사전 mRNA의 기판의 3 &#39;끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석<em&gt; 시험관</em

요약

RNA 중합 효소 II는 성숙의 mRNA의 3 '말단 확장되는 전구체 RNA를 합성한다. 성숙한 RNA의 끝은 절단 복합체의 효소 활동을 통해 RNA 염기 서열에 의해 결정 사이트에서 cotranscriptionally 생성됩니다. 여기에 세부 사항에게 체외에서 분열 반응을 연구하는 방법을 우리는.

초록

포유 동물의 mRNA의 3 '끝은 RNA 중합 효소 II (RNPII)에 의해 전사의 갑작스러운 종료에 의해 형성되지 않는다. 대신 RNPII 성숙 RNA를 끝 뒤 전구체의 mRNA를 합성하고, 효소 활성의 활성 프로세스가 특정 사이트에서 요구된다. 전구체 RNA의 절단은 일반적으로 CA 디 뉴클레오티드 후 합의 폴리 A 사이트 (AAUAAA)에서 다운 스트림 NT 10-30을 발생합니다. 절단 단지, 약 800 kDa의의 인성 단백질 복합체의 단백질이 특정 핵산 분해 효소의 활동을 수행. 특정 RNA 서열은 상류와 폴리 A 사이트의 하류 절단 단지의 모집을 제어 할 수 있습니다. 즉시 절단 후, 사전의 mRNA는 성숙 안정 RNA 메시지를 생산하는 폴리 A 중합 효소 (PAP)에 의해 폴리아 데 닐화됩니다.

RNA 전 사체의 3 '말단의 처리는 특정 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 기판으로 세포의 핵 추출물을 사용하여 연구 할 수있다. 요컨대, 긴 ^{32 <}/ SUP> P-표지 uncleaved 전구체 RNA는 시험 관내에서 핵 추출물과 함께 배양하고, 절단은 겔 전기 영동 및 오토 라디오 그래피에 의해 평가된다. 적절한 분열이 발생하면 '5 짧은 제품이 감지 및 정량화 절단. 여기서는, 예를 들어, 사용 상세히 HIV-1의 mRNA의 3 '말단 처리를 절단 분석을 기술한다.

서문

가장 성숙한 진핵 메시지 RNA를 (의 mRNA)의 생합성은 모자를 씌우는, 접합 및 폴리아 데 닐화 등 여러 가지 전사 후 수정이 필요합니다. 이러한 수정은 일반적으로 올바른 처리 ^한되도록 강하게의 mRNA의 안정성을 증가시키기 위해 결합된다.

3 '포유류 사전의 mRNA의 최종 형성을 5 아데 닐 잔기 첨가하여 초기 RNA endonucleolytic의 절단에 의해 생성 된'폴리 (A) 중합 효소 (PAP) ^2-4해서 제품을 절단. 포유 동물에서, 분열 특정 사전 RNA 서열에 조립 약 800 kDa의,의, 다 성분 단백질 복합체에 의해 달성된다. 폴리 (A) 신호 순서, 고도 보존 정식 hexanucleotide 시퀀스 AAUAAA은 약 10 ~ 30 NT 하류의 절단 부위를 지시합니다. 이 사이트는 특히 절단 및 폴리아 데 닐화 특이 요인 (CPSF) 및 73 kD의 서브 유닛에 의해 인식CSPF는 효소의 활동이 포함되어 있습니다. 분열 자극 인자 (인 CstF)는 다운 스트림 폴리 (A) 사이트의 더 퇴화 GU-또는 U 풍부한 요소 순서를 결합한다. 또한 포유류의 분열 인자 I (CFIm), 및 포유류의 분열 요인 II (CFII)을 절단입니다이 필요합니다. CFIm 유전자의 수에 대해 정의하고 중요한 생리적 과정 ^5-8에 관여하는 것으로 보인다 된 상류 시퀀스 요소 (사용)에서 특정 UGUA (N) 사이트를 바인딩합니다.

시험관 내에서, RNA 프로세싱 반응은 일반적으로 방사성 표지 된 RNA ^9-12 기판의 사용에 의해 분석된다. 이들은 박테리오파지 프로모터 T7 또는 SP6에서 실행 오프 전사에 의해 합성 될 수있다. 이전 특징으로되지 않은 폴리아 데 닐화 사이트를 연구 할 때, 중요한 하류 서열의 cDNA에 존재하지 않을 수도로서, RNA 기질을 생성하는 게놈 DNA가 아닌하는 cDNA를 사용하는 것이 필요하다. 적어도 150 NT를 upstrea를 포함하도록 설계 기판m 50 NT 하류 성숙한 mRNA의의 분열 사이트 / 끝에서. 분열 생성물은 기판보다 빠르게 마이그레이션; 다른 단편은 비특이적 핵산 분해 효소 작용에 의해 생성 될 수 있기 때문에, 반응의 특이성은 올바른 처리 신호 계열에 대한 의존도에 의해 확인되어야한다. 따라서, AAUAAA 순서 (예를 들면 AAGAAA)에 점 돌연변이를 가진 RNA의 기판 절단 반응에 대한 부정적인 제어 역할을합니다.

방사성 표지 된 RNA의 소량의 절단 반응에 사용되는 것을 감안할 때, 대부분의 핵 추출물에서 높은 풍부 본 RNases 문제가 될하고 추출물 제조를위한 출발 물질의 선택을 제한 할 수있다. 헬라 세포는 내생 RNases의 낮은 수준을 포함​​, 따라서 이러한 분석에서 잘 수행하는 경향이있다.

