Die Analyse der RNA-Prozessierung Reaktionen mit Handy Free Systems: 3 &#39;Ende Spaltung von prä-mRNA-Substrate<em&gt; In-vitro-</em

Zusammenfassung

RNA-Polymerase II synthetisiert eine Vorläufer-RNA, die über das 3'-Ende der reifen mRNA erstreckt. Das Ende der reifen RNA cotranscriptionally über die Endonuklease-Aktivität der Spaltungskomplex erzeugt wird, an einer Stelle, die durch RNA-Sequenzen bestimmt. Hier haben wir detailliert die Methode, um Spaltungsreaktionen in vitro zu studieren.

Zusammenfassung

Das 3'-Ende von Säuger mRNAs nicht durch abrupte Abbruch der Transkription durch RNA-Polymerase II (RNPII) ausgebildet ist. Stattdessen synthetisiert RNPII Vorläufer-mRNA über das Ende des reifen RNAs, und ein aktiver Prozess, der Endonuklease-Aktivität wird an einer bestimmten Stelle erforderlich. Die Spaltung der Vorläufer-RNA tritt normalerweise 10-30 nt stromabwärts von der Konsens polyA-Stelle (AAUAAA), nachdem die CA-Dinukleotide. Proteine ​​aus der Spaltungskomplex eine multifaktorielle Protein-Komplex von etwa 800 kDa, erfüllen diese spezifischen Nuklease-Aktivität. Spezifische RNA-Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts von der polyA-Stelle steuern die Einstellung der Spalt komplex. Unmittelbar nach der Spaltung werden prä-mRNAs durch die Poly-A-Polymerase (PAP) polyadenyliert zu produzieren stabile RNA-Nachrichten zu reifen.

Verarbeitung von dem 3'-Ende eines RNA-Transkripts können unter Verwendung von Zellkernextrakten mit spezifischen radioaktiv markierten RNA-Substrate untersucht. In Summe ein lang ^{32 <}/ Sup> P-markierten ungespaltenen Vorläufer RNA wird mit Kernextrakten in vitro inkubiert und Spaltung wird durch Gelelektrophorese und Autoradiographie untersucht. Wenn der richtig Spaltung auftritt, eine kürzere 5 'gespalten Produkt nachgewiesen und quantifiziert. Hier beschreiben wir die Spaltungstest im Detail, wobei als ein Beispiel, das den 3'-End-Verarbeitung von HIV-1 mRNAs.

Einleitung

Die Biosynthese der meisten reifen eukaryotischen Nachricht RNAs (mRNAs) erfordert mehrere posttranskriptionale Modifikationen wie Capping, Spleißen und Polyadenylierung. Diese Modifikationen sind in der Regel gekoppelt ist, um eine korrekte Verarbeitung ¹ zu gewährleisten und die Stabilität der mRNA stark erhöhen.

Das 3'-Ende die Bildung von Säuger-prä-mRNAs durch endonukleolytische Spaltung des entstehenden RNA, gefolgt von Zugabe der Adenylat-Reste an den 5 'erzeugt gespalten Produkt von Poly (A)-Polymerase (PAP) ^2-4. Bei Säugetieren ist Spaltung durch ein Mehrkomponenten-Protein-Komplex durchgeführt, von etwa 800 kDa, die auf spezifische RNA-Sequenzen vor-montiert. Die Poly (A)-Signalsequenz, eine hoch konservierte kanonische Hexanukleotidsequenz AAUAAA, leitet die Spaltstelle bei etwa 10-30 nt stromabwärts. Diese Seite ist speziell von der Spaltung und Polyadenylierung Spezifität Faktor (CPSF) und dem 73 kD-Untereinheit der anerkanntenCSPF enthält die Endonukleaseaktivität. Die Spaltung Stimulationsfaktor (CstF) bindet eine degenerierte GU-oder U-reiche Element Sequenz stromabwärts des Poly (A)-Stelle. Erforderlich für die Spaltung der Spaltungssäugerfaktor I (cfim) und die Spaltung Säugerfaktor II (CFII). Cfim bindet die spezifischen UGUA (N)-Stellen in vor-Sequenzelemente (benutzt), die für eine Reihe von Genen, die definiert wurden, und scheint in wichtige physiologische Prozesse ^5-8 einbezogen werden.

In vitro RNA-Prozessierung Reaktionen sind allgemein durch die Verwendung von radioaktiv markierten RNA-Substrate ^9-12 analysiert. Diese können durch Run-off-Transkription aus dem Bakteriophagen T7-oder SP6-Promotors synthetisiert werden. Bei der Untersuchung eine Polyadenylierungsstelle, die vorher nicht charakterisiert worden ist, ist es notwendig, um genomische DNA, anstatt cDNA zu verwenden, um das RNA-Substrat zu erzeugen, wie wichtig stromabwärts gelegenen Sequenzen in cDNA vorhanden sein könnten. Design Substrate mindestens 150 nt upstrea umfassenm und 50 nt stromabwärts von der Spaltstelle / Ende auf der reifen mRNA. Das Spaltprodukt wandert schneller als das Substrat; da jedoch andere Fragmente können durch nicht-spezifische Nuklease Aktion erzeugt werden, weist die Spezifität der Reaktion durch die Abhängigkeit von der korrekten Bearbeitung Signalfolgen überprüft werden. Daher RNA-Substrate mit einer Punktmutation in der Sequenz AAUAAA (zB AAGAAA) dienen als negative Kontrolle für die Spaltungsreaktion.

Da eine geringe Menge radioaktiv markierten RNA wird für die Spaltungsreaktionen eingesetzt wird, kann in hoher Zahl in den meisten Kernextrakten RNasen problematisch sein, und die Wahl des Ausgangsmaterials für die Extraktzubereitung beschränken. HeLa-Zellen dazu neigen, niedrige endogene RNase enthalten, und somit in diesen Assays positiv.

