Análise das reacções de processamento de RNA utilizando células Sistemas gratuitas: 3 &#39;Fim de clivagem de pré-mRNA Substratos<em&gt; In vitro</em

Resumo

RNA polimerase II sintetiza um RNA precursor que se estende para além da extremidade 3 'do ARNm maduro. A fim de o RNA maduro é gerado cotranscriptionally, num local ditada por sequências de RNA, através da actividade de endonuclease do complexo de clivagem. Aqui, detalhamos o método para estudar as reações de clivagem in vitro.

Resumo

A extremidade 3 'do ARNm de mamíferos não é formada por terminação abrupta de transcrição por ARN-polimerase II (RNPII). Em vez disso, RNPII sintetiza mRNA precursor além do final de RNAs maduros, e um processo ativo de atividade endonuclease é necessário em um site específico. A clivagem do RNA precursor ocorre normalmente de 10-30 nt a jusante do local de poliA de consenso (AAUAAA) após os dinucleótidos CA. As proteínas do complexo de clivagem, um complexo de proteínas multifatorial de aproximadamente 800 kDa, realizar essa atividade nuclease específica. Sequências de RNA específicas a montante e a jusante do local de poliA controlar o recrutamento do complexo de clivagem. Imediatamente após a clivagem, os pré-mRNAs são polyadenylated pela polimerase poli (PAP) para produzir amadurecer mensagens RNA estáveis.

Processamento da extremidade 3 'de um transcrito de ARN pode ser estudado utilizando extractos nucleares celulares com substratos de ARN específicos radiomarcados. Em suma, um longo ^{32 <}/ Sup> clivada RNA precursor marcado com P é incubado com extractos nucleares in vitro, e a clivagem é avaliada por electroforese em gel e autorradiografia. Quando ocorre a clivagem adequada, um curto 5 'clivada do produto é detectado e quantificado. Aqui, nós descrevemos o ensaio de clivagem em pormenor utilizando, como um exemplo, o processamento da extremidade 3 'de HIV-1 ARNm.

Introdução

A biossíntese da maioria dos RNAs mensagem eucarióticas maduros (mRNAs) requer várias modificações pós-transcricional, como nivelamento, splicing e poliadenilação. Estas modificações são geralmente acoplado a assegurar o correcto processamento ¹ e aumentam fortemente a estabilidade do mRNA.

A 3 'a formação final de mamífero pré-ARNm é gerada por clivagem endonucleolítica de ARN nascente, seguido pela adição de resíduos de adenilato a 5' clivada do produto por poli (A) polimerase (PAP) ^2-4. Nos mamíferos, a clivagem é realizada por um complexo de proteína de multicomponentes, de aproximadamente 800 kDa, que monta em sequências pré-ARN específicas. O poli (A) sequência de sinal, uma sequência AAUAAA hexanucleotide canónica altamente conservada, dirige o local de clivagem de cerca de 10-30 nt a jusante. Este local é especificamente reconhecido pelo factor de clivagem e poliadenilação especificidade (CPSF) e a 73 kDa subunidadeCSPF contém a actividade de endonuclease. O fator de estimulação clivagem (CstF) liga-se a mais degenerada GU-ou U-ricos seqüência elemento a jusante da poli (A) site. Também é necessária para a clivagem é o factor de clivagem de mamífero I (MCIF), e o factor de clivagem de mamífero II (CFII). MCIF liga os sítios específicos UGUA (N) em elementos de seqüência a montante (usa) que foram definidos por uma série de genes e parecem estar envolvidos em processos fisiológicos importantes ^5-8.

In vitro, as reacções de processamento de RNA são geralmente analisada pela utilização de substratos de RNA radiomarcados ^9-12. Estes podem ser sintetizados por meio de escoamento de transcrição a partir do promotor de T7 de bacteriófago ou SP6. Quando se estuda um local de poliadenilação que não foi caracterizado antes, é necessário utilizar o ADN genómico, em vez de ADNc para gerar o substrato de RNA, como sequências a jusante importantes podem não estar presentes em cDNA. Substratos projeto para incluir, pelo menos, 150 nt upstream e 50 nt a jusante do sítio de clivagem / final no mRNA maduro. O produto de clivagem migra mais rapidamente do que o substrato; no entanto, porque os outros fragmentos podem ser gerados por acção de nucleases não específica, a especificidade da reacção tem de ser verificado pela sua dependência em relação as sequências de sinal de processamento de correcção. Consequentemente, os substratos de RNA, com um ponto de mutação na sequência AAUAAA (por exemplo AAGAAA) servir como um controlo negativo para a reacção de clivagem.

Dado que uma pequena quantidade de ARN marcado radioactivamente é usado para as reacções de clivagem, RNases presentes em abundância elevada na maior parte dos extractos nucleares pode ser problemático, e limitar a escolha do material de partida para a preparação do extracto. Células HeLa tendem a conter níveis baixos de RNases endógenos e, portanto, um bom desempenho nestes ensaios.