생체 내 및 시험 관내에서 RNA 기판의 endonucleolytic 분열은 바로 폴리 (A)뿐만 아니라, 목 뒤에있다의 쪼개진 중간이 검출 수량에 존재하지 않습니다. 따라서, 특정 RNA 서열 또는 절단 반응에 관여하는 단백질 중 하나를 연구하기 위해 실험을 발생 폴리아 데 닐화를 방지 조건에서 수행됩니다. 하나는 분열 반응을 해치지 않고 폴리아 데 닐화를 중지 할 수 있도록 더 폴리아 데 닐화에 분열의 의존성, 또는 그 반대는 없다. 따라서, ATP는 단일 염기는 폴리 (A) 위치에서 통합 될 수 있으며, 단지 절단 RNA를 검출 할 수 있도록 3 '히드록시기 결여 사슬 종결 유사체로 대체된다.

복잡성과 분석이 유형의 특수성 높은 수준을 감안할 때, 우리는 체외에서 mRNA의 전구체의 절단 / 폴리 (A) 기계에 의해 endonucleolytic 분열을 공부 자세한 설명을 동영상 프로토콜을 설명합니다. 우리는, 관할 핵 추출물을 제조 방사성 표지 RNA 기질을 생성, 분열 반응을 수행하고, 그 결과를 분석하고 해석하는 방법을 설명보내고 제품.도 1은 분해 분석에 사용되는 HIV-1 이전의 mRNA의 3 '말단에 대해 코딩하는 RNA를 기판의 일례를 나타낸다. HIV의 RNA 게놈의 3 '말단은 예컨대 폴리 (A)의 사이트, G+ U 리치 영역 및 모든 바이러스의 mRNA 전 사체 ^(13)의 효율적인 숙성에 필요한 USE 소자 등 많은 중요한 조절 서열로 구성된다 . 이 예에서 우리는 입력 RNA 기판은 338 NT 및 분열 237에 NT 것으로 기대합니다. 폴리아 데 닐화이 발생하도록 허용 된 경우, 제품의 얼룩은 237과 437 NT 사이에서 관찰된다.

프로토콜

서스펜션에 자기편 세포의 1. 적응

(이것은 선택적인 단계이다. 서스펜션 세포 그러나 일반적으로 접시에서 자란 세포가 또한 사용될 수있다 나은 핵 추출물을 만든다.)

1. 페니실린 스트렙토 마이신 : 5 ~ 10 %의 신생아 혈청 또는 소 태아 혈청과 1 %의 L-글루타민 Joklik의 수정 MEM을 사용하여 서스펜션의 성장에 부착 세포를 적응. 8 % CO _2와 37 ° C에서 필터 캡 스피너 플라스크에 세포를 전파.
2. 세포를 적응하면, 500 ㎖ 스피너 플라스크에 100 ㎖로 시작합니다. 최소 0.3 × 10 ⁶ 세포 / ml을 유지하고 적절한 성장 속도가 (일반적으로 2-6주)에 도달 할 때까지 매 1-2 일 매체를 교체하십시오. . 일단 적응, 서스펜션의 헬라 세포는 대략 매 24 시간 주를 두 배로해야 세포가 정상 두배 속도로 돌아에 대한 적응 단계 동안, 시간이 좀 걸릴 것입니다.
3. 서재에서 세포를 유지원하는 최종 용적에서 0.5-0.8 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 SITY (일반적으로 1-10 L)
4. 세포는 통상적으로 중앙 로그 상 (대략 0.5-0.65 × ¹⁰⁶ 세포 / ml 및> 90 % 생존)에 수확한다. 문화 미디어의 원하는 금액에 해당하는 크기의 스피너 플라스크를 사용합니다.