Die endonukleolytische Spaltung von RNA-Substrate in vivo und in vitro sofort von der Poly (A)-Additions, Do gefolgts die gespaltene Zwischen ist nicht in nachweisbaren Mengen vorhanden. Deshalb, um entweder eine bestimmte RNA-Sequenz oder Proteinen in einer Spaltungsreaktion beteiligt studieren, Experimente unter Bedingungen, die die Polyadenylierung verhindern geführt. Es gibt keine Abhängigkeit der Spaltung auf die Polyadenylierung, oder umgekehrt, so kann man Polyadenylierung, ohne die Spaltungsreaktion zu stoppen. Somit wird ATP mit einem Kettenabbruch Analogon, das die 3'-Hydroxylgruppe fehlt, so daß nur ein einzelnes Nukleotid an der Poly (A)-Stelle eingebaut werden und nur gespalten RNA nachgewiesen werden kann ersetzt.

In Anbetracht der Komplexität und hohe Besonderheit dieser Art von Assay, beschreiben wir eine detaillierte Videoprotokoll zu endonukleolytische Spaltung durch die Spaltungs / Poly (A) mRNA-Maschinen-Vorstufen in vitro zu studieren. Wir beschreiben, wie die zuständigen Kernextrakte herzustellen, erzeugen radioaktiv markierten RNA-Substrate, führen die Spaltungsreaktion und analysieren und interpretieren Sie das Ergebnisten Produkte. Fig. 1 zeigt ein Beispiel eines Substrats RNAs kodiert für das 3'-Ende des HIV-1-prä-mRNAs für eine Spaltungsassay verwendet werden. Das 3'-Ende des HIV-RNA-Genom ist von vielen wichtigen regulatorischen Sequenzen wie die Poly (A)-Stelle, einem G + U-reiche Region, und die Verwendung Element, die alle für eine effiziente Reifung der viralen mRNA-Transkripte ¹³ notwendig sind zusammen . In diesem Beispiel würden wir erwarten, dass die Eingangs RNA-Substrat auf 338 nt und 237 nt bei der Spaltung sein. Wenn Polyadenylierung durfte auftreten, würde ein Abstrich von Produkten zwischen 237 und 437 nt beobachtet werden.

Protokoll

1. Anpassung von adhärenten Zellen in Suspension

(Dies ist ein optionaler Schritt. Suspensionszellen in der Regel besser Kernextrakten jedoch Zellen in Platten gezüchtet können auch verwendet werden.)

1. Anpassung adhärenten Zellen für das Wachstum in Suspension unter Verwendung Joklik modifiziertes MEM mit 5-10% Serum von neugeborenen Kälbern oder fötalem Rinderserum und 1% L-Glutamin ergänzt: Penicillin-Streptomycin. Propagation der Zellen in Spinnerflaschen mit Filterkappe bei 37 ° C mit 8% CO _2.
2. Bei der Anpassung Zellen, beginnen Sie mit 100 ml in einem 500 ml-Spinnerflasche. Halten Sie einen Mindest 0,3 x 10 ⁶ Zellen / ml, und ersetzen Sie das Medium alle 1-2 Tage, bis die richtige Wachstumsrate erreicht wird (in der Regel 2-6 Wochen). . Einmal angepasst, sollte HeLa-Zellen in Suspension etwa alle 24 Stunden verdoppeln HINWEIS: Während der Adaptionsphase, wird es einige Zeit dauern, bis die Zellen ihre normalen Verdopplungsrate zurück.
3. Pflegen Sie die Zellen in einer Höhlesität von 0,5-0,8 × 10 ⁶ Zellen / ml in die gewünschte endgültige Volumen (typischerweise 1-10 L)
4. Die Zellen werden typischerweise in der Mitte der log-Phase (ungefähr 0,5-0,65 x 10 ⁶ Zellen / ml bzw.> 90% lebensfähig) geerntet. Verwenden Sie die entsprechende Größe Spinner-Flasche für die gewünschte Anzahl von Kulturmedien.