A clivagem endonucleolítica dos substratos de RNA in vivo e in vitro, é imediatamente seguido por poli (A) adição, quis a intermediário clivada não está presente em quantidades detectáveis. Assim, para estudar ou uma sequência ou as proteínas envolvidas na reacção de clivagem do RNA específico, as experiências são feitas em condições que impedem a ocorrência de poliadenilação. Não há dependência de clivagem em poliadenilação, ou vice-versa, de modo que se pode parar de poliadenilação, sem prejudicar a reacção de clivagem. Deste modo, o ATP é substituído por um análogo da cadeia de terminação que carece de um grupo hidroxilo a 3 ', de modo que apenas um único nucleótido podem ser incorporados no local de poli (A) e apenas ARN clivado pode ser detectado.

Dada a complexidade e elevado grau de particularidade deste tipo de ensaio, os autores descrevem um protocolo detalhado de vídeo para estudar a clivagem endonucleolítica através da maquinaria de clivagem / poli (A) de precursores de mRNA in vitro. Nós descrevemos como preparar extratos nucleares competentes, gerar substratos RNA radioativos, realizar a reacção de corte, bem como analisar e interpretar o resultadoprodutos ing. Figura 1 mostra um exemplo de ARN que codificam para a extremidade do substrato de HIV-1 pre-ARNm da 3 'a ser utilizada para um ensaio de clivagem. A extremidade 3 'do genoma de RNA do HIV é composto por muitas sequências reguladoras importantes, tais como o local poli (A), uma região rica em G+ L, e o elemento de utilização, que são necessárias para a maturação eficiente dos transcritos de ARNm virais ¹³ . Neste exemplo, seria de esperar que o substrato RNA a ser 338 nt e após clivagem 237 nt. Se poliadenilação foi autorizada a ocorrer, uma mancha de produtos seria observado entre 237 e 437 nt.

Protocolo

1. Adaptação de células aderentes em suspensão

(Este passo é opcional. Células em suspensão, geralmente fazer melhores extractos nucleares, no entanto as células cultivadas em placas também pode ser usado.)

1. Adaptar células aderentes para crescimento em suspensão usando MEM modificado de Joklik suplementado com 5-10% de soro de bezerro recém-nascido ou de soro fetal bovino e 1% de L-glutamina: penicilina-estreptomicina. Propagar células em frascos rotativos com uma tampa de filtro a 37 ° C com 8% de CO _2.
2. Ao adaptar células, começa com 100 ml em um balão de 500 ml de fieira. Manter um mínimo de 0,3 x 10 ⁶ células / ml, e substituir o meio cada 1-2 dias, até que a taxa de crescimento adequado é conseguido (tipicamente 2-6 semanas). Uma vez adaptado, as células HeLa em suspensão deve dobrar aproximadamente a cada 24 horas NOTA:. Durante a fase de adaptação, vai demorar algum tempo para que as células para retornar à sua taxa de duplicação normal.
3. Manter as células em um densidade de 0,5-0,8 x 10 ⁶ células / ml no volume final desejado (tipicamente 1-10 L)
4. As células são tipicamente colhidas na fase logarítmica média (cerca de 0,5-0,65 x 10 ⁶ células / ml e> 90% viáveis). Utilizar o frasco de rotação de tamanho adequado para a quantidade desejada de meios de cultura.