2. 핵 추출물

1. 버퍼 및 시약 준비
   참고 : 적출이 수정 Dignam 외 여러분 다음 수행 (1983 년) ¹⁴ 핵 추출물 절차가..
   1. , 1X 인산염 완충 생리 식염수를 준비, 버퍼 C 버퍼, 4 ℃에서 추출 및 저장을 진행하기 전에 하루 D (표 1) 버퍼
      참고 : 높은 수율은 일반적으로 갓 준비 버퍼 달성; 그러나, 버퍼가 몇 주 동안 안정하다. 그것은 모든 버퍼들, 장치 및 장비를 미리 냉각하고, 추출의 전체 차갑고 유지되는 것이 중요하다.가능한 한 많은 단계의 냉장실을 사용 및 / 또는 얼음에 모든 것을 유지. 사용 직전에 DTT 및 PMSF를 추가합니다.
2. 세포를 수집 및 세척
   1. 스윙 또는 고정 각 로터와 원심 분리기에서 4 ° C에서 5 분 500 XG에 네 개의 250 ML 원뿔 병 스핀에 세포를 붓는다. 캔트 상층 액을 각각의 병에 다른 250 ㎖의 세포 배양 배지를 추가합니다. 모든 세포 펠렛 될 때까지 반복 회전합니다.
   2. 한 250 ML 원뿔 병에 250 얼음처럼 차가운 PBS의 ML과 수영장의 총 결합 된 최종 펠렛을 Resuspend. 스윙 버킷 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 스핀.
   3. 상층 액을 붓고 총 부피가 50 ㎖를 초과하지 않도록 얼음처럼 차가운 PBS에 세포 펠렛을 resuspend. 피펫과 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브로 전송을 통해 펠렛을 풉니 다.
   4. 스윙 버킷 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 500 XG에 다시 세포를 스핀. supernatan을 부어T와 추정하고 가능한 한 정확하게 세포 펠렛 볼륨 (CPV)를 참고. 펠릿은 관에 볼륨 표시보다 낮은 경우, 비교를 위해, 별도의 정합 튜브에 물을 사용한다.
3. 세포 용해
   1. A. 재현 탁에게 예상 CPV 5 볼륨을 사용하여 버퍼에 펠렛을 버퍼에 DTT를 추가합니다. 펠렛을 끊고 10 분 동안 얼음에 부화 피펫.
   2. 스윙 버킷 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 931 XG에서 세포를 스핀.
   3. 조심스럽게 대신 경사 분리의 뜨는을 대기음. 펠릿의 볼륨으로 인해 세포의 팽창에 크기가 약 2 배 증가한다.
   4. 세포에 버퍼의 1 CPV를 추가합니다. 조심스럽게 펠렛을 분쇄하고 얼음에 미세 원심 분리 튜브에 작은 나누어지는 (50 μL)를 제거합니다. 얼음에 냉장 적절한 크기 다운스 균질 기 (일반적으로 15 ㎖의 크기)에 재현 탁 세포를 전송합니다.
   5. 타입 B의 12 ~ 15 느리지 만 꾸준한 스트로크 (TIG와 세포를 LyseHT) 유. 해물의 작은 나누어지는을 제거하고 트리 판 블루 염색에 의해 완전 용해 (그대로 작은 어두운 핵이 부어 세포에 비해)에 대한 현미경으로 검사합니다. 그대로 세포가) 명확 할 것이다. 90 %의 용해가 달성 될 때까지 homogenation을 계속 여기서 중단, douncing에 부정적인 핵 추출물의 품질에 영향을 줄 수 있습니다.
   6. ultraclear 초원 심 분리기 튜브에 해물을 전송하고 전체 볼륨을 확인합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,069 XG에 튜브와 스핀을 무게로 균형을
      참고 : 동일한 튜브는 다음 단계에서 더 빠른 속도로 방사되므로 초 원심 분리기가 낮은 회전 속도에도 불구하고이 단계에서 사용된다. 이 스핀 수거하고 세포질 S100 추출물 위해 사용될 수있다 상술 cloudier 상등액과 튜브의 하단을 덮는 매우 타이트 펠릿을 수득한다. 상기 튜브의 상단에 표시 지방층이 있으면 그것을 제거 할 수있다.
   7. 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 anoth로 전송.. 어 튜브 핵 펠렛을 방해하지 않도록 주 : 포장 핵 볼륨 (PNV)를 결정하기 위해 상층 액의 최종 부피를 알고하는 것이 중요 할 것입니다.
4. 핵 추출물의 제조
   1. 상층 액을 조심스럽게 제거되면, 같은 튜브에 4 ° C에서 15 분 동안 25,453 XG에서 원유 핵 추출물 펠렛을 재 스핀.
   2. 나머지 뜨는을 제거 (분명히 소량의 액체이어야 함) 이전 상층 액을 컬렉션에 추가합니다. 상층 액의 최종 부피를 측정한다. 원래 해물의 전체 볼륨에서이 볼륨을 빼서 PNV를 계산 이전에 언급했다. 펠릿이 충분히 큰 경우에 대안 적으로, 그 부피는 동일한 튜브에 물이 비슷한 볼륨 비교함으로써 추정 될 수있다.
   3. 버퍼 C (세포의 약 1 ㎖ / ㎖) 1 PNV 볼륨을 추가합니다. 조심스럽게 피펫 팁으로 펠릿을 제거하고 적절 SI로 전송데이빗 다운스 균질. 전과 같은 균질화기를 사용하는 경우, 멸균 증류수로 균질화기를 사전 헹굼.
   4. 꽉 유봉을 사용하여 다운스 호모 게 나이저를 통해 5 ~ 10 스트로크 ~와 펠렛을 재현 탁.
   5. 냉각 튜브에 균질 핵 해물을 전송하고 4 ℃에서 30 분 동안 반전에 의해 혼합 볼륨이 충분히 큰 경우, 자기 교반 플레이트 및 스핀 막대를 사용하여 교반한다.
   6. 새로운 ultraclear 원심 분리 관에 해물을 전송하고 4 ℃에서 30 분 동안 25,453 XG에 스핀 펠릿은 소형이어야한다. 스핀 전에 약 5 분이 완료되면 적절한 분자량 차단 (MWCO)이 투석 카세트 나 튜브를 수화 (예를 들어 7,000 kDa의).
   7. 전송 피펫을 사용하여 냉장 원뿔 관에 튜브에서 뜨는 (핵 추출물)을 제거 후 투석을 진행합니다.
5. 투석
   1. 제조 업체에 따라 수화 투석 카세트로 추출물을 주입 '의 지시 및 교반하면서 4 ° C에서 1 시간 동안 버퍼 D ₍₅₀₎ 500 ㎖에 핵 추출물을 dialyze.
   2. 500 ml의 신선한, 얼음처럼 차가운 버퍼 D _(50)와 버퍼를 교체하고 4 ℃에서 추가로 4 시간 동안 dialyze 이 4 시간 단계 대신 두 개의 2 시간의 변화로 분할 할 수 있습니다.
   3. 투석 카세트에서 추출물을 제거하고 냉각 튜브로 전송할 수 있습니다. 4 ° C에서 1,500 XG에서 5 분 동안 추출 스핀
   4. 냉장, 에펜 도르프 튜브에 추출 나누어지는 액체 질소 (나누어지는 당 50 ~ 100 μL)에 동결 스냅. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 보관.