2. Kernextrakten

1. Buffer und Vorbereitung der Reagenzien
   HINWEIS: Extraktionen werden nach einem modifizierten Dignam et al (1983) ¹⁴ Kernextrakt Verfahren durchgeführt..
   1. Bereiten 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Puffer A, Puffer C, D und Puffer (Tabelle 1) der Tag, bevor mit Extraktionen und bei 4 ° C
      HINWEIS: Höhere Erträge sind in der Regel mit frisch zubereiteten Puffer erreicht; jedoch ist der Puffer für mehrere Wochen stabil. Es ist wichtig, dass alle Puffer, Apparaten und Anlagen vor abgekühlt und kalt für die Gesamtheit der Extraktionen gehalten sind.Verwenden Sie ein Kühlraum für so viele Schritte möglich und / oder halten alles auf Eis. In DTT und PMSF unmittelbar vor der Verwendung.
2. Das Sammeln und Waschen der Zellen
   1. Pourzellen in vier 250-ml-Erlen Flaschen und Schleudern bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C in einer Zentrifuge mit einem Schwenk-oder einem Festwinkelrotor. Dekantieren Stände und ein weiteres 250 ml Zellkulturmedium zu jeder Flasche. Wiederholen dreht, bis alle Zellen wurden pelletiert.
   2. Resuspendieren kombiniert fertigen Pellets in insgesamt 250 ml eiskaltem PBS und Pool in einem 250-ml-Erlen Flasche. Dreh die Zellen bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C in einem schwingenden Becherzentrifuge.
   3. Gießen Sie den Überstand und Zellpellet in eiskaltem PBS so das Gesamtvolumen 50 ml nicht überschreiten. Lösen des Pellets durch Pipettieren und in ein konisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. Dreh die Zellen erneut bei 500 x g für 6 Minuten bei 4 ° C in einem schwingenden Becherzentrifuge. Gießen Sie supernatant und schätzen und beachten Sie den Zellpellet Volumen (CPV) so genau wie möglich. Mit Wasser in einem gesonderten Ausgleichsrohr zum Vergleich, wenn das Pellet niedriger als die Volumenmarkierungen auf dem Rohr ist.
3. Zelllyse
   1. In DTT in Puffer A. das Pellet in Puffer A mit 5 Volumen des geschätzten CPV. Pipette, brechen die Pellets und Inkubation auf Eis für 10 min.
   2. Dreh die Zellen bei 931 × g für 10 min bei 4 ° C in einem schwingenden Becherzentrifuge.
   3. Vorsichtig den Überstand aspirieren statt Dekantieren. Das Pellet Volumen sollte etwa zwei-fach in der Größe wegen Anschwellen der Zellen erhöht.
   4. 1 CPV Puffer A zu den Zellen. Vorsichtig brechen die Pellets und entfernen Sie eine kleine Teilmenge (etwa 50 ul), um ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in eine entsprechend dimensioniert Dounce Homogenisator (in der Regel 15 ml Größe) auf Eis gekühlt.
   5. Lyse die Zellen mit 12-15 langsamen, aber stetigen Schläge von einem Typ B (tight) Stößel. Entfernen Sie eine kleine Teilmenge des Lysats und untersuchen unter einem Mikroskop für vollständige Lyse (intakte kleine dunkle Kerne im Vergleich zu geschwollenen Zellen) durch Trypanblau-Färbung. Intakte Zellen wird klar sein). Weiter Homogenisierung bis 90% Lyse erreicht wird und hier aufhören, über Douncing kann negative Auswirkungen auf die Qualität der Kernextrakten.
   6. Übertragen Lysat in ultraklaren Ultrazentrifuge Rohre und beachten Sie die Gesamtlautstärke. Ausgleich durch Wiegen der Röhrchen und Schleudern bei 1.069 × g für 10 min bei 4 ° C.
      HINWEIS: Die Ultrazentrifuge wird bei diesem Schritt trotz der niedrigen Drehgeschwindigkeit verwendet werden, da das gleiche Rohr wird mit einer höheren Geschwindigkeit in der nächsten Stufe gesponnen werden. Dieser Spin wird eine ziemlich enge Pellet für den Boden des Röhrchens mit trüber Überstand über, die gesammelt und für die cytosolischen S100-Extrakte verwendet werden können, zu erhalten. Wenn es eine sichtbare Lipidschicht auf der Oberseite des Rohres, kann er entfernt werden.
   7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und übertragen sie in Anoth.. äh Rohr Vermeiden Störung des Kernpellet HINWEIS: Es wird wichtig sein, um das endgültige Volumen der Überstand, um gepackte Atomvolumen (PNV) zu bestimmen, kennen.
4. Vorbereitung des Kernextrakt
   1. Nachdem der Überstand wurde vorsichtig entfernt, das rohe Respin Kernextrakts Pellet bei 25.453 × g für 15 min bei 4 ° C im gleichen Röhrchen.
   2. Entfernen Sie die verbleibende Überstand (es sollte eine kleine Menge klarer Flüssigkeit sein), und es auf die vorherige Überstand Sammlung hinzuzufügen. Messen das Endvolumen des Überstandes. Errechnen PNV durch Subtrahieren dieses Volumen aus dem Gesamtvolumen der ursprünglichen Lysat zuvor erwähnt. Alternativ, wenn das Pellet groß genug ist, sein Volumen kann durch Vergleich mit ähnlichen Volumen von Wasser in einem identischen Rohr geschätzt werden.
   3. 1 PNV Volumen Puffer C (etwa 1 ml / ml Zellen). Vorsichtig lösen das Pellet mit einer Pipettenspitze und übertragen in eine entsprechend sized Dounce Homogenisator. Wenn mit der gleichen Homogenisator wie vor, Vorspülen den Homogenisator mit sterilem VE-Wasser.
   4. Das Pellet mit ~ 5-10 Schläge über einen Dounce Homogenisator mit einem engen Stößel.
   5. Übertragen Sie die homogenisierte Kern Lysat in ein gekühltes Rohr und mischen durch Umdrehen für 30 min bei 4 ° C Wenn das Volumen groß genug ist, rühren mit einem Magnetrührplatte und Spin-Bar.
   6. Transfer des Lysats in eine neue Ultrazentrifugenröhrchen und drehen sich mit 25.453 × g für 30 min bei 4 ° C. Das Pellet sollte kompakt sein. Etwa 5 Minuten vor dem Spin abgeschlossen ist, Hydrat die Dialyse-Kassetten oder Schläuche, die eine entsprechende Molekulargewichtsgrenze (MWCO) haben (zB 7.000 kDa).
   7. Den Überstand (Kernextrakt) aus dem Rohr in eine gekühlte konische Röhrchen unter Verwendung einer Transferpipette dann mit Dialyse fortzufahren.
5. Dialyse
   1. Injizieren der Extrakte in hydratisierten Dialyse Kassetten pro Herstellerss Anweisungen und dialysiert die Kernextrakte in 500 ml Puffer D ₅₀ für 1 h bei 4 ° C unter Rühren.
   2. Ersetzen Sie den Puffer mit 500 ml frischem, eiskaltem Puffer D ₅₀ und Dialyse für weitere 4 Stunden bei 4 ° C Dieses 4 Stunden Schritt kann in zwei 2 Std. Veränderungen statt aufgeteilt werden.
   3. Entfernen Sie die Auszüge aus der Dialyse-Kassette und Transfer zum Kühlrohre. Dreh die Extrakte für 5 min bei 1.500 × g bei 4 ° C.
   4. Aliquot der Extrakte in gekühlt, Eppendorf-Röhrchen und Schnapp Einfrieren in flüssigem Stickstoff (50-100 ul pro Aliquot). Lagerung bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung.

