JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

РНК-полимераза синтезирует II РНК-предшественник, который выходит за пределы конца 3'зрелой мРНК. Конец зрелой РНК генерируется cotranscriptionally, на участке, диктуемого последовательностей РНК, с помощью эндонуклеазы активности расщепления комплекса. Здесь мы подробно метод для изучения реакции расщепления в пробирке.

Аннотация

3'-конец мРНК млекопитающих не образуется резким терминации транскрипции РНК-полимеразой II (RNPII). Вместо этого, RNPII синтезирует предшественник мРНК после окончания зрелых РНК, а активный процесс эндонуклеазной активности требуется в определенном месте. Расщепление РНК-предшественника обычно происходит 10-30 нт ниже по течению от консенсуса сайте поли (AAUAAA) после ЦА динуклеотидов. Белки от расщепления комплекса, многофакторной белкового комплекса около 800 кДа, выполнить эту конкретную нуклеазную активность. Конкретные последовательности РНК выше по течению и ниже по течению от сайта поли контролировать набору расщепления комплекса. Сразу после расщепления, предварительно мРНК полиаденилированной по полимеразы поли (PAP) с получением зрелых стабильных РНК сообщения.

Обработка 3'-конца РНК-транскрипта могут быть изучены с помощью клеточных Ядерные экстракты со специфическими меченных РНК подложках. В общем, долго 32 </ SUP> P-меченого предшественника нерасщепленной РНК инкубируют с нуклеарных экстрактов в пробирке, и расщепление оценивается путем гель-электрофореза и авторадиографии. Когда происходит собственно расщепление, короче 5 'расщепляется продукт обнаружены и количественно. Здесь мы описываем расщепление анализа подробно с использованием, в качестве примера, 3'-конце обработку ВИЧ-1 мРНК.

Введение

Биосинтез большинства зрелых эукариотических РНК сообщений (мРНК) требует нескольких пост-транскрипционные модификации, такие как покрывая, соединения и полиаденилирование. Эти модификации, как правило, в сочетании, чтобы обеспечить правильную обработку 1 и сильно увеличить стабильность мРНК.

3 'конец формирование млекопитающих пре-мРНК генерируется эндонуклеолитического расщепления возникающей РНК с последующим добавлением аденилат остатков на 5' расщепляется продукт поли (А)-полимеразы (PAP) 2-4. У млекопитающих расщепление осуществляется многокомпонентной белкового комплекса, примерно 800 кДа, который собирает на предварительно определенных последовательностей РНК. Поли (А) сигнальная последовательность, высоко консервативны канонический последовательность гексануклеотид AAUAAA, направляет сайт расщепления примерно 10-30 нуклеотидов ниже по течению. Этот сайт специально признана расщепления и полиаденилирования фактор специфичности (CPSF) и 73 кДа субъединицыCSPF содержит эндонуклеазной активности. Коэффициент стимуляции расщепления (CSTF) связывает больше вырождаются ГУ-или U-богатые последовательности элемент вниз по течению от поли (А) сайта. Также требуется для расщепления является млекопитающее фактор расщепление I (CFIm) и млекопитающих фактор расщепление II (CFII). CFIm связывает конкретные UGUA (N) сайтов в элементах вверх по течению последовательности (использует), которые были определены для ряда генов и, кажется, быть вовлечены в важных физиологических процессов 5-8.

В пробирке, реакции процессинга РНК, как правило, анализировали с использованием радиоактивно меченных РНК подложках 9-12. Они могут быть синтезированы стекания транскрипции с промотора бактериофага Т7 или SP6. При изучении сайт полиаденилирования, который не был охарактеризован ранее, необходимо использовать геномную ДНК, а не для генерирования кДНК РНК субстрат, в качестве важных ниже по течению последовательности не могут присутствовать в кДНК. Дизайн подложки включить по крайней мере, 150 нт upstreaм и 50 нт ниже по течению от расщепления сайта / конце на зрелой мРНК. Продукт расщепления мигрирует быстрее, чем подложка; однако, потому что другие фрагменты могут генерироваться неспецифической нуклеазной действия, специфичность реакции должна быть проверена на ее зависимость от правильных последовательностей сигналов обработки. Таким образом, РНК подложки с точечной мутации в последовательности AAUAAA (например AAGAAA) служить в качестве отрицательного контроля для реакции расщепления.

Учитывая, что небольшое количество радиоактивно помеченных РНК используется для реакции расщепления, РНКазы, присутствующие в высокой численности в большинстве ядерных экстрактов может быть проблематичным, и ограничивают выбор исходного материала для получения экстракта. HeLa клетки имеют тенденцию содержать низкие уровни эндогенных РНКазы, и, таким образом, хорошо работать в этих анализах.

Эндонуклеолитического расщепление РНК субстратов в виво и ин витро немедленно следует поли (A) добавление, чтс промежуточным расщепляют нет в обнаруживаемых количествах. Поэтому для изучения либо конкретную последовательность или белки, участвующие в реакции расщепления РНК, эксперименты выполнены в условиях, которые предотвращают возникновение полиаденилирования. Там нет зависимости расщепления на полиаденилирование, или наоборот, так что можно остановить полиаденилирование без ущерба для реакции расщепления. Таким образом, АТФ заменяется цепной прекращения аналога, который испытывает недостаток гидроксильную группу 3 'так, что только один нуклеотид могут быть включены в поли (А)-сайте и просто расщепляется РНК могут быть обнаружены.