2. Extractos Nucleares

1. Tampão e Preparação do reagente
   NOTA: As extrações são realizadas conforme uma modificação Dignam et al (1983) ¹⁴ procedimento extrato nuclear..
   1. Prepare 1X tampão fosfato salino, tampão A, o tampão C, e tampão D (Tabela 1) no dia antes de prosseguir com extracções e armazenar a 4 ° C.
      NOTA: os rendimentos mais elevados são geralmente conseguida com tampão preparado na hora; no entanto, o tampão é estável durante várias semanas. É importante que todos os buffers, aparelhos e equipamentos são pré-arrefecidos e mantidos no frio para a totalidade das extracções.Use uma sala fria para tantas medidas possíveis e / ou manter tudo no gelo. Adicionar DTT e PMSF imediatamente antes da utilização.
2. Coleta e lavagem Células
   1. Despeje células em quatro frascos cónicos de 250 ml e de rotação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C numa centrífuga com uma oscilação ou um rotor de ângulo fixo. Sobrenadantes decantar e adicionar mais 250 ml de meio de cultura de células para cada garrafa. Repita gira até que todas as células foram sedimentadas.
   2. Ressuspender pelotas finais combinadas em um total de 250 ml de PBS gelado e piscina para um frasco cónico de 250 ml. Rodar as células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de balde oscilante.
   3. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em PBS gelado assim que o volume total não exceda 50 ml. Solte o pellet via pipeta e transferir para um tubo de centrífuga de 50 ml cônico.
   4. Rodar as células novamente em 500 xg durante 6 minutos a 4 ° C numa centrífuga de balde oscilante. Deitar fora supernatant e estimativa e anotar o volume agregado de células (CPV) com a maior precisão possível. Use água em um tubo de harmonização separado, para comparação, se o pellet é menor do que as marcações de volume no tubo.
3. A lise celular
   1. Adicionar DTT para tampão A. Ressuspender o sedimento em tampão A com 5 volumes do CPV estimada. Pipeta de romper a pelota e incubar em gelo durante 10 min.
   2. Rodar as células a 931 xg durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de balde oscilante.
   3. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante em vez de decantação. O volume de sedimento deveria ter aumentado aproximadamente duas vezes no tamanho devido ao aumento de volume das células.
   4. Adicionar 1 CPV do tampão A para as células. Suavemente romper a pelota e remover uma pequena aliquota (cerca de 50 mL) para um tubo de microcentrifugadora em gelo. Transferir as células ressuspensas para uma dimensão apropriada homogeneizador Dounce (geralmente 15 ml de tamanho) arrefecido em gelo.
   5. Lisar as células com 12-15 golpes lentos, mas constantes de um tipo B (TIGht) pilão. Retirar uma pequena alíquota do lisado e examinar ao microscópio para lise completa (intactos pequenos núcleos escuro em comparação com células inchadas) por coloração com azul de tripano. As células intactas ficará claro). Continuar homogeneização até 90% de lise é alcançado e parar por aqui, ao longo douncing pode impactar negativamente a qualidade de extratos nucleares.
   6. Transferir lisado em UltraClear tubos ultracentrífuga e anotar o volume total. Saldo pesando os tubos e rotação em 1069 xg por 10 min a 4 ° C.
      NOTA: A ultracentrífuga é usado neste passo, apesar da baixa velocidade de rotação, pois a mesma tubo vai ser girado a uma velocidade mais elevada no passo seguinte. Esta rotação irá produzir uma pelota bastante apertado que cobre a parte inferior do tubo com sobrenadante nublado acima, o que pode ser recolhida e utilizada por extratos S100 citosólicas. Se existe uma camada de lípido visível na parte superior do tubo, que pode ser removido.
   7. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e transferi-lo para anoth.. tubo er Evite perturbar o sedimento nuclear NOTA: Será importante conhecer o volume final do sobrenadante, a fim de determinar o volume nuclear embalado (PNV).
4. Preparação do Extracto nuclear
   1. Uma vez que o sobrenadante foi cuidadosamente retirado, o produto bruto respin sedimento extracto nuclear de 25.453 xg durante 15 min a 4 ° C, no mesmo tubo.
   2. Remover o sobrenadante restante (que deve ser uma pequena quantidade de líquido claro) e adicioná-lo à coleção sobrenadante anterior. Medir o volume final do sobrenadante. Calcular a PNV subtraindo este volume do volume total de lisado inicial previamente notado. Alternativamente, se o sedimento é suficientemente grande, o seu volume pode ser estimado por comparação com um volume similar de água em um tubo idêntico.
   3. Adicionar 1 volume de PNV de tampão C (cerca de 1 ml / ml de células). Desalojar cuidadosamente o pellet com uma ponta de pipeta e transferir para uma adequada sized Dounce homogeneizador. Se, utilizando o mesmo homogeneizador como antes, prerinse o homogeneizador com água desionizada estéril.
   4. Ressuspender o sedimento com ~ 5-10 pancadas por meio de um homogeneizador de Dounce usando um pilão apertado.
   5. Transferir o lisado nuclear homogeneizado para um tubo refrigerado e misturar por inversão durante 30 min a 4 ° C. Se o volume for grande o suficiente, agitar usando uma placa de agitação magnética e bar rodada.
   6. Transferir o lisado para um novo tubo de centrífuga ultraclear e giram a 25.453 xg durante 30 min a 4 ° C. O sedimento deve ser compacto. Cerca de 5 minutos antes da centrifugação é completa, hidratar as cassetes de diálise ou tubo que têm um peso molecular apropriado corte (MWCO) (por exemplo, 7000 kDa).
   7. Retirar o sobrenadante (extracto nuclear) a partir do tubo dentro de um tubo cónico refrigerados usando uma pipeta de transferência, em seguida, proceder à diálise.
5. Diálise
   1. Injetar os extratos em cassetes de diálise hidratados como por fabricantes instruções e dializar os extractos nucleares em 500 ml de tampão D _{de 50} para 1 hora a 4 ° C com agitação.
   2. Substituir o tampão com 500 ml fresco, arrefecido com gelo tampão D ₅₀ e diálise durante 4 horas adicionais a 4 ° C. Esta etapa 4 horas pode ser dividido em duas mudanças 2 hr vez.
   3. Retire os extratos da cassete de diálise e transferir para tubos refrigerados. Girar os extractos de 5 min a 1500 xg, a 4 ° C.
   4. Alíquota dos extractos no refrigerados, tubos Eppendorf e encaixe congelamento em nitrogênio líquido (50-100 mL por alíquota). Armazenar a -80 ° C para uso futuro.

