc Cy3 anticorpo	Sigma-Aldrich
Scatola di comando	Stanford microfluidica Fonderia
Stampo	Stanford microfluidica Fonderia
Pin	New England piccoli tubi Corporation
Tygon microbore tubo	Tygon	S-54-HL
Micro-distributore	Bio Robotica	Microgrid 610
Silicone pin	Parallel Syntesi	SMT-S75