Учитывая сложность и высокая степень особенностью данного типа анализа, мы описываем подробный протокол видео для изучения эндонуклеолитического расщепление по расщепления / поли (А) машин прекурсоров мРНК в пробирке. Мы опишем, как подготовить компетентных ядерные экстракты, генерировать радиоактивно помеченных РНК субстраты, проводить реакцию расщепления и анализировать и интерпретировать результатING продукты. 1 показан пример подложки РНК, кодирующих 3'-конца ВИЧ-1 пре-мРНК, которые будут использоваться для расщепления анализа. 3 'конец РНК генома ВИЧ состоит из множества важных регуляторных последовательностей, таких как поли (А)-сайте, богатой области G+ U, а также использование элемента, которые являются всем необходимым для эффективного созревания вирусных транскриптов мРНК 13 . В этом примере мы ожидаем, что вход РНК субстрат быть 338 нт и при расщеплении 237 нт. Если полиаденилирования разрешили произойти, мазок из продуктов будет наблюдаться между 237 и 437 нт.

протокол

1. Адаптация прилипшие клетки в Suspension

(Это необязательный шаг. Подвеска клетки обычно делают лучшие ядерные экстракты, однако клетки, выращенные в виде пластин также могут быть использованы.)

  1. Адаптация прилипшие клетки для роста в суспензии с использованием модифицированного MEM Joklik с добавлением 5-10% новорожденных телячьей сыворотки или фетальной бычьей сыворотки и 1% L-глутамина: пенициллин-стрептомицина. Размножаются клетки в вращающихся колбах с крышки фильтра при 37 ° С с 8% CO 2.
  2. При адаптации клеток, начинаются с 100 мл в 500 мл вращающийс сосуд. Поддерживать минимальный 0,3 х 10 6 клеток / мл и замените носитель каждые 1-2 дня, пока собственно темпы роста не будет достигнута (обычно 2-6 недели). После того, как адаптировать, HeLa клетки в суспензии должны удвоить примерно каждые 24 ч. Примечание: Во время фазы адаптации, это займет некоторое время для клеток вернуться к нормальной скорости удвоения.
  3. Поддерживать клетки при логовоплотность 0,5-0,8 × 10 6 клеток / мл в желаемого конечного объема (обычно 1-10 L)
  4. Клетки обычно собирают в середине логарифмической фазы (около 0,5-0,65 х 10 6 клеток / мл и> 90% жизнеспособных). Использование соответствующего размера вращающийс сосуд для желаемого количества культуральной среды.