3. R​​NA 프로브 합성

1. 템플릿 준비
   참고 : 전사에 사용되는 템플릿 PCR 단편 또는 T7 또는 SP6 프로모터 상류와 바로 인접 원하는 프로브 시퀀스를 포함하는 플라스미드 수 있습니다. 플라스미드 템플릿 INT​​의 템플릿 시퀀스의 하류 선형화해야erest. 우리는 PCR 템플릿에서 높은 수율을 지적했다.
   1. T7/SP6 프로모터는 PCR 반응 동안 삽입 될 수있다. 대상 시퀀스의 T7/SP6 프로모터 상류와 센스 프라이머를 디자인합니다.
   2. 고 충실도 중합 효소를 사용하여 제조 업체의 지시에 의하여 PCR을 통해 템플릿 2-3 반응에 원하는 순서를 증폭.
   3. 상응하는 반응을 결합하여 겔 추출 정제.
   4. 시퀀스 PCR 제품은 템플릿의 정확도를 확인한다. (선택 사항)
2. ³² P 라벨링와 RNA 전사
   1. 다음과 같은 수정과 프로모터 (SP6 또는 T7)와 호환되는 상용 키트와 템플릿의 1 μg에서 시험 관내 전사에서 수행합니다. 신선한 3,000 실라 / 밀리몰 ^[α-32 P] UTP의 1 μL, 10 mM의 차가운 UTP 0.5 μL, 10 mM의 GTP의 0.1 μL, 10 mM의 M7G (5 ') PPP (5') G RNA의 0.9 μl를 사용하여 20 μL의 총 최종 부피에있는 모자.
      주 : (: GTP 캡) 10시 1분 비율 G-캡 핵 추출물에서 RNA 전 사체의 안정성을 향상시킵니다. 차가운 UTP는 제한 시약 인에서 ³² P-UTP를 방지하기 위해 추가됩니다.
   2. G 캡없이 위의 표시로 RNA의 크기 사다리를 합성. 상업 템플릿은 RNA 크기 마커를 생성 할 수 있습니다.
   3. (SP6 사용 40 ° C의 경우) 1 시간 동안 37 ° C에서 전사 반응을 품어. 완료되면, 37 ℃에서 15 분 동안 템플릿의 DNA 분해 효소의 소화를 수행
   4. 소화 후, RNA의 기판에 0.5 M EDTA의 1 μL 및로드 버퍼 II의 5 μl를 추가합니다. 마커에 20 μL 로딩 버퍼 II를 추가합니다.
   5. 3 분 동안 95 ° C에서 RNA 마커 및 프로브를 가열 한 후 얼음에 배치합니다.
3. 폴리 아크릴 아마이드 젤 주조 / 프로브 전기
   1. 6 %의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAGE) 혼합 및 10 % PAGE 400 ㎖의 1 L를 준비합니다. 비스 : 6 %를 만들기 위해, 40 % 19시 1분 아크릴 아미드 150 ㎖를 혼합10X 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 100 ㎖와 460g의 요소와 crylamide. 낮은 열 (약 50 ~ 80 ° C)를 적용하면서 멸균 탈 이온수 800 mL로 가져와 열판에 저어. 탈 이온수 1 L에 완료.
      주 : 반응은 흡열. 난방 요소의 가용화를 촉진합니다. 즉시 요소가 용해 될 때 열에서 제거하고 탈 이온수로 1 L에 솔루션을 가져옵니다. 대안 적으로 실온에서 밤새 교반 하였다; 너무 많은 열 중합을 개시 할 수 있습니다.
   2. 상온에서 알루미늄 호일 및 매장 빛에서 페이지 믹스를 보호합니다. PAGE 믹스는 미리 준비하고 몇 달 동안 안정 될 수있다.
   3. 비스 - 아크릴 아미드, 배 TBE 40 ㎖와 184g의 요소 : 40 % 19시 1분 아크릴 아미드 100 ㎖를 결합하여 10 % PAGE 믹스 400 ㎖를 준비합니다. 요소 해소 한 후, 탈 이온수 400 mL로 가져옵니다.
      대안 적으로, 20 % 19시 1분 아크릴 아미드 용액 및 0 % 아크릴 아미드 용액을 제조 WI번째 버퍼 요소에만; 이들은 다음 0과 20 % 사이의 임의의 백분율을 수득 어떠한 비율로 혼합 될 수있다; 요소는 항상 용해 속도가 느립니다.
   4. 캐스팅되는 겔의 수에 따라 멸균 증류수에 10 %과 황산 암모늄 (APS) 용액 중에서 10 ~ 50 ㎖를 준비.
   5. 70 % 에탄올 (EtOH로)와 20cm X 22cm 유리 겔 접시를 씻으십시오. 큰 보풀이없는 잎사귀와 건조.
   6. 5 N 수산화 나트륨 (NaOH를) 1 ㎖로 일반 판을 세척 한 후 70 % EtOH로 rewash. 코트 포화 작은 킴 와이프와 함께 접시를 닦아 젤 격퇴 siliconizing 솔루션 톱니 판.
   7. 빈 피펫 팁 상자 또는 위로 향하게하여 청소면 테이블에서 상승하는 스티로폼 조각에 일반 판을 배치하여 플레이트를 조립합니다. 각각의 긴 쪽의 가장자리에 0.4 mm의 스페이서를 놓습니다.
   8. 코팅 된면이 겔의 내부에있을 수 있도록 조심스럽게 스페이서에 톱니 모양의 판을 놓습니다. 이동하는 면도칼이나 다른 얇은 기기를 사용겔 접시의 바닥과 측면에서 평면 정렬을위한 스페이서는 스페이서에 젤 플레이트의 양쪽에있는 바인더 클립으로 고정합니다.
   9. 15 10 % ml의 6 %는 50 ML 튜브에 각각의 믹스를 혼합하여 겔 당 8 % PAGE 믹스 30 ㎖를 준비합니다. 빨리 8 % 젤 믹스 N, N, N '의 30 μL, N'-테트라 메틸 에틸렌 (TEMED) 다음에 10 % APS의 300 μl를 추가합니다.