3. ARN Probe Synthesis

1. Preparação Template
   NOTA: Modelos usados ​​para a transcrição podem ser fragmentos de PCR ou plasmídeos que contenham um T7 ou SP6 promotor a montante e imediatamente adjacente à sequência da sonda desejada. Modelos de plasmídeo deve ser linearizado a jusante da sequência modelo de interest. Notamos maior rendimento a partir de modelos de PCR.
   1. O promotor T7/SP6 pode ser inserido durante a reacção de PCR. Conceber o iniciador de sentido directo com a T7/SP6 promotor a montante da sequência alvo.
   2. Amplificar a seqüência desejada em 2-3 reações por modelo via PCR por instruções do fabricante usando uma polimerase de alta fidelidade.
   3. Combinar reacções equivalentes e purificar por extracção de gel.
   4. Sequência de produtos de PCR para verificar a precisão do modelo. (Opcional)
2. RNA Transcrição com ³² P Labeling
   1. Realiza-se em transcrição in vitro a partir de 1 ug de molde com um kit disponível comercialmente que seja compatível com o promotor (T7 ou SP6), com as seguintes modificações. Usar um ul de fresco 3000 Ci / mmol ^[α-32 P] UTP, 0,5 ul de 10 mM de UTP, 0,1 frio ul de 10 mM de GTP, e 0,9 mL de 10 mM de m7G (5 ') ppp (5') G ARN cap em um volume final total de 20 mL.
      NOTA: O G-cap melhora a estabilidade dos transcritos de RNA em extratos nucleares (cap: GTP) proporção de 10:1. A UTP frio é adicionado para evitar o ³² P-UTP a partir sendo o reagente limitante.
   2. Sintetizar uma escada de RNA de tamanho, como é indicado acima, sem a tampa de L. Modelos comerciais estão disponíveis para a geração do marcador de tamanho de ARN.
   3. Incubar as reacções de transcrição a 37 ° C durante 1 h (para utilização SP6 40 ° C). Uma vez concluída, realizar a digestão de DNase do molde durante 15 minutos a 37 ° C.
   4. Após a digestão, adicionar 1 ul de EDTA 0,5 M e 5 ul de tampão de carga II para os substratos de RNA. Adicionar 20 ul de tampão de carga II do marcador.
   5. Aquecer o marcador de ARN e as sondas de 95 ° C durante 3 min, em seguida, colocar em gelo.
3. Gel de poliacrilamida Fundição / Probe Eletroforese
   1. Prepare 1 litro de gel de poliacrilamida a 6% (PAGE) e 400 ml de mistura de 10% PAGE. Para tornar a 6%, mistura de 150 ml de 40% 19:01 acrilamida: bis-acrylamide com 100 ml de 10X Tris / borato / EDTA (TBE) e 460 g de ureia. Traga até 800 ml com água deionizada estéril e misture numa placa de aquecimento, enquanto a aplicação de calor baixo (em torno de 50-80 ° C). Completar para 1 L com água deionizada.
      NOTA: A reação é endotérmica. Aquecimento promove a solubilização da ureia. Remover do calor, logo que a ureia é dissolvido e levar a solução a 1 litro com água desionizada. Alternativamente, agita-se à temperatura ambiente durante a noite; muito calor pode iniciar a polimerização.
   2. Proteja o mix PAGE da luz com papel alumínio e armazenar à temperatura ambiente. As misturas página pode ser preparado com antecedência e são estáveis ​​por vários meses.
   3. Preparar 400 ml de 10% de mistura de PAGE combinando 100 ml de 40% de acrilamida: 19:01 bis-acrilamida, 40 ml de 10x TBE e 184 g de ureia. Depois de dissolver o uréia, trazer até 400 ml com água deionizada.
      Em alternativa, preparar uma solução 19:01 de acrilamida 20% e uma solução de acrilamida 0% with apenas tampão e ureia; estes podem então ser misturados em qualquer proporção de dar qualquer percentagem entre 0 e 20%; uréia é sempre lento dissolver.
   4. Preparar 10-50 ml de solução a 10% de persulfato de amónio (APS), em água desionizada estéril de acordo com o número de géis para ser expressos.
   5. Lavar 20 cm x 22 cm de gel de placas de vidro com 70% de etanol (EtOH). Seque com grandes panos sem fiapos.
   6. Lavar a placa de regular com 1 ml de hidróxido de sódio 5 N (NaOH) e em seguida, lavar novamente com 70% de EtOH. Revestir a placa dentada com uma solução de gel de repelir siliconização limpando a placa com uma pequena Kimwipe saturado.
   7. Monte os pratos, colocando a placa regular sobre uma caixa de ponteira vazio ou um pedaço de isopor para elevá-lo da mesa com o lado limpo para cima. Colocar 0,4 milímetros espaçadores na extremidade de cada lado mais longo.
   8. Coloque cuidadosamente a placa dentada ao longo dos espaçadores de modo que o lado revestido será no interior do gel. Use uma lâmina de barbear ou outro instrumento fino para mudaros espaçadores para um alinhamento nivelado no fundo e os lados das placas de gel, em seguida, prenda com grampos da pasta de cada lado das placas de gel ao longo dos espaçadores.
   9. Preparar 30 ml de 8% de mistura de PAGE por gel por mistura de 15 ml de 10% e de 6% a cada mistura num tubo de 50 ml. Rapidamente adicionar 300 ul de APS 10% seguido por 30 mL de N, N, N ', N'-tetra-metiletilenodiamina (TEMED) à mistura de gel de 8%.
      NOTA: percentagens de gel apropriadas para tamanhos de sondas individuais devem ser selecionados pelo experimentador.