3. RNA Probe Synthesis

1. Vorlage Vorbereitung
   HINWEIS: Vorlagen für die Transkription verwendet werden, können PCR-Fragmenten oder Plasmiden, die einen T7-oder SP6-Promotor stromaufwärts und unmittelbar neben der gewünschten Sondensequenz enthält. Plasmid-Vorlagen müssen hinter der Template-Sequenz von int linearisiert werdenerest. Wir haben festgestellt höhere Ausbeute von PCR-Vorlagen.
   1. Die T7/SP6 Promotor kann während der PCR-Reaktion eingesetzt werden. Entwerfen der Sense-Primer mit der T7/SP6 Promotor stromaufwärts von der Zielsequenz.
   2. Verstärken Sie die gewünschte Sequenz in 2-3 Reaktionen pro Vorlage über PCR nach Herstelleranweisung mit einem High-Fidelity-Polymerase.
   3. Kombinieren äquivalenten Reaktionen und Reinigung durch Gel-Extraktion.
   4. Sequence die PCR-Produkte auf Vorlage Richtigkeit zu überprüfen. (Optional)
2. RNA-Transkription mit ³² P Labeling
   1. Führen in vitro-Transkription von 1 ug Schablone mit einem im Handel erhältlichen Kits, die mit dem Promotor (SP6 oder T7) kompatibel mit den folgenden Modifikationen. Verwenden 1 ml frisches 3000 Ci / mmol ^[α-32 P] UTP, 0,5 ul 10 mM kalt UTP, 0,1 ul 10 mM GTP und 0,9 ul 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G-RNA Kappe in einer endgültigen Volumen von 20 ul.
      HINWEIS: Die G-Cap verbessert die Stabilität der RNA-Transkripte in Kernextrakten (Cap: GTP) im Verhältnis 10:1. Die kalte UTP zugesetzt, um die ³² P-UTP nicht der limitierende Reagenz zu verhindern.
   2. Synthese einer RNA-Leiter Größe wie oben, ohne die Kappe G bezeichnet. Gewerbe-Vorlagen sind für die Erzeugung des RNA-Größenmarker zur Verfügung.
   3. Die Transkriptionsreaktionen bei 37 ° C für 1 Stunde (bei Verwendung von SP6 40 ° C). Einmal abgeschlossen, führen DNase Verdau der Vorlage 15 min bei 37 ° C.
   4. Nach dem Verdau wird mit 1 ul 0,5 M EDTA und 5 ul Beladungspuffer II an die RNA-Substrate. In 20 ul Ladepuffer II der Markierung.
   5. Erhitzen Sie das RNA-Marker und Sonden bei 95 ° C für 3 min dann legen auf Eis.
3. Polyacrylamid-Gel-Casting / Probe Elektrophorese
   1. Herstellung von 1 l 6% Polyacrylamid-Gel (PAGE) Mischung und 400 ml 10%-PAGE. Um 6% zu machen, mischen Sie 150 ml 40% 19.01 Acrylamid: Bis-acrylamide mit 100 ml 10X Tris / Borat / EDTA (TBE) und 460 g Harnstoff. Bringt bis zu 800 ml mit sterilem VE-Wasser und rühren auf einer Heizplatte unter Anwendung niedriger Hitze (ca. 50-80 ° C). Füllen Sie auf 1 L mit VE-Wasser.
      HINWEIS: Die Reaktion ist endotherm. Erwärmen fördert die Solubilisierung der Harnstoff. Vom Herd nehmen, sobald der Harnstoff gelöst und die Lösung auf 1 L mit VE-Wasser. Alternativ rühren bei Raumtemperatur über Nacht; zu viel Hitze kann Polymerisation zu initiieren.
   2. Schützen Sie das PAGE-Mix aus Licht mit Aluminiumfolie und bei Raumtemperatur lagern. Die Seite Mischungen können vor der Zeit hergestellt werden und sind für mehrere Monate stabil.
   3. Zubereitung von 400 ml 10%-PAGE-Mischung durch Kombination von 100 ml der 40% 19.01 Acrylamid: Bis-Acrylamid, 40 ml 10x TBE und 184 g Harnstoff. Nach den Harnstoff löst, bringen bis zu 400 ml mit VE-Wasser.
      Alternativ bereiten Sie einen 20% 19.01 Acrylamid-Lösung und eine 0% Acrylamid-Lösung with Puffer und Harnstoff nur; diese können dann in einem beliebigen Verhältnis gemischt werden, um jede Prozentsatz zwischen 0 und 20% zu ergeben; Harnstoff ist immer nur langsam auflösen.
   4. Planen 10-50 ml 10% Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung in sterilem, deionisiertem Wasser in Abhängigkeit von der Anzahl der Gele gegossen werden.
   5. Mit 70% Ethanol (EtOH) waschen 20 cm x 22 cm Glas Gelplatten. Trocknen Sie mit großen fusselfreien Tüchern.
   6. Wäscht den regulären Platte mit 1 ml 5 N Natriumhydroxid (NaOH) und Nachwaschen mit 70% EtOH dann. Bestreichen Sie die Rastenplatte mit Gel abstoßen Silizieren Lösung durch Abwischen der Platte mit einer gesättigten kleine Kimwipe.
   7. Montieren der Platten, indem die regelmäßige Platte auf eine leere Pipettenspitze Box oder ein Stück Styropor, um es aus der Tabelle mit der gereinigten Seite nach oben zu heben. Legen 0,4 mm-Distanzscheiben an der Kante jeder Längsseite.
   8. Die Kerbplatte vorsichtig in den Abstandshalter, so dass die beschichtete Seite auf der Innenseite des Gels sein. Verwenden Sie einen Rasierer oder anderen dünnen Instrument zu verschiebendie Abstandshalter für einen Flush Ausrichtung an der Unterseite und die Seiten der Gel-Platten befestigen Sie dann mit Bindemittel Clips auf jeder Seite der Gel-Platten über die Abstandshalter.
   9. Vorbereitung 30 ml 8% PAGE Mischung pro Gel durch Mischen von 15 ml 10% und 6% vermischt, die jeweils in ein 50 ml Röhrchen. Schnelles Hinzufügen von 300 &mgr; l 10% APS, gefolgt von 30 ul N, N, N ', N'-Tetra-Methyl-ethylendiamin (TEMED) zu der Mischung 8% Gel.
      HINWEIS: Geeignete Gel-Prozentsätze für einzelne Größen Sonde sollte durch den Experimentator ausgewählt werden.