      주 : 개별 프로브 크기에 적합한 젤 비율이 실험에 의해 선택되어야한다.
   10. 모자와 반전의 2 배 겔 플레이트의 홈 영역에 솔루션을 붓는다. 약간 손으로 접시를 올리고 PAGE 믹스 바닥 밖으로 똑똑 떨어지는 것을 시작할 때까지도 부어 유지해야합니다.
   11. 다시 레벨로 판을 내리고 즉시 0.4 mm X 20cm 젤 큰 8 아니라 사각형의 빗을 삽입합니다. 하단의 작은 거품은 실행에 영향을 미치지 않습니다,하지만 우물에 거품이 없어야합니다.
       참고 : <젤의 하단과 상단 아래 표에 / strong>을 장소 종이 타월 붓는 동안 유출을 캡처.
   12. PAGE 믹스는 적어도 30 분 동안 중합 할 수 있습니다.
   13. 추운 방에 중합 된 젤을 전송하고 전기 장치를 조립한다. 상부 및 하부 챔버에 충전 라인에 차가운 TBE 버퍼를 추가합니다.
   14. 빗을 제거하고 이물질을 제거하는 면도기를 사용합니다. 장치에 젤을 설정하고 씰 플레이트를 잡아 바인더 클립을 사용합니다. 이 판에 흘러 나올 때까지 상단 챔버에 찬 TBE를 추가합니다.
   15. 30 ㎖로 우물을 씻어 직전 표지 RNA 기판을로드 추운 TBE 가득 G 1-1/2 "바늘을 syringe/21. 실행하는 동안 열을 고르게 분배에 지원하기 위해 유리의 뒷면에 알루미늄 판을 놓습니다.
   16. 마커와 별도의 우물의 각 RNA 기판의 전체 25 μL 전사 반응의 부하 3 μL. P에 비슷한 크기의 성적 사이에 잘​​ 남기기못하 교차 오염. 로딩 완충액의 브로 모 페놀 블루, 크실렌 cyanol 염료는 겔상에서 크기 이주를 추정하는데 사용될 수있다.
   17. (600 NT의 프로브 2 시간 동안 예를 들어, 25w) RNA 프로브의 크기에 대한 일정한 와트 적절한에서 젤을 실행합니다.
4. 레이블 RNA 추출 및 정제
   1. 전기 영동 후, 겔 정중 장치의 상부 챔버 드레인. 방사능의 대부분은 겔 및 하부 챔버 내에있을 것; 그러나, 상부 버퍼 일부 방사성 물질을 함유 할 수있다.
   2. 다른 방사성 물질의 작업 영역으로 이동하면 젤을 수송하기 위해 트레이를 사용합니다. 조심스럽게 옆으로 떨어져 젤에서 튀어 나온 부분을 잡아 당겨 스페이서를 제거합니다.
   3. 부드럽게 판을 분리합니다. 겔은 실리콘 처리되지 않은 판에 충실해야합니다. 젤과 유리 접시 위에 랩의 조각을 놓습니다.
   4. 아르를 통해 플라스틱 랩에 glogos 방사능 검사 마커 스티커를 배치모든 샘플의 명확한 젤.
   5. 어두운 방에서, 플레이트 전체에 걸쳐 오토 라디오 필름의 조각을 배치하고, 적어도 1 분 동안 노출. 필름을 개발한다.
   6. 가벼운 표면에 개발 된 필름을 넣습니다. 그런 영화에 얼굴을 아래로 필름에 노출 된 마커에 젤에서 방사능 검사 마커를 정렬 젤의 플라스틱면을 배치합니다. 일단 정렬, 유리에 원하는 밴드의 위치를​​ 표시하는 검은 색 마커를 사용합니다.
      참고 : 또는 RNA 밴드를 잘라하는 다음과 같은 방법으로 젤 / 필름을 맞 춥니 다. 어두운 방에서, 테이블에 래핑 된 젤을 놓고 그 위에 필름을 배치하고 필름의 조각 위에 카세트 테이프 (또는 책 등)을 배치합니다. 만약에 떨어져 잠시 방에있는 전등 스위치에 톡, 다음 전원을 켭니다. 이 '사전 플래시'로 인해 상단에 카세트가 제공하는 빛의 압력 / 보호 필름의 모든 우물의 개요를 생성 필름을 것이다. 이는 락 겔 필름을 정렬하고 절단하게형광 마커를 사용하지 않고 밴드 중.
   7. 조심스럽게 비닐 포장을 제거하고 각 RNA 기판에 신선한 메스 나 면도기를 사용하여 겔에서 밴드를 절제하고 별도의 1.7 ML의 microfuge 튜브에 배치합니다. 용출시 부드러운 선동에 nutator를 사용합니다.
   8. 각 튜브에 RNA의 용출 버퍼 500 μL (0.5 M 암모늄 아세테이트, 10 mM의 _MgCl2를, 1 ㎜ EDTA, 0.2 % SDS)를 추가합니다. 간단히 젤 부분을 물속에 원심 분리기. 프로브의 크기에 따라 3-16 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 품어.
   9. 새로운 튜브에 용출 된 물질의 전체 500 μl를 전송합니다. 그들은 정화를 방해 어떠한 젤 조각을 전송하지 마십시오. (RNA에 대한) 감기, 산성 페놀 - 클로로포름 500 μL와 함께 글리코겐 1 μL (20 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
   10. 간단히 소용돌이 솔루션은 흐린 나타납니다. 5-6 분 동안 최고 속도 (~ 16,000 XG)에서 상온에서 스핀.
   11. 조심스럽게 트랜스FER 상부 (수성)를 간기로부터 이물질을 회피하면서 최대한수록 새로운 튜브로 층을 포함한다. 전송 된 수층에 클로로포름의 동일한 금액을 추가합니다. 단계를 반복 3.4.10와 정상을 전송 (수성) 새로운 튜브에 층. 수집 된 자료에 얼음처럼 차가운 95~100%의 EtOH 1 ML을 추가합니다. . 10 분 주를 위해 -80 ° C에서 알을 품다 : 원하는 경우 RNA 하룻밤 저장 될 수있다.