2. Ядерные экстракты

  1. Буфер и подготовке реагентов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытяжки выполняются следующие модифицированной Дигнама др. (1983) 14 Процедура ядерный экстракт..
    1. Подготовка 1X фосфатным буферным солевым раствором, буфер А, буфера C, и буфер D (табл. 1) день, прежде чем приступить экстракции и хранить при температуре 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая урожайность, как правило, достигается с свежеприготовленного буфера; однако, буфер стабилен в течение нескольких недель. Важно, чтобы все буферы, аппараты и оборудование предварительно охлаждают и выдерживают холод для полноты экстракций.Используйте холодный номер на столько шагов возможных и / или держать все на льду. Добавить DTT и ФМСФ непосредственно перед использованием.
  2. Сбор и Стиральная клеток
    1. Налейте клетки на четыре 250 мл конические флаконы и спиновых при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С в центрифуге с размахивая или ротора с фиксированным углом. Переливать супернатанты и добавить еще один сотовый культуральной среды 250 мл в каждую бутылку. Повторите спинами, пока все клетки не были осаждали.
    2. Ресуспендируют в сочетании Конечные осадки в общей сложности 250 мл охлажденного льдом PBS и бассейном в одном 250 мл коническую бутылки. Вращайте клетки при 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° С в Бакет центрифуге.
    3. Слейте надосадочную и ресуспендируют осадок клеток в ледяной PBS так общий объем не превышает 50 мл. Ослабить осадок через пипетки и переносят в 50 мл коническую пробирку центрифуги.
    4. Вращайте клетки снова при 500 мкг в течение 6 мин при 4 ° С в Бакет центрифуге. Вылейте supernatanт и оценка и обратите внимание на объем осадок клеток (КНД) с максимально возможной точностью. Использование воды в отдельной соответствующий трубки, для сравнения, если осадок ниже маркировки громкости на трубке.
  3. Лизиса клеток
    1. Добавить DTT в буфере А. ресуспендируют осадок в буфере А, используя 5 объемов расчетной КПВ. Внесите разбить осадок и инкубировать на льду в течение 10 мин.
    2. Спин клетки при 931 мкг в течение 10 мин при 4 ° С в Бакет центрифуге.
    3. Тщательно аспирата супернатант вместо декантации. Объем гранул должен был увеличен примерно на два раза в размерах за счет отека клеток.
    4. Добавьте 1 КНД из буфера А к клеткам. Аккуратно разбить гранул и удаления небольшого аликвоты (около 50 мкл) в пробирке на льду. Трансфер ресуспендированные клетки в соответствующего размера Dounce гомогенизатора (обычно 15 мл размер) охлажденного на льду.
    5. Лизируют клетки с 12-15 медленных, но устойчивых ударов типа B (TIGHT) пестик. Удалить небольшую аликвоту лизата и исследовать под микроскопом для полного лизиса (интактные небольшие темные ядра по сравнению с набухших клеток) путем окрашивания трипановым синим. Неповрежденных клеток будет ясно). Продолжить homogenation до 90% лизиса не будет достигнута и останавливаться на достигнутом, над douncing может негативно сказаться на качество ядерных экстрактов.
    6. Трансфер лизата в UltraClear Ультрацентрифуга труб и обратите внимание на общий объем. Баланс взвешиванием трубки и спина в 1069 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
      ВНИМАНИЕ: ультрацентрифуга используется на этом этапе, несмотря на низкую скорость отжима потому что тот же трубка будут выделены на более высокой скорости на следующей стадии. Это спин даст достаточно плотный осадок, покрывающий нижнюю часть трубки с размытым супернатанта выше, который может быть собрана и использована для цитозольных экстрактов S100. Если есть видимый липидный слой на верхней части трубки, она может быть удалена.
    7. Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки и передать его в Аноф.. э трубка Избегайте нарушения ядерной осадок ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет важно знать конечный объем супернатанта с целью определения упакованный ядерный объем (ПНВ).
  4. Подготовка ядерный экстракт
    1. После того, как супернатант был тщательно удален, Respin неочищенный экстракт ядерный осадок на 25453 х г в течение 15 мин при 4 ° С в той же трубе.
    2. Удалите остатки супернатант (он должен быть небольшое количество прозрачной жидкости) и добавить его в предыдущей коллекции надосадочной. Измерить конечного объема надосадочной жидкости. Вычислить ПНВ вычитанием этого объема от общего объема исходного лизата отмечалось ранее. Альтернативно, если гранулы достаточно большой, его объем можно оценить путем сравнения с аналогичным объемом воды в идентичном трубки.
    3. Добавьте 1 ПНВ объем буфера С (примерно 1 мл / мл клеток). Осторожно выбить гранул с кончика пипетки и передачи в соответствующим образом сиZed Dounce гомогенизатор. При использовании гомогенизатора же, как и раньше, prerinse гомогенизатор стерильной деионизированной водой.
    4. Ресуспендируют гранул с ~ 5-10 ударов через гомогенизатор Dounce используя плотную пестик.
    5. Передача гомогенизированный ядерного лизата в охлажденный трубки и перемешать с помощью инверсии в течение 30 мин при 4 ° С. Если объем достаточно большой, агитировать, используя магнитную мешалки и спин-бар.
    6. Передача лизата в новую UltraClear центрифужную пробирку и вращаются на 25453 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Осадок должен быть компактным. Около 5 минут до спина будет завершена, гидратации диализа кассеты или трубки, которые имеют соответствующую молекулярную массу отсечения (MWCO) (например, 7000 кДа).
    7. Удалить супернатант (ядерная экстракт) из трубки в охлажденный коническую трубку с помощью пипетки передачи затем приступить диализа.
  5. Диализ
    1. Введите экстракты в гидратированных диализных кассет как на производителя "S инструкции и Диализировать Ядерные экстракты в 500 мл буфера D 50 течение 1 часа при 4 ° С при перемешивании.
    2. Заменить буфер 500 мл свежего, охлажденного льдом буфера D 50 и диализировать в течение дополнительного 4 ч при 4 ° С. Этот шаг 4 ч можно разделить на две смены 2 час вместо этого.
    3. Удалите выдержки из диализной кассеты и трансфер в охлажденных трубок. Вращайте экстракты течение 5 мин при 1500 мкг при 4 ° С.
    4. Алиготе экстракты в охлажденных, пробирки Эппендорф и оснастки заморозить в жидком азоте (50-100 мкл на аликвоты). Хранить при -80 ° C для дальнейшего использования.