   10. Cap-und Invert-2x und gießen Sie die Lösung in den Kerbbereich der Gel-Platten. Achten Sie darauf, leicht erhöhen die Platten von Hand und pflegen eine noch gießen, bis die Seite Mix beginnt der Boden zu tropfen.
   11. Senken Sie die Platten wieder auf Niveau und sofort legen Sie die großen 8-Well-Kamm für Rechteck 0,4 mm x 20 cm Gel. Kleine Blasen nahe der Unterseite keinen Einfluss auf die laufenden, aber es sollte keine Blasen in den Vertiefungen liegen.
       HINWEIS: </ Strong> Platz Papierhandtücher auf dem unterhalb des unteren und oberen Ende des Gels Tabelle Verschüttetes beim Gießen zu erfassen.
   12. Lassen Sie die PAGE-Mix für mindestens 30 min polymerisieren.
   13. Übertragen Sie das polymerisierte Gel in den Kühlraum und montieren Sie die Elektrophorese-Vorrichtung. In kalten TBE-Puffer zu den Füll-Linien am oberen und unteren Kammern.
   14. Nehmen Sie den Kamm und verwenden Sie einen Rasierer, um alle Ablagerungen zu entfernen. Stellen Sie das Gel in dem Gerät und verwenden Sie einen Binder Clip, um die Platte zu der Dichtung zu halten. In kalten TBE in die obere Kammer, bis er in den Platten fließt.
   15. Waschen Sie die Vertiefungen mit einer 30 ml syringe/21 G 1-1/2 "Nadel nur vor dem Laden der markierten RNA-Substrate mit kaltem TBE gefüllt. Legen Sie eine Aluminiumplatte auf der Rückseite des Glases, um Hilfe in mäßige Verteilung der Wärme während des Betriebs.
   16. Last 3 ul des Markers und die gesamte 25 ul-Transkriptionsreaktion jeweiligen RNA-Substrat in getrennten Vertiefungen. Einen gut zwischen ähnlich großen Transkripte prevent Kreuzkontamination. Bromphenolblau und Xylencyanol Farbstoffe in der Ladepuffer kann zur Größe der Migration auf das Gel zu schätzen.
   17. Führen Sie das Gel mit einer konstanten Leistung angemessen für die Größe der RNA-Sonden (zB 25 Watt für 2 Stunden für Sonden von 600 nt).
4. Markierten RNA-Extraktion und Reinigung
   1. Nach der Elektrophorese vorsichtig ablassen oberen Kammer des Gel-Apparatur. Der größte Teil der Radioaktivität im Gel und die untere Kammer ist; jedoch kann die obere Puffer eine radioaktive Stoffe enthalten.
   2. Verwenden Sie ein Fach, das Gel zu transportieren, wenn Umzug in ein anderes radioaktives Material Arbeitsbereich. Entfernen Sie vorsichtig die Abstandshalter, indem Sie den vorstehenden Stück seitlich vom Gel.
   3. Vorsichtig trennen die Platten. Das Gel sollte auf die Platte, die nicht silikonisiert wurde haften. Legen Sie ein Stück Plastikfolie über dem Gel und Glasplatte.
   4. Legen Sie ein glogos AutoRad Marker Aufkleber auf der Plastikfolie über eine area des Gels, die frei von jeglichen Proben.
   5. In einem dunklen Raum, legen ein Stück Autoradiographiefilm über die gesamte Platte und setzen für mindestens 1 min. Entwickeln Sie den Film.
   6. Setzen Sie den entwickelten Film auf eine helle Fläche. Dann legen Sie die Kunststoffseite des Gels Gesicht nach unten auf den Film und richten Sie die AutoRad Marker aus dem Gel auf die freiliegende Markierung auf dem Film. Einmal ausgerichtet, mit einem schwarzen Marker, um die Position der gewünschten Bands auf dem Glas zu markieren.
      HINWEIS: Alternativ ausrichten Gele / Film in der folgenden Art und Weise zu schneiden RNA-Banden. In dem dunklen Raum, legen Sie das Gel eingewickelt auf einem Tisch, platzieren Sie den Film auf es und legen Sie eine Kassette (oder ein Buch, etc.) auf dem Stück Film. Flick auf der Lichtschalter im Zimmer kurz, dann wenden, wenn aus. Dies wird "Vorblitz" den Film erzeugen einen Überblick über alle Vertiefungen auf dem Film durch den Druck / Schutz vor Licht, dass die Kassette auf der Oberseite bietet. Dies macht es einfach, den Film auf dem Gel ausgerichtet und schneidenaus der Band ohne Fluoreszenzmarker.
   7. Entfernen Sie vorsichtig die Plastikfolie und mit einem frischen Skalpell oder einer Rasierklinge für jedes RNA-Substrat-und Verbrauch die Bands aus dem Gel und legen in einzelne 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen Nutator für schon Aufregungen während der Elution.
   8. Gib 500 ul RNA-Elutionspuffer (0,5 M Ammoniumacetat, 10 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) in jedes Röhrchen. Kurz zentrifugieren, um das Gel tauchen Fragment. Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 3-16 Stunden, je nach Sondengröße.
   9. Den gesamten 500 ul eluierte Material in ein neues Röhrchen. Vermeidung der Übertragung keine Gelstücke, wie sie mit der Reinigung beeinträchtigen. 1 &mgr; l Glycogen (20 mg / ml) mit 500 &mgr; l kaltem, saurem Phenol-Chloroform (für RNA).
   10. Vortexen, sollte die Lösung trüb erscheinen. Spin bei Raumtemperatur bei Höchstgeschwindigkeit (~ 16.000 xg) für 5-6 min.
   11. Sorgfältig transfer die obere (wässrige) Schicht in neue Röhrchen sammeln so viel wie möglich unter Vermeidung jeglichen Schmutz aus der Interphase. Hinzufügen einer gleichen Menge Chloroform zu der wässrigen Phase überführt. Wiederholen Sie Schritt 3.4.10 und übertragen Sie die oben (wässrige) Schicht in ein neues Röhrchen. 1 ml eiskaltem EtOH zu 95-100% des gesammelten Materials. Inkubation bei -80 ° C für 10 min. HINWEIS: Die RNA kann über Nacht gelagert werden, falls gewünscht.