   10. Cap e 2x invertido e despeje a solução para a área dentada das placas de gel. Certifique-se de elevar um pouco as placas com a mão e manter um mesmo derramar até que a mistura PAGE começa a escorrer para fora do fundo.
   11. Abaixe as placas de volta ao nível e insira imediatamente o grande 8 poços pente retângulo de 0,4 milímetros x 20 cm gel. Pequenas bolhas perto da parte inferior não vai afetar o funcionamento, mas não deve haver bolhas nos poços.
       NOTA: </ Strong> Coloque toalhas de papel sobre a mesa abaixo da parte inferior e superior do gel para captar quaisquer derrames durante o vazamento.
   12. Permitir que a mistura PAGE a polimerizar durante pelo menos 30 min.
   13. Transferir o gel polimerizado para a sala fria e montar o aparelho de eletroforese. Adicionar tampão TBE frio para as linhas de enchimento sobre as câmaras superiores e inferiores.
   14. Retire o pente e usar uma navalha para remover qualquer resíduo. Definir o gel no aparelho e usar um clipe de ligante para manter a placa para a vedação. Adicionar TBE frio para a câmara superior até que flui para as placas.
   15. Lavar os poços com 30 ml syringe/21 agulha G 1-1/2 "cheio com TBE frio imediatamente antes de carregar os substratos de RNA marcadas. Colocar uma placa de alumínio na parte de trás do vidro para ajudar na distribuição uniforme do calor durante a execução.
   16. Carga 3 ul do marcador e toda a reacção de transcrição de 25 ul de cada substrato de RNA em poços separados. Deixar um bem entre transcrições de tamanho similar ao pcontaminação cruzada revent. Azul de bromofenol e xileno cianol corantes em tampão de carga pode ser utilizado para estimar o tamanho da migração no gel.
   17. Executar o gel a uma potência constante adequado para o tamanho das sondas de ARN (por exemplo, 25 watts durante 2 horas para sondas de 600 nt).
4. Rotulado RNA extração e purificação
   1. Após a electroforese, drenar cuidadosamente a câmara de cima do aparelho de gel. A maior parte da radioactividade será no gel e a câmara de fundo; no entanto, o tampão superior podem conter algum material radioactivo.
   2. Use uma bandeja para transportar o gel se mudar para outra área de trabalho material radioativo. Cuidadosamente remover os espaçadores puxando a peça saliente lateralmente para longe a partir do gel.
   3. Suavemente separar as placas. O gel deve ficar com o prato que não foi siliconizada. Coloque um pedaço de filme plástico sobre a placa de gel e vidro.
   4. Coloque um glogos AUTORAD marcador adesivo na película de plástico sobre um sãoum do gel que está livre de quaisquer amostras.
   5. Em um quarto escuro, colocar um pedaço de película auto-radiografia ao longo de toda a placa e expor, pelo menos, 1 min. Desenvolver o filme.
   6. Coloque o filme desenvolvido em uma superfície de luz. Em seguida, coloca o lado de plástico do gel, a face para baixo sobre a película e alinhar o marcador AUTORAD do gel para o marcador exposta em filme. Uma vez alinhados, usar um marcador preto para marcar a localização das bandas desejadas sobre o vidro.
      NOTA: Como alternativa, alinhar géis / filme da seguinte maneira para cortar bandas de RNA. No quarto escuro, colocar o gel envolta em uma tabela, colocar o filme no topo do mesmo e colocar uma cassete (ou livro, etc) na parte superior da peça de película. Flick o interruptor de luz no quarto brevemente, em seguida, vire se desligado. Isto vai 'pré-flash "do filme gerando uma descrição de todas as cavidades do filme devido à pressão / de protecção da luz que a cassete no topo proporciona. Isto torna mais fácil alinhar o filme sobre o gel e cortadoa banda sem o uso de marcadores fluorescentes.
   7. Com cuidado, retire o plástico e usar um bisturi ou navalha fresco para cada substrato RNA e extirpar as bandas do gel e coloque em separado 1,7 ml tubos de microcentrífuga. Use um nutator para agitações suaves durante a eluição.
   8. Adicionar 500 ul de tampão de eluição de ARN (0,5 M acetato de amónio, 10 mM de MgCl _2, 1 mM de EDTA, 0,2% SDS) a cada tubo. Resumidamente centrifugar para submergir o fragmento de gel. Incubar à temperatura ambiente no escuro, durante 3-16 horas, dependendo do tamanho da sonda.
   9. Transfira a totalidade dos 500 ul de material fluido para um novo tubo. Evitar a transferência de todos os pedaços de gel à medida que vai interferir com a purificação. Adicionar 1 ml de glicogénio (20 mg / ml), juntamente com 500 ul de frio, ácido fenol-clorofórmio (para o RNA).
   10. Resumidamente vórtice, a solução deve aparecer nublado. Gire a temperatura ambiente em alta velocidade (~ 16.000 xg) por 5-6 min.