   12. 4 ℃에서 16,000 XG에 30 분의 RNA 펠렛 조심스럽게 방사성 폐기물 용기에 상층 액을 부어 각각의 펠릿에 얼음처럼 차가운 70 % 분자 수준의 EtOH 1 ㎖를 추가합니다.
   13. , 상층 액을 부어 1 분 동안 다시 회전과 피펫을 통해 잔류을 EtOH를 제거하고 나머지의 EtOH 증발 할 수 있도록 개방 된 모자와 실내 온도에두고, 4 ° C에서 15 분 동안 16,000 XG에서 RNA 펠렛.
   14. RNase가없는 물 20 ~ 30 μL에 펠렛을 Resuspend. 레이블이 RNA는 -80 ° C.에 저장 될 수있다
       참고 : 방사성 서베이 미터가 표시 RNA가 어떤 단계에서 손실되지 않았는지 확인하기 위해 전체 추출 과정에서 사용되어야한다.
5. 사전 mRNA의 3 '의 mRNA 분열 반응에 레이블이 RNA의 정량
   1. 다음 절차를 이용하여 절단 기판의 몰 농도를 대략.
      1. 예를 들어, 3000 실라 / 밀리몰 ^[α-32 P] UTP 10 mCi의 / ㎖의 1 μL를 가져 가라. 레이블 (라벨 참조 날짜,이 원액의 화학 물질의 농도는 그 이전에 그것이 ~ 1.6 밀리미터 등입니다 날짜 이후 높은 하나의 반감기 (~ 십삼일)입니다. 3.3 μM의 UTP 될 것입니다) 최종 반응 농도 UTP 투고는 UTP K _m의 상기 최종 냉간 UTP 농도가 사용될 때 일반적으로 무시할 수있다. UTP에 대한 T7 RNAP K _(M)는 114 밀리미터 ^15.
      2. 물 39 μL에 1 μl를 희석. 그런 다음 희석 [1 μL α을 추가 ^{32 P] 신틸레이션 바이알 신틸레이션 유체의 적절한 양에 UTP. (참고 :. Cerenkov 계산도 신뢰할 수있는 CPM 값을 제공 할 것으로 Cerenkov 계산에 대한 정확한 채널을 선택하고 1 분간 1 ㎖의 부피를 계산하는 섬광 계수기의 설명서를 확인 섬광 액체가 실제로 32 P의이 특정 활동에 필요하지 않습니다).}
   2. 이전 단계에서 사용되는 섬광 유체의 동일한 금액과 별도의 유리 병에 레이블이있는 각 RNA 기판의 1 μl를 희석. 배경을 계산하기 만 섬광 액체와 유리 병을 가지고 있는지 확인합니다. 섬광 계수기의 방사능을 정량.
   3. 초기 희석 요인 혼자 섬광 유체에 의해 획득 된 배경을 뺍니다 (40)에 의해 ^[α-32 P] UTP의 샘플 분 (CPM) 당 수를 곱합니다. RNase가없는 물의 양 (20 ~ 30 μL)에 의해 각각의 RNA 프로브의 수를 곱는 RN을 재현 탁하는 데 사용프로브. 이 정제 된 RNA의 총 노출 당 비용 (CPM)을 제공합니다.
      예 :. 최대 노출 당 비용 (CPM) = (노출 당 비용 (CPM) ^[α-32 P] UTP - 배경) 40 x 다음 레이블 RNA 샘플 1 = 20,000 노출 당 비용 (CPM) × 20 = 400,000 CPM (20 μL가 재 부상에 사용하는 경우)
   4. ^[α-32 P] UTP의 1 μL 이외의 양의 성적 증명서를 확인하는 데 사용 된 경우, ^[α-32 P]에 대한 노출 당 비용 (CPM)를 곱하여 ^[α-32 P] UTP의 최종 노출 당 비용 (CPM)에이 볼륨을 인수 분해 사용되는 양만큼 UTP 샘플.
      예 : ^[α-32 P] UTP 2 μL은 성적 증명서를 만드는 데 사용됩니다. 1 μL ^[α-32 P] UTP에 대한 계산 된 노출 당 비용 (CPM)는 50 만 노출 당 비용 (CPM)입니다. 곱하기 50 * 2 = 1,000,000 CPM
   5. 혼자 ^[α-32 P] UTP에 대한 계산 된 노출 당 비용 (CPM)에 의해 계산 된 라벨 RNA의 노출 당 비용 (CPM)을 나눈다. 이것은 대략 포함 레이블 UTP의 비율을 계산합니다.
      예 : 400,000 / 1,000,000 = 0.40 40 %통합
   6. 효소가 동위 원소를 구별 할 수 있기 때문에, 표지 및 표지되지 않은 UTP의 동일한 비율은 전사시 RNA로 통합된다. 전사 반응 (UTP의 5.0 × ^10-9 몰의 10 mM의 용액 0.5 μL =)에 추가 몰에서 추운 UTP의 양을 계산합니다.
   7. (위의 계산 뜨거운 UTP 공지) 통합 %의 반응 몰의 UTP를 곱 후 RNA 서열 uridines의 숫자로 그 나눕니다.
      예 : UTP의 5.0 × ^10-9 몰 X 0.40 = 2 × ^10-9 몰의 UTP
      2 × ^10-9 몰의 UTP / 73 U 성적표 당 = RNA 2.7 × 10 ^-11 몰
   8. RNA 회수의 재 부유 용액의 부피로 나누어 몰 농도로 RNA의 몰 변환.
      예 : RNA / 20 μL = 1,370 nm의 RNA 2.7 × 10 ^-11 몰. 약 1 μg 선형 만든 T7 RNAP의 성적 증명서플라스미드를 개인별 20 μL 물에 재현 탁, 200 ~ 1,400 ㎚의 값은 일반적인.
      NOTE : RNA의 몰 농도는 시험 관내 분해 반응에서 최종 전 mRNA의 기질 농도가 분열 반응 당 5nm 미만인지 확인하기 위해 사용된다. RNA 농도는 크게 5 nM의 위에 제기 된 경우 절단 효율을 감소시킬 수있다.