   12. Pelletierung der RNA für 30 min bei 16.000 × g bei 4 ° C. Vorsichtig gießen Sie den Überstand in ein radioaktiver Abfallbehälter und 1 ml eiskaltem 70% EtOH Molekular Klasse zu jedem Pellet.
   13. Pellet die RNA bei 16.000 g für 15 min bei 4 ° C, Überstand abgießen, spinnen wieder für 1 min und entfernen Sie alle Rest EtOH über eine Pipette und lassen bei Raumtemperatur mit den Kappen offen für die Verdampfung eines verbleibenden EtOH ermöglichen.
   14. Resuspendieren der Pellets in 20-30 ul RNase-freies Wasser. Markierte RNA kann bei -80 ° C gelagert werden
       Hinweis: Eine radioaktive Umfrage Messgerät sollte in der gesamten Extraktionsverfahren verwendet werden, um sicherzustellen, dass der markierte RNA wurde nicht auf jeder Stufe verloren werden.
5. Quantifizierung der markierten RNA eine prä-mRNA 3'-mRNA Spaltungsreaktion
   1. Approximieren Sie die Molarität der Spaltung von Substraten unter Verwendung des folgenden Verfahrens.
      1. Nehmen wir zum Beispiel 1 &mgr; l von 3000 Ci / mmol ^[α-32 P]-UTP und 10 mCi / ml. (Auf dem Etikett Referenzdatum, wird die chemische Konzentration dieser Stammlösung 3,3 uM UTP sein. Vor diesem Zeitpunkt wird es höher und eine Halbwertszeit (~ 13 Tage) nach dem Tag, es ist ~ 1,6 mM, etc.) Das markierte UTP Beitrag zu der endgültigen Reaktions Konzentration ist in der Regel vernachlässigbar, wenn eine abschließende Kalt UTP-Konzentration über dem UTP K _m verwendet. Die T7 RNAP K _m für UTP ist 114 mM ^15.
      2. Verdünnen Sie die 1 ul in 39 ul Wasser. Dann fügen Sie 1 ul verdünnter [α- ^{32 P] UTP auf ein geeignetes Volumen von Szintillationsflüssigkeit in einem Scintillationsfläschchen. (HINWEIS: Szintillationsflüssigkeit ist eigentlich nicht für diese spezifische Aktivität von 32 P benötigt als Cerenkov-Zählung wird zuverlässig cpm-Werte geben zu Überprüfen Sie die Szintillationszähler Handbuch, um den richtigen Kanal für Cerenkov-Zählung wählen und zählen eine 1-ml-Volumen für 1 min.).}
   2. Verdünnt 1 ul jeder markierten RNA-Substrats in getrennte Röhrchen mit der gleichen Menge in dem vorhergehenden Schritt verwendet Szintillationsflüssigkeit. Achten Sie darauf, ein Fläschchen mit nur Szintillationsflüssigkeit Hintergrund berechnen haben. Quantifizieren Radioaktivität in einem Szintillationszähler.
   3. Multiplizieren Sie die Counts pro Minute (cpm) für die ^[α-32 P]-UTP-Probe um 40 bis in der Anfangsverdünnungsfaktor und subtrahieren die von der Szintillationsflüssigkeit allein erreicht Hintergrund. Multiplizieren Sie die Anzahl für jede RNA-Sonde durch die Menge der RNase-freies Wasser (20-30 ul) verwendet, um die RN resuspendierenEin Sonden. Dies verleiht dem gesamten cpm der gereinigten RNA.
      Beispiel:. Max = cpm (cpm ^[α-32 P] UTP - Hintergrund) x 40 markierten RNA-Probe 1 = 20.000 cpm x 20 = 400.000 cpm (wenn 20 ul für Aufwirbelung verwendet)
   4. Wenn ein anderer als 1 ul ^[α-32 P] UTP-Menge wurde verwendet, um die Transkripte zu machen, dann Faktor dieses Volumen in die endgültige cpm von ^[α-32 P] UTP, indem die cpm des ^[α-32 P] UTP-Probe durch die verwendete Menge.
      Beispiel: 2 ul ^[α-32 P]-UTP verwendet wird, um die Transkripte zu machen. Die berechnete cpm für 1 ul ^[α-32 P] UTP 500.000 cpm. Multiplizieren Sie 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm
   5. Teilen Sie die markierte RNA cpm berechnet durch die cpm berechnet für ^[α-32 P] UTP allein. Dies wird grob schätzen den Anteil der markierten UTP eingebaut.
      Beispiel: 400.000 / 1.000.000 = 0,40 oder 40%inkorporiert
   6. Da ein Enzym nicht zwischen Isotope unterscheiden, wird der gleiche Prozentsatz der markierten und unmarkierten UTP in die RNA während der Transkription eingebaut. Berechnen der Menge von kaltem UTP in mol, die der Transkriptionsreaktion (0,5 &mgr; l einer 10 mM Lösung = 5,0 x 10 ^-9 Mol UTP) zugegeben.
   7. Multiplizieren das Mol UTP im Reaktions durch den Prozentsatz aufgenommen (von der heißen UTP oben Zählen bekannt), dann teilen die durch die Anzahl der Uridinen in der RNA-Sequenz.
      Beispiel: 5,0 x 10 ^-9 Mol UTP x 0,40 = 2 x 10 ^-9 Mol UTP
      2 x 10 ^-9 Mol UTP / 73 U pro Transkript = 2,7 x 10 ^-11 mol RNA
   8. Konvertieren Mol RNA Molarität, indem das Volumen des gewonnenen RNA Resuspensionslösung.
      Beispiel: 2,7 x 10 ^-11 mol RNA / 20 &mgr; l = 1.370 nM RNA. Für T7 RNAP-Transkripte von etwa 1 ug linearer gemachtIzed Plasmid und in 20 ul Wasser suspendiert, sind Werte von 200 bis 1.400 nM typisch.
      HINWEIS: Die molare Konzentration der RNA wird verwendet, um sicherzustellen, dass das endgültige Prä-mRNA-Substrat-Konzentration in der in vitro-Spaltung von weniger als 5 nm pro Spaltungsreaktion. Spaltungseffizienz kann abnehmen, wenn die RNA-Konzentration wird deutlich über 5 nM erhöht.