3. РНК зонд Синтез

  1. Шаблон Подготовка
    Примечание: шаблоны, используемые для транскрипции может быть ПЦР фрагменты или плазмиды, которые содержат Т7 или SP6 промотора выше по потоку и в непосредственной близости от желаемой последовательности зонда. Шаблоны плазмида должна быть ниже по потоку от линеаризованной последовательности матрицы ИНТerest. Мы отметили высокую доходность от шаблонов ПЦР.
    1. T7/SP6 промотор может быть вставлено в ходе реакции ПЦР. Проектирование смыслового праймера с T7/SP6 промотора выше по потоку от последовательности-мишени.
    2. Amplify нужную последовательность в 2-3 реакций в шаблоне с помощью ПЦР в инструкции производителя, используя высококачественный полимеразы.
    3. Объединить эквивалентные реакции и очищают путем экстракции геля.
    4. Последовательность ПЦР-продукты с целью проверки точности шаблона. (Необязательно)
  2. Транскрипции РНК с 32 P маркировки
    1. Выполнение в пробирке транскрипции от 1 мкг шаблона с коммерчески доступного набора, который совместим с промотором SP6 (или T7) со следующими изменениями. Используйте 1 мкл свежей 3000 Ки / ммоль [α-32 Р] UTP, 0,5 мкл 10 мМ холодной UTP, 0,1 мкл 10 мМ ГТФ и 0,9 мкл 10 мМ m7G (5 ') PPP (5') G РНК Колпачок в общем конечном объеме 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: G-колпачок улучшает стабильность РНК-транскриптов в ядерных экстрактах (крышка: ГТФ) 10:1. Холодный UTP добавляется для предотвращения 32 P-UTP от того, лимитирующим реагентом.
    2. Синтезировать размер лестнице РНК, как обозначается выше, без G крышкой. Коммерческие шаблоны доступны для генерирования размер РНК маркер.
    3. Инкубируйте реакции транскрипции при 37 ° С в течение 1 часа (при использовании SP6 40 ° C). После завершения выполнения ДНКазную пищеварение шаблона в течение 15 мин при 37 ° С
    4. После расщепления, добавить 1 мкл 0,5 М ЭДТА и 5 мкл загрузочного буфера II к РНК-субстратов. Добавить 20 мкл буфера для II к маркеру.
    5. Нагреть РНК маркер и зондов при 95 ° С в течение 3 мин, затем поместить на льду.
  3. Полиакриламидном геле Литье / зонд электрофореза
    1. Подготовка 1 л 6%-ном полиакриламидном геле (PAGE) и смеси 400 мл 10%-PAGE. Чтобы на 6%, смешать 150 мл 40% 19:01 акриламида: бис-аcrylamide 100 мл 10X Трис / борат / ЭДТА (КЭ) и 460 г мочевины. Подогреть до 800 мл стерильной деионизированной воды и перемешать на плите при применении слабом огне (около 50-80 ° С). Заполните до 1 л деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция является эндотермической. Обогрев способствует солюбилизации мочевины. Удаляют из высокой температуры, как только мочевина растворяется и доведени раствора до 1 л деионизированной водой. В качестве альтернативы перемешиваться при комнатной температуре в течение ночи; слишком много тепла может инициировать полимеризацию.
    2. Защитите микс страница из света с алюминиевой фольгой и хранить при комнатной температуре. Смеси страница может быть подготовлен заранее и стабильны в течение нескольких месяцев.
    3. Подготовьте 400 мл 10%-микс Совместив 100 мл 40% 19:01 акриламида: бис-акриламида, 40 мл 10-кратным КЭ и 184 г мочевины. После мочевины растворится, довести до 400 мл деионизированной водой.
      Кроме того, подготовить 20% 19:01 решение акриламида и 0% ш акриламида решениетолько й буфер и мочевины; Они могут быть смешаны в любом соотношении, чтобы дать какой-либо процент от 0 до 20%; мочевины всегда медленно растворяются.
    4. Подготовка 10-50 мл 10% персульфат аммония (APS) раствора в стерильной деионизированной воды в зависимости от количества гелей должны быть поданы.
    5. Вымойте 20 см х 22 см стекло гелевые пластины с 70% этанола (этанол). Высушите с большими безворсовой салфетки.
    6. Вымойте регулярно пластину с 1 мл 5 N гидроксида натрия (NaOH), а затем повторно вымыть с 70% этанола. Пальто срезанный пластина с гель отталкиваются силицирования раствора вытирая тарелку насыщенным небольшой Kimwipe.
    7. Соберите тарелки, поместив обычный пластину на пустой коробке пипетки или кусок пенопласта, чтобы поднять его из таблицы с очищенной стороной вверх. Lay 0,4 мм проставки на краю каждой длинной стороны.
    8. Осторожно поместите зубчатой ​​пластины над распорок так, чтобы сторона с покрытием будет на внутренней стороне геле. Используйте бритву или другой тонкий инструмент переложитьраспорки для флеш выравнивания на дне и по бокам гелевых пластин затем закрепите с зажимы с каждой стороны гелевых пластин более распорок.
    9. Подготовка 30 мл 8% смеси страниц в гель путем смешивания 15 мл 10% и 6% смешивает каждый в 50 мл трубки. Быстро добавить 300 мкл 10% APS затем 30 мкл N, N, N ', N'-тетра-methylethylenediamine (TEMED) в смесь геля 8%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие проценты гель для отдельных размеров зонда должны быть выбраны экспериментатором.