4. 3 '의 mRNA 분열 반응

1. 분열 반응 시약 준비
   1. 분해 반응에 필요한 모든 시약을 준비한다. 끓는 물에 의해 10 % 폴리 비닐 알코올 (PVA)을 확인하고 천천히 PVA 분말의 정확한 양을 추가한다. 10 %의 PVA는 점성하고 용해 시간이 소요됩니다. 실내 온도 또​​는 -20 ° C.에 저장
   2. -80 ℃에서 1 M 크레아틴 인산 (CP) 및 저장을 준비 그것은보다 4 개월은 1 M의 CP를 사용하는 것이 중요합니다.
   3. 1 M DTT 및 저장 준비-20 ° C에서 직전에 분열 반응을하고 1 M DTT에서 신선한 0.2 M DTT 희석합니다.
   4. ETS (절단 스톱 솔루션) 준비 : 10 MM 트리스 산도 7.8, 10 mM의 EDTA, 0.5 % SDS. 상온에서 보관.
2. 분열 반응
   1. 2 분 동안 80 ° C로 표지 된 RNA를 가열 한 후 얼음에 배치합니다.
   2. 부드럽게 와동하고 거품을 제거하기 위해 2 ~ 3 분 동안 최고 속도로 10 %의 PVA를 회전.
   3. 마스터 믹스 1 : 하나의 반응은, 3.125 ㎕의 10 % PVA, 0.625 ㎕의 1 M의 CP, 0.25 ㎕의 0.5 M의 tRNA, 0.125 ㎕의 100 ㎜으로 dATP, 0.13 ㎕를 40 U / μL의 RNase 억제제, 0.25 ㎕의 0.1 M EDTA pH를 8을 결합 0.1 ㎕의 0.2 M DTT, 및 0.645 μL RNase가없는 물. 얼음에 튜브 당 5,775 μL 마스터 믹스 1을 분배.
   4. 마스터 믹스 2 : 2 ㎎ / ㎖ 이상 농도에서 핵 추출물의 6.25 μL / 반응. 핵 추출물 버퍼 D _(50)로 희석 될 수있는 경우 니DED.
   5. 이전에 마스터 믹스 1 5.25 μl를 분배와 핵 추출물의 6.25 μl를 결합합니다. 50 nm의 희석 표시 RNA 기판의 1 μl를 추가합니다. . 사용 표시 RNA 기판의 <5 nm의 : 또는 RNA는 1이 RNA 분해 효소 억제제, DTT와 tRNA가 주 후에 추가됩니다 제공하는 마스터 믹스에 포함될 수있다.
   6. 부드럽게 거품을 제거하기 위해 각 샘플 와동 빠른 스핀. 최대 2 시간 동안 30 ° C에서 알을 품다,하지만 시간이 코스는 최적의 결과를 수행해야합니다. 이상 배양 배경 저하를 증가 할 수 있습니다.
3. 테 K 소화 정화
   1. 열에서 샘플을 제거하고 각 반응에 ETS의 스톱 솔루션의 182.5 μl를 추가합니다. 20 ㎎ / ㎖ 프로 테 K의 5 μl를 추가하고 10 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품어.
   2. 3 M 나트륨 1 산 페놀 - 클로로포름의 양 (200 μL), 1 / 10 ^{일 볼륨} (20 μL)을 추가하여 RNA를 추출아세테이트, 20 ㎎ / ㎖ 글리코겐 1 μL. 섹션 3.4.9-3.4.14에 설명 된대로 추출을 진행합니다.
   3. RNA 추출이 완료되면, 모든 잔여 EtOH를 제거해야합니다. (브로 모 페놀 블루 (BFB) (및 자일 렌 Cyanol 블루)와 90 %의 포름 아미드, 10 mM의 EDTA)로드 버퍼의 8 μL에 펠렛을 Resuspend. 샘플은 -80 ° C에서 저장 또는 겔 전기 영동을 진행 할 수있다.
4. 분열 반응 전기 영동
   1. 앞서 몇 가지 수정을 섹션 3.3.1-3.3.17에 명시된 6 % 아크릴 아마이드 젤을 준비합니다. 각각의 긴 측면에 2 바인더 클립으로 20cm X 42cm 시퀀싱 겔 플레이트를 사용합니다. 32 잘 빗을 사용하고 젤 믹스 40 ㎖를 준비합니다.
   2. 마커의 3 μL 각 샘플의 5 μL와 젤을로드합니다. 사전 절단하고 절단 된 제품 및 사이즈에 따른 전기 영동 설정을 최적화.
   3. 전기 영동이 완료되면, 부분 3.4.1-3.4.3를 수행 <젤을 분해> / 강한. 대신에 플라스틱 포장으로, 겔 판의 크기에 필터 종이를 잘라 조심스럽게 노출 된 젤의 한쪽면에 놓습니다.
   4. 여과지는 바닥에 있고, 유리가 위에 오도록 단단히 겔 상에 여과지를 누른 다음 접시 위에 플립. 단단히 젤이 균등하게 여과지를 파지되어 있는지 확인하기 위해 테이블​​에 유리를 누르십시오.
   5. 천천히 부착 젤 여과지 전부는 유리판으로부터 제거 될 때까지 짧은 단부 중 하나에서, 그것에 연결 겔 있어야 여과지를 벗긴다.
   6. 플라스틱 포장으로 노출 된 겔 측면을 커버. 필터 종이에 플라스틱 랩을 테이프.
   7. 진공 측에 대향 필터면 겔 건조기에 겔을 배치. 15 분이나 젤까지 건조가 완전히 건조합니다.
      NOTE : 겔 건조기를 사용할 수없는 경우, X-선 필름은 RNA 밴드를 시각화하는데 이용 될 수있다. 노출 된 ligh에서 수행되어야한다-80 ° C에서 강하게 화면을 가진 t-꽉 카세트 노출 시간은 경험적으로 결정된다. 주의 : 낮은 %의 아크릴 아마이드 겔은 동결에 균열 수 있습니다.
   8. 겔 이제 필름을 노출 또는 포스 포-이미 저와 함께 사용될 수 사용될 수있다. 노출 시간이 표시 RNA의 강도에 따라 달라집니다. 처음에 24 시간 노출이 사용될 수있다. 필름을 사용하는 경우, 강화 화면 -80 ° C에 노출 전에 개발에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다.
   9. 절단 효율성을 정량화하기 위해 각 샘플에 쪼개진 및 취소 절단 된 RNA의 비율을 측정합니다.