4. 3 'mRNA-Spaltungsreaktion

1. Spaltungsreaktion Vorbereitung der Reagenzien
   1. Bereiten Sie alle Reagenzien für die Spaltungsreaktion benötigt. Machen Sie 10% Polyvinylalkohol (PVA) durch kochendes Wasser geben und langsam die richtige Menge an PVA-Pulver. 10% PVA wird viskos sein und braucht Zeit, sich aufzulösen. Bei einer Raumtemperatur oder -20 ° C
   2. Bereiten 1 M Kreatinphosphat (CP) und bei -80 ° C Es ist wichtig, 1 M CP, der weniger als 4 Monate alt ist, zu verwenden.
   3. Bereiten 1 M DTT und speichernbei -20 ° C. Einen frischen 0,2 M DTT Verdünnung von der 1 M DTT gerade vor zu tun, die Spaltungsreaktion.
   4. Bereiten ETS (Spaltung Stop-Lösung): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS. Lagern bei Raumtemperatur.
2. Spaltungsreaktion
   1. Erhitzen Sie das markierte RNA auf 80 ° C für 2 min auf Eis legen Sie dann.
   2. Vorsichtig vortexen und dann drehen Sie das 10% PVA bei Höchstgeschwindigkeit für 2-3 min, um Blasen zu entfernen.
   3. Master-Mix 1: Für einen Reaktions kombinieren 3,125 ul 10% PVA, 0,625 ul 1 M CP, 0,25 ul 0,5 M tRNA, 0,125 ul 100 mM dATP, 0,13 ul 40 U / ul RNase-Inhibitor, 0,25 ul 0,1 M EDTA pH 8 0,1 ul 0,2 M DTT und 0,645 ul RNase-freies Wasser. Dispense 5,25 ul Master-Mix 1 pro Röhrchen auf Eis.
   4. Master-Mix 2: Verwenden 6,25 ul / Reaktion von Kernextrakten in Konzentrationen von mehr als 2 mg / ml. Kernextrakte können mit Puffer D ₅₀ verdünnt werden, wenn needed.
   5. Kombinieren Sie die 6,25 ul Kernextrakt mit der zuvor ausgegebenen 5,25 ul Master-Mix ein. 1 ul der markierten RNA-Substrat, das zu 50 nM verdünnt wird. . Bedingungen <5 nM der markierten RNA-Substrat: Alternativ kann die RNA in der Master-Mix 1 vorgesehen, dass es nach der RNase-Inhibitor, DTT und tRNA HINWEIS hinzugefügt wird, einbezogen werden.
   6. Vorsichtig vortexen und schnelle Spin jede Probe, um Luftblasen zu entfernen. Inkubieren bei 30 ° C für bis zu 2 h, aber ein Zeitverlauf sollte für optimale Ergebnisse durchgeführt werden. Längere Inkubationen vielleicht Hintergrund Abbau zu erhöhen.
3. Proteinase K Verdauung und Reinigung
   1. Entfernen Sie die Proben von Hitze und fügen 182,5 ul ETS Stopplösung in jede Reaktion. Mit 5 &mgr; l 20 mg / ml Proteinase K und Inkubieren Proben bei 37 ° C für 10 min.
   2. Extrahieren der RNA durch Zugabe von 1 Volumen (200 ul) der Säure Phenol-Chloroform, ^1/10 Volumen (20 ul) von 3 M NatriumAcetat und 1 ul 20 mg / ml Glykogen. Fahren Sie mit Extraktionen wie in den Abschnitten 3.4.9-3.4.14 beschrieben.
   3. Sobald die RNA-Extraktion abgeschlossen ist, müssen Sie das gesamte restliche EtOH zu entfernen. Das Pellet in 8 ul Ladepuffer (90% Formamid, 10 mM EDTA, mit Bromphenolblau (BFB) (und oder Xylencyanol Blau)). Die Proben können bei -80 ° C gelagert oder fahren Sie mit Gelelektrophorese werden.
4. Spaltungsreaktion Elektrophorese
   1. Bereiten Sie eine 6% Acrylamid-Gel wie zuvor in den Abschnitten 3.3.1-3.3.17 mit ein paar Modifikationen angegeben. Verwenden Sie 20 cm x 42 cm Sequenzierungsgel Platten mit 2 Binder Clips an jeder Längsseite. Verwenden Sie eine 32-Well-Kamm und Vorbereitung 40 ml des Gels Mix.
   2. Laden des Gels mit 3 ul des Markers und 5 &mgr; l von jeder Probe. Optimieren Sie die Einstellungen Elektrophorese nach vorher Spaltung und gespalten Produktgrößen.
   3. Wenn Elektrophorese abgeschlossen ist, folgen Abschnitte 3.4.1-3.4.3 </ Strong>, um das Gel zu zerlegen. Statt der Plastikfolie, schneiden Sie ein Stück Filterpapier auf die Größe des Gels Platte und sorgfältig legen Sie es auf einer Seite des Gels ausgesetzt.
   4. Drücken Sie die Filterpapier fest auf das Gel, dann über die Platte drehen, so dass das Filterpapier auf dem Boden und das Glas ist an der Spitze. Drücken Sie das Glas auf den Tisch, um sicherzustellen, dass das Gel Greif das Filterpapier gleichmäßig.
   5. Langsam Ziehen des Filterpapiers, die das Gel angehängt werden soll, von einem der kurzen Enden, bis das gesamte Filterpapier mit Gel angebracht ist, von der Glasplatte entfernt.
   6. Decken Sie die Seite mit Gel ausgesetzt Plastikfolie. Kleben Sie die Plastikfolie auf das Filterpapier.