    10. Крышка и инвертировать 2x и залить раствор в рифленые области гелевых пластин. Обязательно немного поднять тарелки вручную и поддерживать даже залить пока смесь СТР не начнет капать из нижней.
    11. Опустите тарелки обратно в уровне и сразу вставить большой 8-а прямоугольник гребень 0,4 мм х 20 см геля. Мелкие пузырьки вблизи дна не повлияет на ход, но не должно быть никаких пузырей в лунках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: </ STRONG> Место бумажные полотенца на столе под нижней и верхней части геля для захвата любого разлива во время заливки.
    12. Разрешить смесь СТР для полимеризации, по крайней мере 30 мин.
    13. Перенести полимеризованный гель для холодной комнате и собрать электрофореза аппарат. Добавить холодного буфера TBE к линии заполнения на верхней и нижней камерами.
    14. Снимите гребень и использовать бритву для удаления мусора. Установите гель в устройстве и использовать зажим связующего, чтобы удерживать пластину с уплотнением. Добавить холодную КЭ в верхней камере, пока он не впадает в пластинах.
    15. Вымойте скважин с объемом 30 мл syringe/21 G 1-1/2 "иглу, наполненный холодной КЭ только перед загрузкой меченых РНК субстраты. Поместите алюминиевую пластину на задней стороне стекла, чтобы помочь в равномерное распределение тепла во время работы.
    16. Нагрузка 3 мкл маркера и всего 25 мкл реакции транскрипции РНК каждого субстрата в отдельных скважинах. Оставить колодец между аналогичного размера транскриптов в рRevent перекрестное загрязнение. Бромфеноловый синий и ксилолцианола красителей в загрузочном буфере могут быть использованы для оценки размера миграцию на геле.
    17. Запустите гель при постоянном номинальной мощностью, подходящей для размера РНК-зондов (например, 25 Вт в течение 2 часов для зондов 600 нт).
  4. Меченой РНК Выделение и очистка
    1. После электрофореза тщательно слейте верхний камеру аппарата геля. Большая часть радиоактивности будет в геле и нижнюю камеру; Однако верхний буфер может содержать некоторое количество радиоактивного материала.
    2. Используйте лоток для транспортировки гель, если переезд в другой радиоактивного области материала работы. Осторожно снимите распорки, потянув за выступающую часть в сторону от геля.
    3. Аккуратно отделить пластины. Гель должен придерживаться пластины, которая не была силицированного. Место кусок полиэтиленовой пленкой поверх геля и стеклянной пластиной.
    4. Поставьте glogos autorad маркера наклейку на пластиковую оболочку, над апгеля, который является ясным ни образцов.
    5. В темной комнате, поместите кусок авторадиографической фильма по всей пластине и подвергать не менее 1 мин. Разработка фильм.
    6. Поместите проявленную пленку на светлом поверхности. Затем поместите пластиковую сторону геля лицом вниз на пленке и выравнивания autorad маркер из геля к открытой маркером на пленке. После того, как выровнены, использовать черный маркер, чтобы отметить расположение требуемые полосы на стекле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, совместите гели / фильм следующим образом, чтобы вырезать РНК полосы. В темной комнате, поместите обернутое гель на столе, поместите пленку поверх него и поместите кассету (или книгу, и т.д.) в верхней части кусок пленки. Флик на выключатель света в комнате кратко, то обратиться, если выключен. Это будет "предвспышки 'фильм генерации наброски всех скважин на пленке из-за давления / защиты от света, что обеспечивает кассета на вершине. Это облегчает для выравнивания пленки на геле и сократитьиз группы без использования флуоресцентных маркеров.
    7. Осторожно снимите пластмассовую обертку и использовать свежий скальпель или бритву для каждого РНК субстрата и вырезать полосы из геля и поместите в отдельные 1.7 мл микроцентрифужные пробирки. Используйте nutator для нежных волнений во время элюирования.
    8. Добавить 500 мкл буфера для элюции РНК (0,5 М ацетата аммония, 10 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 0,2% SDS) в каждую пробирку. Кратко центрифуги, чтобы погрузить фрагмент геля. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 3-16 ч в зависимости от размера зонда.
    9. Передать весь 500 мкл элюированного материала в новую пробирку. Избегайте передачи любых гель штук, как они будут мешать очистки. Добавить 1 мкл гликогена (20 мг / мл) вместе с 500 мкл холодного, кислого фенол-хлороформ (РНК).
    10. Кратко вихрь, решение должно появиться облачность. Отжим при комнатной температуре на максимальной скорости (~ 16 000 мкг) в течение 5-6 мин.
    11. Тщательно трансFER верхний (водный) слой в новые пробирки собирают как можно больше, избегая при этом мусор из интерфазы. Добавить равный объем хлороформа, переданного водного слоя. Повторите шаг 3.4.10 и передачи верхний (водный) слой в новую пробирку. Добавьте 1 мл ледяной 95-100% этанола и собранного материала. Инкубируют при -80 ° С в течение 10 мин. Примечание: при желании РНК можно хранить в течение ночи.