결과

RNA 폴리 (A) HIV-1의 사이트 (그림 2)의 분해 분석의 대표 결과. 우리는 젤의 상단에 가장 느린 이주 밴드 uncleaved RNA 기판을 관찰 할 수 있습니다. 구체적인 절단 된 제품은 빠른 예상 크기의 겔에서 실행 가장 강렬한 짧은 단편 밴드이며, 폴리 A 서열 (mutPolyA) RNA의 점 돌연변이를 포함 mutpoly (A) 제어의 분열 분석에서 특히 결석 기판. 입력 기판의 분해 생성물이 때때로 관찰된다. 분열 활성?...

토론

헬라 세포 핵 추출물 또는이 추출물로부터 분획 분열의 요인으로 수행 체외 사전 mRNA의 3 '분열 반응은, 핵심 분열 요인과 그들의 주요 단지 ^16-21의 식별을 가능하게했다. 이러한 요인과 관련된 더 많은 단백질은 최근 ²² 확인 된, 그리고 생체 반응은이 단백질이 반응에 기여하는 방법에 있나을 계속할 수있다. 생체 내에서의 반응은 ²³ cotranscriptional 것...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Celstir flask	Wheaton	356884	Different sizes available
4 position slow speed stirrer	VWR	12621-076
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter		Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R	Eppendorf		Refridgerated
Thermomixer incubator	Eppendorf
250 ml conical tubes	Corning	430776
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
Ultraclear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modified MEM	Lonza	04-719Q
Fetal bovine serum	Atlas	F-0500-A	Heat inactivated
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Potassium chloride	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycerol	Fisher	BP229-4
5 M sodium chloride solution	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M solution	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ammonium sulfate	Fisher	A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel loading buffer II	Ambion	8546G
DEPC treated water	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x TBE	Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Ammonium acetate	Fisher	A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogen	Roche	10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof	Acros	61509-0040
Acid phenol:chloroform	Ambion	9720	For RNA
Scintilation fluid	Fisher	SX18-4
Rnase inhibitor	Promega	N261B
Polyvinyl alcohol- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Creatine phosphate	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Adjustable sequencing unit	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Binder clips	Office Depot	838-056
20 cm x 42 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
20 cm x 22 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
8-well comb	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
16-well comb	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32-well comb	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Gel repel coating	C.B.S. Scientific	SGR-0401	or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips	Rainin	GT-10-4	0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer	Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Autoradiography cassette	Fisher	FBCA 1417	8 x 10 size available