   11. Cuidadosamente transfer parte superior (aquosa) camada de novos tubos de coleta, tanto quanto possível, evitando todos os detritos da interfase. Adicionar uma quantidade igual de clorofórmio à camada aquosa transferida. Repita o passo 3.4.10 e transferir o superior (aquosa) camada para um novo tubo. Adicionar 1 ml de gelado 95-100% EtOH para o material recolhido. Incubar a -80 ° C durante 10 min NOTA:. O ARN pode ser armazenado durante a noite, se o desejar.
   12. Granulado de RNA durante 30 min a 16.000 xg, a 4 ° C. Despeje cuidadosamente o sobrenadante para um recipiente de resíduos radioactivos e adicionar 1 ml de 70% de grau molecular gelada EtOH a cada pellet.
   13. Granulado de RNA a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C, deitar fora o sobrenadante, girar novamente durante 1 min e remover qualquer EtOH residual através de uma pipeta e deixar à temperatura ambiente com as tampas abertas para permitir a evaporação de qualquer EtOH restante.
   14. Volte a suspender as pelotas em 20-30 mL de água livre de RNase. ARN marcado pode ser armazenada a -80 ° C.
       Nota: Um medidor de pesquisa radioativo deve ser usado durante todo o procedimento de extração inteiro para verificar se o RNA marcado não foi perdida durante qualquer passo.
5. A determinação quantitativa de RNA rotulada para uma reação pré-mRNA 3 'do mRNA Cleavage
   1. Aproximar a molaridade dos substratos de clivagem utilizando o seguinte procedimento.
      1. Tome-se, por exemplo, 1 mL de 3000 Ci / mmol ^[α-32 P] UTP e 10 mCi / ml. (Na data de referência rótulo, a concentração química desta solução estoque será de 3,3 mM UTP. Antes dessa data é mais elevado e uma meia-vida (~ 13 dias) após a data em que é ~ 1,6 mM, etc) O rotulado UTP contribuição para a concentração final da reacção é geralmente insignificante quando uma concentração de UTP frio final acima UTP K _m é usado. O T7 RNAP K _m para UTP é de 114 mM ^15.
      2. Diluir as 1 ul em 39 ul de água. Em seguida, adicione 1 ml de diluído [α- ^{32 P] UTP a um volume apropriado de fluido de cintilação num frasco de cintilação. (NOTA: fluido de cintilação não é realmente necessário para essa atividade específica de 32 P como Cerenkov contagem dará valores cpm confiáveis ​​também Verifique o manual do contador de cintilação para escolher o canal correto para Cerenkov contagem e contar um volume de 1 ml por 1 min.).}
   2. Dilui-se 1 ml de cada substrato de ARN marcado em frascos separados, com uma igual quantidade de fluido de cintilação usado no passo anterior. Certifique-se de ter um frasco com apenas fluido de cintilação para calcular fundo. Quantificar a radioactividade num contador de cintilação.
   3. Multiplique as contagens por minuto (cpm) para o ^[α-32 P] amostra UTP em 40 de levar em consideração a diluição inicial e subtrair o fundo obtido por si só o líquido de cintilação. Multiplique as contagens para cada sonda de RNA com a quantidade de água livre de RNase (20-30 mL) utilizado para ressuspender o RNA sondas. Isto dá o cpm total do ARN purificado.
      Exemplo:. Max cpm = (cpm ^[α-32 P] UTP - fundo) x 40 rotulada Amostra RNA 1 = 20.000 cpm x 20 = 400.000 cpm (se 20 l utilizado para a ressuspensão)
   4. Se uma quantidade diferente de 1 ul de ^[α-32 P] UTP foi utilizado para fazer as transcrições, em seguida, este factor de volume em cpm final ^[α-32 P] UTP multiplicando o cpm para o ^[α-32 P] amostra UTP a quantidade utilizada.
      Exemplo: 2 ul de ^[α-32 P] UTP é usado para fazer os transcritos. O cpm calculado para 1 ul ^[α-32 P] UTP é de 500.000 cpm. Multiplique 500.000 * 2 = 1.000.000 cpm
   5. Dividir a cpm de ARN marcado calculado pela cpm calculada para ^[α-32 P] UTP sozinho. Isso dá mais ou menos estimar a porcentagem de UTP rotulado incorporado.
      Exemplo: 400.000 / 1.000.000 = 0,40 ou 40%incorporado
   6. Uma vez que uma enzima não pode distinguir entre os isótopos, a mesma percentagem de marcado e não marcado UTP é incorporado durante a transcrição do RNA. Calcular a quantidade de UTP frio em moles que é adicionado à reacção de transcrição (0,5 mL de uma solução 10 mM = 5,0 x 10 ^-9 mol de UTP).
   7. Multiplique o UTP moles na reação pela porcentagem incorporado (conhecido a partir da UTP quente contando acima), em seguida, dividir esse valor pelo número de uridinas na seqüência RNA.
      Exemplo: 5,0 x 10 ^-9 mol de UTP x 0,40 = 2 x 10 ^-9 mol UTP
      2 x 10 ^-9 mol UTP / 73 U por transcrição = 2.7 x 10 ^-11 moles de ARN
   8. Converter moles de RNA para molaridade dividindo o volume da solução de RNA ressuspensão recuperado.
      Exemplo: 2,7 x 10 ^-11 moles de ARN / 20 mL = 1,370 nM RNA. Para transcritos T7 RNAP feitas a partir de cerca de 1 ug linearesizado plasmídeo e ressuspenso em 20 ul de água, valores de 200 a 1400 nm são típicos.
      NOTA: A concentração molar de ARN é utilizada para assegurar que a concentração final do substrato pré-ARNm na reacção de clivagem in vitro é inferior a 5 nM por reacção de clivagem. Cleavage eficiência pode diminuir se a concentração de RNA é aumentado significativamente acima de 5 nM.