    12. Гранул РНК в течение 30 мин при 16000 х г при 4 ° С. Тщательно слейте супернатант в радиоактивную контейнер для отходов и добавить 1 мл ледяной 70% молекулярной класса этанола на каждую гранулу.
    13. Гранул РНК при 16000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С, слейте супернатант, спина снова в течение 1 мин и удалить остатки EtOH через пипетку и оставить при комнатной температуре с крышками открытых для обеспечения испарения любого оставшегося этанола.
    14. Ресуспендируют гранул в 20-30 мкл РНКазы без воды. Меченой РНК можно хранить при -80 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Радиоактивный метр обследование должно использоваться на протяжении всей процедуры экстракции чтобы убедиться, что меченый РНК не было потеряно на любом этапе.
  5. Количественное определение меченой РНК для реакции пре-мРНК 3 'мРНК Cleavage
    1. Приблизительная молярность субстратов расщепления с использованием следующей процедуры.
      1. Возьмем, например, 1 мкл 3000 Ки / ммоль [α-32Р] UTP и 10 мКи / мл. (На отчетную дату этикетки, химическая концентрация этого раствора будет 3,3 мкМ UTP. До этой даты она выше и один период полураспада (~ 13 дней) после даты ее ~ 1,6 мм и т.д.) Меченый вклад UTP до конечной концентрации Реакцию обычно незначительна, когда конечная концентрация холодной UTP над UTP К М используется. Т7 РНК-полимераза К м для UTP составляет 114 мм 15.
      2. Развести 1 мкл в 39 мкл воды. Затем добавить 1 мкл разбавленной [α- 32 P] UTP в соответствующем объеме сцинтилляционной жидкости в сцинтилляционный флакон. (ПРИМЕЧАНИЕ: сцинтилляционную жидкость на самом деле не нужны для этого удельной активности 32 Р, как подсчет Черенкова даст надежные CPM значения слишком Проверьте против руководства сцинтилляционный выбрать правильный канал для подсчета Черенкова и рассчитывать объем в 1 мл в течение 1 мин.).
    2. Развести 1 мкл каждого меченого субстрата РНК в отдельных ампулах с равным количеством сцинтилляционной жидкости, используемой на предыдущем этапе. Убедитесь в том, чтобы иметь флакон с только сцинтилляционной жидкости для расчета фона. Количественного радиоактивность в сцинтилляционном счетчике.
    3. Умножьте число импульсов за мин (CPM) для [α-32 Р] UTP образца на 40 фактор в начальной разбавления и вычитания фона, полученный в сцинтилляционной жидкости в одиночку. Умножение счетчики для каждого зонда РНК на сумму РНКазы свободной воды (20-30 мкл) используется для ресуспендируют RNА зонды. Это дает общий СРМ очищенной РНК.
      Пример:. Максимальная цена за тысячу показов = (копий в минуту [α-32 P] UTP - фон) х 40 Маркированный Образец РНК 1 = 20,000 копий в минуту х 20 = 400 000 копий в минуту (если 20 мкл для ресуспендированием)
    4. Если сумма, кроме 1 мкл [α-32 Р] UTP была использована для расшифровки стенограммы, то фактор этот объем в окончательный срм [α-32 Р] UTP путем умножения копий в минуту для [α-32 P] UTP образец на величину используется.
      Пример: 2 мкл [α-32P] UTP используется, чтобы сделать расшифровку. Рассчитанное импульсов в минуту в течение 1 мкл [α-32P] UTP является 500000 импульсов в минуту. Умножьте 500 000 * 2 = 1000000 копий в минуту
    5. Разделите рассчитывается меченой РНК ПСК расчетной копий в минуту для одной только [α-32 Р] UTP. Это будет примерно оценить процент с надписью UTP включены.
      Пример: 400000/1000000 = 0,40 или 40%включенный
    6. Поскольку фермент не может отличить изотопов, такой же процент меченого UTP и немеченого включен в РНК в процессе транскрипции. Рассчитать количество холодной UTP в молях, которая добавляется к реакции транскрипции (0,5 мкл раствора 10 мМ = 5,0 х 10 -9 моль UTP).
    7. Умножить UTP моль в реакции на процент Incorporated (известного из горячего UTP подсчета выше), а затем разделить, что по количеству уридинов в последовательности РНК.
      Пример: 5,0 х 10 -9 моль UTP х 0,40 = 2 х 10 -9 моль UTP
      2 х 10 -9 моль UTP / 73 ЕД в стенограмме = 2,7 х 10 -11 моль РНК
    8. Преобразование молей РНК молярности делением объема восстановленного раствора РНК ресуспендирования.
      Пример: 2,7 х 10 -11 моль РНК / 20 мкл = 1370 нМ РНК. Для T7 РНК-полимераза транскриптов, сделанных от около 1 мкг линейнойIzed плазмиды и ресуспендировали в 20 мкл воды, значения от 200 до 1400 нМ являются типичными.
      Примечание: молярная концентрация РНК используется для того, чтобы конечный пре-мРНК концентрация субстрата в реакции расщепления в пробирке составляет менее 5 нМ в реакции расщепления. Эффективность Расщепление может уменьшить, если концентрация РНК поднял значительно выше 5 нМ.