   7. Legen Sie das Gel auf einem Gel-Trockner mit Blick auf die Unterdruckseite der Filterseite. Trocken für 15 Minuten oder bis das Gel vollständig trocken ist.
      HINWEIS: Wenn ein Gel Trockner nicht verfügbar ist, können Röntgenfilm verwendet, um die RNA-Banden sichtbar zu machen. Die Exposition sollte in einem ligh durchgeführt werdent dichte Kassette mit Intensivierung Bildschirm bei -80 ° C Die Belichtungszeit wird empirisch bestimmt. Achtung: niedrige Prozent Acrylamid Gele können beim Gefrieren zu knacken.
   8. Das Gel kann jetzt verwendet werden, um Film belichten oder mit einem Phospho-Imager verwendet werden kann. Belichtungszeit hängt von der Stärke der markierten RNA. Zunächst 24 h Exposition verwendet werden. Bei der Verwendung von Film, setzen bei -80 ° C mit einer Intensivierung Bildschirm und auf Raumtemperatur vor der Entwicklung zu wärmen.
   9. Messen Sie das Verhältnis zwischen gespalten und un-RNA gespalten in jeder Probe zu Spaltungseffizienz zu quantifizieren.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse einer Spaltungsassay der RNA Poly (A)-Stellen von HIV-1 (Fig. 2). Wir können die ungespaltene RNA-Substrat, das am langsamsten wandernde Bande an der Spitze des Gels zu beobachten. Die spezifische gespaltene Produkt ist die intensivste kürzere Fragment Band, die schneller in der Gel bei der erwarteten Größe läuft und ist speziell aus der Spaltung Assay der mutpoly (A) Kontrolle, die eine Punktmutation in der Poly-A-Sequenz (mutPolyA) RNA enthält abwesend Substrat. Abbaup...

Diskussion

Die in vitro-pre-mRNA 3 'Spaltungsreaktion, in HeLa-Zellkernextrakten oder mit Spaltung Faktoren aus diesen Extrakten fraktioniert durchgeführt wird, hat die Identifizierung der Kernspaltungsfaktoren und deren Hauptkomplexe ^16-21 aktiviert. Viele weitere Proteine ​​mit diesen Faktoren zugeordnet wurden kürzlich identifiziert ²² und der in-vitro-Reaktion kann weiterhin Licht auf, wie diese Proteine ​​tragen zur Reaktion zu vergießen. Vielleicht weil die Reaktion ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Celstir flask	Wheaton	356884	Different sizes available
4 position slow speed stirrer	VWR	12621-076
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter		Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R	Eppendorf		Refridgerated
Thermomixer incubator	Eppendorf
250 ml conical tubes	Corning	430776
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
Ultraclear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modified MEM	Lonza	04-719Q
Fetal bovine serum	Atlas	F-0500-A	Heat inactivated
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Potassium chloride	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycerol	Fisher	BP229-4
5 M sodium chloride solution	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M solution	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ammonium sulfate	Fisher	A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel loading buffer II	Ambion	8546G
DEPC treated water	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x TBE	Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Ammonium acetate	Fisher	A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogen	Roche	10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof	Acros	61509-0040
Acid phenol:chloroform	Ambion	9720	For RNA
Scintilation fluid	Fisher	SX18-4
Rnase inhibitor	Promega	N261B
Polyvinyl alcohol- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Creatine phosphate	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Adjustable sequencing unit	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Binder clips	Office Depot	838-056
20 cm x 42 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
20 cm x 22 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
8-well comb	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
16-well comb	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32-well comb	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Gel repel coating	C.B.S. Scientific	SGR-0401	or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips	Rainin	GT-10-4	0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer	Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Autoradiography cassette	Fisher	FBCA 1417	8 x 10 size available