4. 3 'do mRNA clivagem Reacção

1. A reacção de clivagem Preparação do Reagente
   1. Preparar todos os reagentes necessários para a reacção de clivagem. Fazer 10% de álcool polivinílico (PVA) por água fervente e adicione aos poucos a quantidade correta de PVA em pó. 10% de PVA será viscoso e leva tempo a dissolver-se. Conservar à temperatura ambiente ou -20 ° C.
   2. Prepare um fosfato de creatina M (PB) e armazenar a -80 ° C. É importante a utilização de 1 M PB que é menos de 4 meses de idade.
   3. Prepare 1 M DTT e lojaa -20 ° C. Faça uma nova diluição 0,2 M DTT do 1 M DTT apenas antes de fazer a reacção de clivagem.
   4. Prepare ETS (solução de paragem de clivagem): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM de EDTA, 0,5% de SDS. Armazenar à temperatura ambiente.
2. A reacção de clivagem
   1. Aquece-se a ARN marcado para 80 ° C durante 2 min, em seguida, colocar em gelo.
   2. Gentilmente vórtice e, em seguida, girar o PVA 10% na velocidade máxima por 2-3 min para remover as bolhas.
   3. Master mix 1: Para uma única reacção, combinar 3,125 mL de 10% de PVA, 0,625 mL de 1 M PB, 0,25 mL de 0,5 M de ARNt, 0,125 mL de 100 mM de dATP, 0,13 ul de 40 U / ul de inibidor de ARNase, 0,25 ul de EDTA 0,1 M pH 8 , 0,1 mL de 0,2 M DTT, e 0,645 mL de água livre de RNase. Dispensar 5,25 mL master mix 1 por tubo no gelo.
   4. Mix Master 2: Usar 6,25 mL / reação de extratos nucleares em concentrações superiores a 2 mg / ml. Os extractos nucleares podem ser diluídos com Tampão D ₅₀ se needed.
   5. Combine os 6,25 mL de extrato nuclear com o anteriormente dispensado de 5,25 l de mistura principal 1. Adicione 1 ml de substrato marcado RNA que é diluído a 50 nm. Alternativamente, o ARN pode ser incluído na mistura mestre 1, desde que seja adicionado após o inibidor de RNase, DTT e tRNA NOTA:. Uso <5 nM do substrato ARN marcado.
   6. Gentilmente vórtice e giro rápido cada amostra para remover as bolhas. Incubar a 30 ° C por até 2 horas, mas um curso de tempo deve ser realizada para melhores resultados. Incubações mais longas pode aumentar a degradação de fundo.
3. A proteinase K e digestão Purificação
   1. Retirar as amostras do fogo e adicione 182,5 ml de solução de parada ETS para cada reação. Adicionar 5 uL de 20 mg / ml de proteinase K e incubar as amostras a 37 ° C durante 10 min.
   2. Extrair o ARN por adição de 1 volume (200 uL) de ácido fenol-clorofórmio, ^1/10 de volume de (20 ul) de sódio 3Mde etilo, e 1 ul de 20 mg / ml de glicogénio. Prossiga com extrações como descritos nas secções 3.4.9-3.4.14.
   3. Uma vez que a extração de RNA estiver concluída, certifique-se de remover todas as EtOH residual. Ressuspender o sedimento em 8 mL de tampão de carga (90% de formamida, 10 mM de EDTA, com Azul de Bromofenol (BFB) (e ou xileno cianol azul)). As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C ou proceder com electroforese em gel.
4. Eletroforese reacção de cisão
   1. Preparar um gel de acrilamida a 6%, como foi referido anteriormente em secções 3.3.1-3.3.17 com algumas modificações. Use 20 cm x 42 cm placas de gel de sequenciamento com 2 grampos da pasta de cada lado por muito tempo. Usar um pente 32 poços e preparar 40 mL da mistura de gel.
   2. Carregar o gel com 3 ul de marcador e 5 ul de cada amostra. Otimizar as configurações de eletroforese de acordo com a pré-clivagem e produtos clivada tamanhos.
   3. Quando eletroforese é concluída, siga seções 3.4.1-3.4.3 </ Strong> desmontar o gel. Em vez da película de plástico, cortar um pedaço de papel de filtro com o tamanho da placa de gel e colocá-la cuidadosamente de um lado do gel expostas.
   4. Pressione o papel de filtro com firmeza sobre o gel, em seguida, virar a placa de modo que o papel de filtro está no fundo eo vidro está no topo. Pressionar firmemente o copo sobre a mesa para assegurar que o gel é prender o papel de filtro de maneira uniforme.
   5. Lentamente descascar o papel de filtro, o que deve ter a gel ligado a ele, a partir de uma das extremidades curtas até que todo o papel de filtro com gel ligado é removido da placa de vidro.
   6. Cubra o lado gel exposta com filme plástico. Tape o filme plástico para o papel de filtro.
   7. Colocar o gel num secador de gel, com o lado do filtro virada para o lado do vácuo. Seco durante 15 minutos ou até que o gel esteja completamente seco.
      NOTA: Se um secador de gel não está disponível, um filme de raios-X pode ser utilizada para visualizar as bandas de ARN. A exposição deve ser levada a cabo num lighcassete t-tight com tela de intensificação a -80 ° C. Tempo de exposição é determinada empiricamente. Atenção: baixas por cento géis de acrilamida pode rachar em cima de congelamento.
   8. O gel pode agora ser utilizado para expor películas ou ser usado com um phospho-imager. Tempo de exposição depende da força do ARN marcado. Inicialmente pode ser utilizado um de exposição de 24 horas. Se usando filme, expor-se a -80 ° C com uma tela de intensificação e deixa-se aquecer até à temperatura ambiente antes do desenvolvimento.
   9. Medir a relação entre RNA clivada e não-clivada em cada amostra para quantificar a eficiência clivagem.