4. 3 'мРНК Расщепление Реакция

  1. Расщепление Реакция Подготовка реагентов
    1. Подготовьте все реагенты, необходимые дл проведени реакции расщепления. Сделать 10% поливинилового спирта (ПВС) на кипящей воды и медленно добавить правильное количество ПВА порошка. 10% ПВА будет вязким и требуется время, чтобы распустить. Хранить при комнатной температуре или -20 ° С.
    2. Подготовьте 1 М креатин фосфата (СР) и хранить при температуре -80 ° С. Важно использовать 1М CP, которое меньше 4 месяца.
    3. Подготовьте 1 М DTT и магазинпри -20 ° С. Выполняет свежее 0,2 М DTT разведения от 1 М DTT непосредственно перед делать реакцию расщепления.
    4. Подготовка ETS (расщепление универсальное решение): 10 мМ Трис рН 7,8, 10 мМ ЭДТА, 0,5% SDS. Хранить при комнатной температуре.
  2. Расщепление Реакция
    1. Нагреть меченой РНК до 80 ° С в течение 2 мин, затем поместить на льду.
    2. Аккуратно вихрь, а затем вращать 10% ПВА на максимальной скорости в течение 2-3 мин для удаления пузырьков.
    3. Мастер смесь 1: Для одного реакции, объединить 3,125 мкл 10% ПВА, 0,625 мкл 1 М CP, 0,25 мкл 0,5 М тРНК, 0,125 мкл 100 мМ дАТФ, 0,13 мкл 40 ед / мкл ингибитора РНКазы, 0,25 мкл 0,1 М ЭДТА рН 8 , 0,1 мкл 0,2 М DTT, и 0,645 мкл РНКазы без воды. Внесите 5,25 мкл основной смеси 1 раз в трубке на льду.
    4. Мастер микс 2: Используйте 6,25 мкл / реакция ядерных экстрактов в концентрациях, превышающих 2 мг / мл. Ядерные экстракты могут быть разбавлены буфером D 50, если урожденнаяДед.
    5. Объедините 6,25 мкл ядерного экстракта с ранее обойтись 5,25 мкл мастер-микс 1. Добавить 1 мкл меченой РНК субстрата, разбавленным до 50 нМ. С другой стороны, РНК может быть включен в Master Mix 1 при условии, что он добавляется после ингибитора РНКазы, DTT и тРНК. Примечание: Use <5 нМ меченого субстрата РНК.
    6. Аккуратно вихрь и быстро спин каждого образца для удаления пузырьков. Инкубировать при 30 ° С в течение до 2 часов, но время, конечно должны быть выполнены для достижения оптимального результата. Более длинные инкубации может увеличиться деградации фона.
  3. Протеиназы К Пищеварение и очистка
    1. Удалить образцы с огня и добавить 182,5 мкл ETS решения остановки в каждой реакции. Добавьте 5 мкл 20 мг / мл протеиназы К и образцы инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Извлечение РНК путем добавления 1 объем (200 мкл) кислоты фенол-хлороформ, 1/10 объем (20 мкл) 3 М натрийацетат, и 1 мкл 20 мг / мл гликогена. Продолжайте экстракции, как описано в разделах 3.4.9-3.4.14.
    3. После того, как добыча РНК завершена, обязательно удалите все остатки EtOH. Ресуспендируют гранул в 8 мкл буфера для загрузки (90% формамид, 10 мМ ЭДТА, с бромфенолового синего (БОС) (и или ксилолцианола синий)). Образцы можно хранить при -80 ° С или продолжить гель-электрофореза.
  4. Расщепление Реакция электрофореза
    1. Подготовьте 6% акриламида гель Как отмечалось ранее в разделах 3.3.1-3.3.17 с некоторыми изменениями. Используйте 20 см х 42 см гелевые пластины секвенирования с 2 зажимы на каждой длинной стороне. Используйте расческу с 32-а и подготовить 40 мл смеси геля.
    2. Загрузить гель с 3 мкл маркера и 5 мкл каждого образца. Оптимизация настроек электрофореза в соответствии с заранее расщепления и расщепляют продукции размеров.
    3. Когда электрофорез завершена, следуйте разделы 3.4.1-3.4.3 </ STRONG> разбирать гель. Вместо полиэтиленовой пленкой, вырезать кусок фильтровальной бумаги с размером гелевой пластины и осторожно поместить его на одной стороне открытой геле.
    4. Нажмите фильтровальную бумагу твердо на гель, затем переверните на тарелку так, чтобы бумага фильтр на дне, и стекло сверху. Плотно прижмите стакан на стол, чтобы убедиться, что гель захвата фильтровальную бумагу равномерно.
    5. Медленно очистить фильтровальной бумаги, который должен иметь гель, прикрепленный к нему, от одного из коротких концов, пока все фильтровальной бумаги с прикрепленным гелем не будет удален из стеклянной пластины.
    6. Изолируйте открытый сторону гель полиэтиленовой пленкой. Лента пластмассовую обертку к фильтровальной бумаге.
    7. Поместите гель на гель сушилка с сторону фильтра, обращенной вакуумный сторону. Сухой в течение 15 мин или до геля должна быть абсолютно сухой.
      Примечание: Если гель сушилка не доступен, рентгеновской пленки могут быть использованы для визуализации РНК группы. Экспозиция должна осуществляться в Бордовыйт-плотно кассета с экраном интенсификации при температуре -80 ° С. Экспозиция определяется опытным путем. Внимание: низкие гели процентов акриламида может треснуть при замерзании.
    8. Гель теперь могут быть использованы, чтобы выставить фильм или использоваться с фосфо-томографа. Экспозиция зависит от прочности меченой РНК. Первоначально могут быть использованы экспозиции 24 часа в сутки. При использовании пленки, подвергают при -80 ° С с экрана интенсификации и позволяют нагреться до комнатной температуры до разработки.
    9. Измерьте соотношение между скола и не-расщепленной РНК в каждом образце для количественного эффективность расщепления.

Результаты

Представительства результаты расщепления анализа РНК поли (А) участки ВИЧ-1 (рис. 2). Можно заметить, нерасщепленного субстрата РНК, которая является самым медленным мигрирующий группа в верхней части геля. Удельный расщепляется продукт является наиболее интенсивным короче гр?...