Resultados

Os resultados representativos de um ensaio de clivagem do ARN de poli (A), locais de HIV-1 (Figura 2). Podemos observar que a ARN substrato não clivado, que é a banda de migração mais lenta no topo do gel. O produto de clivagem específica é a mais intensa banda fragmento mais curto que é executado mais rapidamente no gel com o tamanho esperado, e é especificamente ausente do ensaio de clivagem da mutpoly (A) de controlo que contém uma mutação de ponto na sequência de poli-A (mutPolyA) ARN su...

Discussão

A in vitro reacção de corte pré-mRNA 3 ', realizada em extratos nucleares de células HeLa ou com fatores de clivagem fracionado a partir de extractos, permitiu a identificação dos fatores de clivagem do núcleo e seus principais complexos ^16-21. Muitas outras proteínas associadas a estes factores, foram recentemente identificadas ^22, e a reacção in vitro, pode continuar a lançar luz sobre a forma como estas proteínas contribuem para a reacção. Talvez, porque a rea...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Celstir flask	Wheaton	356884	Different sizes available
4 position slow speed stirrer	VWR	12621-076
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter		Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R	Eppendorf		Refridgerated
Thermomixer incubator	Eppendorf
250 ml conical tubes	Corning	430776
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
Ultraclear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modified MEM	Lonza	04-719Q
Fetal bovine serum	Atlas	F-0500-A	Heat inactivated
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Potassium chloride	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycerol	Fisher	BP229-4
5 M sodium chloride solution	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M solution	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ammonium sulfate	Fisher	A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel loading buffer II	Ambion	8546G
DEPC treated water	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x TBE	Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Ammonium acetate	Fisher	A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogen	Roche	10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof	Acros	61509-0040
Acid phenol:chloroform	Ambion	9720	For RNA
Scintilation fluid	Fisher	SX18-4
Rnase inhibitor	Promega	N261B
Polyvinyl alcohol- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Creatine phosphate	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Adjustable sequencing unit	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Binder clips	Office Depot	838-056
20 cm x 42 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
20 cm x 22 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
8-well comb	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
16-well comb	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32-well comb	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Gel repel coating	C.B.S. Scientific	SGR-0401	or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips	Rainin	GT-10-4	0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer	Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Autoradiography cassette	Fisher	FBCA 1417	8 x 10 size available