Обсуждение

Реакция расщепления в пробирке пре-мРНК 3 ', осуществляется в ядерных экстрактов HeLa клеток или с факторами расщепления фракционированных из этих экстрактов, позволило выявить факторы расщепления основных и их основных комплексов 16-21. Многие другие белки, ассоциированные с...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

С.В. благодарен за финансовой поддержке со стороны NIH K22AI077353 и Landenberger Foundation. KR благодарит финансирование от NIH (5SC1GM083754).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Celstir flaskWheaton356884Different sizes available
4 position slow speed stirrerVWR12621-076
Swinging bucket centrifugeBeckman CoulterAllegra x-15R with SX4500 Rotor
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417REppendorfRefridgerated
Thermomixer incubatorEppendorf
250 ml conical tubesCorning430776
50 ml conical tubesBD Falcon352098
Ultraclear centrifuge tubesBeckman Coulter344059
JOKLIK modified MEMLonza04-719Q
Fetal bovine serumAtlasF-0500-AHeat inactivated
L-glut:pen:strepGemini Bio-Products400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0Mediatech46-031-CM
Magnesium chlorideFisherBP214-500
Potassium chlorideMP Biomedicals194844
HEPESFisherBP310-500
DTTAlexis Biomedicals280-001-G-010
GlycerolFisherBP229-4
5 M sodium chloride solutionMediatech46-032-CV
EDTA 0.5 M solutionSigma-AldrichE7889-100ml
EDTAFisherBP120-500
PMSFThermo Scientific36978
Ammonium sulfateFisherA702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tabletsRoche04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes KitThermo Scientific66372MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder setSigma-AldrichD9938-1SETDifferent sizes available
Expand high fidelity PCR kitRoche11 732 650 001
10 mM dNTP MixInvitrogenY0225610 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kitAmbionAM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA capNew England BiolabsS1404S
Century Marker Template PlusAmbionAM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCiPerkin ElmerBLU507H250UC
Gel loading buffer IIAmbion8546G
DEPC treated waterAmbionAM9906
10x TAEFisherBP13354
10x TBEAmeresco Life Sciences0658-4L
10x PBSFisherBP399-20
UreaFisherBP169-212
Ammonium persulfateBio-Rad161-0700
TEMEDFisherBP150-20
Ammonium acetateFisherA637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamideBio-Rad161-0144
GlycogenRoche10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proofAcros61509-0040
Acid phenol:chloroformAmbion9720For RNA
Scintilation fluidFisherSX18-4
Rnase inhibitorPromegaN261B
Polyvinyl alcohol- PVASigma-AldrichP8136-250G
Creatine phosphateCalbiochem2380
100 mM dATPFisherBP2560-4
SDSAcros23042-5000
Proteinase KFisherBP1700-100
Adjustable sequencing unitSigma-AldrichZ351881-1EA
Binder clipsOffice Depot838-056
20 cm x 42 cm glass platesSigma-AldrichZ3525431 SET
20 cm x 22 cm glass platesSigma-AldrichZ35252-71 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling platesSigma-AldrichZ3526671 EA
0.4 mm x 22 cm spacersSigma-AldrichZ35230-61 SET
0.4 mm x 42 cm spacersSigma-AldrichZ352314-11 SET
8-well combSigma-AldrichZ35195-41 EA
16-well combSigma-AldrichZ3519621 EA
32-well combSigma-AldrichZ3519701 EA
Gel repel coatingC.B.S. ScientificSGR-0401or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tipsRaininGT-10-40.1-10 μl
Sequencing PowerPac HVBio-RadPowerPac HV5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583Bio-RadModel 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryerBio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markersAgilent420201
Film 8 x 10MidsciBX810
Film 14 x 17PhenixF-BX1417
Autoradiography cassetteFisherFBCA 14178 x 10 size available

Ссылки

  1. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  2. Wahle, E., Ruegsegger, U. 3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes. FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).
  3. Colgan, D. F., Manley, J. L. Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation. Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).
  4. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA biology. 9, 563-576 (2012).
  5. Danckwardt, S., et al. The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations. Blood. 104, 428-435 (2004).
  6. Moreira, A., et al. The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).
  7. Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2. Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).
  8. Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal. Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).
  9. Moore, C. L., Sharp, P. A. Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate. Cell. 41, 845-855 (1985).
  10. Gilmartin, G. M. . mRNA formation and function. , 79-98 (1997).
  11. Wahle, E., Keller, W. . RNA Processing. Vol. II. , 1-34 (1994).
  12. Chabot, B. . RNA Processing Vol I. 1, 1-29 (1994).
  13. Valente, S. T., et al. HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8. Mol Cell. 36, 279-289 (2009).
  14. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
  15. Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. 2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase. Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).
  16. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).
  17. Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs. Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).
  18. Takagaki, Y., et al. A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs. Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).
  19. Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits. Mol Cell. 1, 243-253 (1998).
  20. Vries, H., et al. Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors. EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).
  21. Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing. Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).
  22. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Mol Cell. 33, 365-376 (2009).
  23. Bentley, D. L. Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).
  24. Tian, B., Manley, J. L. Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it. Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).
  25. Ryner, L. C., Manley, J. L. Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro. Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).
  26. Hirose, Y., Manley, J. L. Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro. J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).
  27. Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage. RNA. 15, 483-492 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

873

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены