Analyse des réactions de transformation de l&#39;ARN utilisant des cellules des systèmes gratuits: 3 &#39;Fin de clivage de pré-ARNm substrats<em&gt; In vitro</em

Résumé

L'ARN polymérase II synthétise un ARN précurseur qui s'étend au-delà de l'extrémité 3 'de l'ARNm mature. L'extrémité de l'ARN mature est généré cotranscriptionally, sur un site dictée par des séquences d'ARN, par l'intermédiaire de l'activité d'endonucléase du complexe de clivage. Ici, nous détaillons la méthode d'étudier les réactions de clivage in vitro.

Résumé

L'extrémité 3 'des ARNm de mammifères n'est pas formé par un arrêt brutal de la transcription par l'ARN polymérase II (RNPII). Au lieu de cela, RNPII synthétise précurseur ARNm delà de la fin des ARN matures, et un processus actif de l'activité de l'endonucléase est nécessaire à un site spécifique. Le clivage de l'ARN précurseur se produit normalement 10 à 30 nt en aval du site polyA de consensus (AAUAAA) après les dinucléotides CA. Les protéines provenant du complexe de clivage, d'un complexe protéique multifactorielle d'environ 800 kDa, d'accomplir cette activité de nucléase spécifique. Des séquences d'ARN spécifiques en amont et en aval du site polyA contrôlent le recrutement du complexe de clivage. Immédiatement après le clivage, les pré-ARNm sont polyadénylés par la polymerase polyA (PAP) pour produire des messages d'ARN matures stables.

Le traitement de l'extrémité 3 'd'un transcrit d'ARN peut être étudiée en utilisant des extraits nucléaires cellulaires avec des substrats spécifiques d'ARN radiomarqués. En somme, un long ^{32 <}/ Sup> ARN précurseur non clivé P-marqué est incubé avec des extraits nucléaires in vitro, et clivage est évaluée par électrophorèse sur gel et autoradiographie. Lorsque clivage bon produit, un court 5 'clivé produit est détecté et quantifié. Ici, nous décrivons le test de clivage en détail à l'aide, par exemple, le traitement du VIH-1 ARNm extrémité 3 '.

Introduction

La biosynthèse de la plupart des ARN messages eucaryotes matures (ARNm) nécessite plusieurs modifications post-transcriptionnel comme le recouvrement, l'épissage et de polyadénylation. Ces modifications sont généralement couplés pour assurer un traitement correct et ^une augmenter fortement la stabilité de l'ARNm.

Le 3 'de la fin de la formation de pré-ARNm de mammifère est produite par le clivage endonucléolytique de l'ARN naissant suivie par l'addition de résidus adenylate à l'extrémité 5' produit clivé par poly (A) polymérase (PAP) ^4.2. Chez les mammifères, le clivage est effectué par un complexe protéique à plusieurs composants, d'environ 800 kDa, qui se monte sur des séquences pré-ARN spécifiques. Le poly (A) de la séquence signal, une séquence AAUAAA hexanucléotidique canonique hautement conservée, dirige le site de coupure à environ 10 à 30 nt en aval. Ce site est spécifiquement reconnu par le facteur de clivage et de polyadénylation spécificité (FSP) et la sous-unité de 73 kD deCSPF contient l'activité d'endonucléase. Le facteur de stimulation de clivage (CstF) se lie à un plus dégénérée de la séquence d'élément GU-U ou riches en aval de l'ARN poly (A) Site. Également requis pour le clivage est le facteur de clivage de mammifère I (MCIF), et le facteur de clivage de mammifère II (CFII). CFIM lie les sites spécifiques UGUA (N) dans les éléments de la séquence amont (usages) qui ont été définis pour un certain nombre de gènes et semblent être impliqués dans des processus physiologiques importants ^5-8.

In vitro, des réactions de transformation de l'ARN sont couramment analysées par l'utilisation de substrats d'ARN radiomarqués ^9-12. Ceux-ci peuvent être synthétisés par ruissellement transcription à partir du promoteur du bactériophage T7 ou SP6. Lorsque l'on étudie un site de polyadénylation qui n'a pas été caractérisé plus tôt, il est nécessaire d'utiliser l'ADN génomique au lieu de l'ADNc pour produire le substrat d'ARN, comme des séquences en aval importantes risquent de ne pas être présents dans l'ADNc. Conception des substrats pour inclure au moins 150 nt upstream et 50 nt en aval du site de clivage / fin de l'ARNm mature. Le produit de clivage migre plus vite que le substrat; cependant, parce que d'autres fragments peuvent être générés par une action non spécifique nucléase, la spécificité de la réaction qui doit être vérifié par sa dépendance à l'égard des séquences de signaux de traitement correctes. Par conséquent, des substrats d'ARN avec une mutation ponctuelle dans la séquence AAUAAA (par exemple AAGAAA) servent de témoin négatif pour la réaction de clivage.

Étant donné qu'une petite quantité de l'ARN radiomarqué est utilisé pour les réactions de clivage, RNases présentes dans une grande abondance dans la plupart des extraits nucléaires peuvent être problématiques, et de limiter le choix de la matière de départ pour la préparation de l'extrait. Cellules HeLa ont tendance à contenir de faibles niveaux de RNases endogènes, et donc de bons résultats dans ces essais.

Le clivage endonucléolytique des substrats d'ARN in vivo et in vitro est immédiatement suivi par le poly (A) addition, jeu.s l'intermédiaire clivé est pas présente en quantités détectables. Par conséquent, pour étudier, soit une séquence d'ARN spécifique ou des protéines impliquées dans une réaction de clivage, des expériences sont effectuées dans des conditions qui empêchent l'apparition de polyadénylation. Il n'ya pas de dépendance de clivage sur polyadénylation, ou vice-versa, si on peut arrêter polyadénylation sans nuire à la réaction de clivage. Ainsi, l'ATP est remplacé par un analogue de terminaison de chaîne qui n'a pas un groupe hydroxyle 3 'de telle sorte que seulement un seul nucleotide peut être incorporé au niveau du site poly (A) ARN et juste clivé peut être détecté.

Etant donné la complexité et le degré élevé de spécificité de ce type de dosage, on décrit un protocole de vidéo détaillée d'étudier le clivage endonucléolytique par la machine clivage / Poly (A) des précurseurs d'ARNm in vitro. Nous décrivons comment préparer des extraits nucléaires compétentes, générer des substrats d'ARN radiomarqués, effectuer la réaction de clivage, et analyser et interpréter le résultatproduits ing. figure 1 montre un exemple d'ARN substrats codant pour l'extrémité 3 'de HIV-1 de pré-ARNm à être utilisé pour un test de clivage. L'extrémité 3 'du génome de l'ARN du VIH est composé de plusieurs séquences régulatrices importantes telles que le site poly (A), une région riche en G + U, et l'élément d'utilisation qui sont tous nécessaires à la maturation efficace des produits de transcription d'ARNm viraux ¹³ . Dans cet exemple, nous nous attendons à l'ARN substrat d'entrée à 338 nt et après clivage 237 nt. Si polyadénylation a été autorisé à se produire, un frottis de produits serait observée entre 237 et 437 nt.

Protocole

1. L'adaptation de cellules adhérentes en suspension

(Cette étape est facultative. Cellules en suspension font généralement de meilleurs extraits nucléaires, mais les cellules cultivées dans des plaques peuvent également être utilisées.)

1. S'adapter à la croissance des cellules adhérentes en suspension en utilisant modifié MEM de Joklik additionné de 5 à 10% de sérum de veau nouveau-né ou du sérum de veau fœtal et 1% de L-glutamine: pénicilline-streptomycine. Propager les cellules dans des flacons à centrifuger avec un couvercle de filtre à 37 ° C avec 8% de CO _2.
2. Lors de l'adaptation des cellules, commencer par 100 ml dans un ballon de 500 ml spinner. Maintenir un minimum de 0,3 x 10 ⁶ cellules / ml et remplacer le milieu tous les 1-2 jours jusqu'à ce que le taux de croissance approprié est atteint (généralement 2-6 semaines). Une fois adapté, les cellules HeLa en suspension devraient doubler environ tous les 24 heures. REMARQUE: Pendant la phase d'adaptation, il faudra un certain temps pour que les cellules reviennent à leur taux de doublement normal.
3. Maintenir les cellules à un densité de 0,5 à 0,8 x 10 ⁶ cellules / ml dans le volume final souhaité (typiquement de 1 à 10 L)
4. Les cellules sont généralement récoltées à la phase logarithmique mi (environ 0,5 à 0,65 x 10 ⁶ cellules / ml et> 90% viable). Utilisation de la fiole centrifuge de taille appropriée pour la quantité désirée de milieux de culture.

2. Extraits nucléaires

1. Tampon et Préparation des réactifs
   REMARQUE: les extractions sont réalisées suivant un Dignam et al modifié (1983) ¹⁴ Procédure d'extrait nucléaire..
   1. Préparer 1X tampon phosphate salin, tampon A, tampon C, et D tampon (tableau 1) le jour avant de procéder à des extractions et conserver à 4 ° C.
      REMARQUE: Des rendements plus élevés sont généralement atteints avec un tampon fraîchement préparée; Toutefois, le tampon est stable pendant plusieurs semaines. Il est important que tous les tampons, des appareils et des équipements sont pré-refroidis et conservés au froid pour l'ensemble des extractions.Utilisez une chambre froide pour autant d'étapes possibles et / ou tout garder sur la glace. Ajouter du DTT et de PMSF juste avant utilisation.
2. Collecte et laver les cellules
   1. Verser cellules en quatre 250 ml de bouteilles et de spin coniques à 500 g pendant 5 min à 4 ° C dans une centrifugeuse avec un balancement ou un rotor à angle fixe. Les surnageants de Décanter et ajouter un autre 250 ml de milieu de culture de cellules dans chaque flacon. Répéter tourne jusqu'à ce que toutes les cellules ont été granulés.
   2. Reprendre pastilles finales combinées à un total de 250 ml de PBS glacé et piscine dans un flacon de 250 ml conique. Faire tourner les cellules à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse à godets oscillants.
   3. Verser le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS glacé de sorte que le volume total ne dépasse pas 50 ml. Desserrer le culot par l'intermédiaire de pipetage et transférer dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
   4. Faire tourner à nouveau les cellules à 500 xg pendant 6 min à 4 ° C dans une centrifugeuse à godets oscillants. Verser supernatant et estimation et noter le volume de culot cellulaire (CPV) aussi précisément que possible. Utiliser de l'eau dans un tube séparé correspondant, pour la comparaison, si la pastille est inférieure à celle des marquages ​​de volume sur le tube.
3. Lyse cellulaire
   1. Ajouter à la TNT tampon A. Remettre en suspension le culot dans un tampon A avec 5 volumes de la CPV estimé. Pipette pour briser le culot et incuber sur de la glace pendant 10 min.
   2. Faire tourner les cellules à 931 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse à godets oscillants.
   3. Aspirer délicatement le surnageant à la place de décantation. Le volume du culot aurait augmenté d'environ deux fois la taille due à un gonflement des cellules.
   4. Ajouter une CPV de tampon A pour les cellules. Casser délicatement le culot et enlever une petite aliquote (environ 50 pi) à un tube de micro sur la glace. Transférer les cellules remises en suspension dans un homogénéisateur Dounce de taille appropriée (habituellement de 15 ml de taille) refroidi sur glace.
   5. Lyse des cellules avec 12-15 coups lentement mais sûrement d'un type B (tight) pilon. Retirer une petite aliquote du lysat et examiner au microscope pour la lyse complète (petits noyaux sombres intactes par rapport à un gonflement des cellules) par coloration au bleu trypan. Cellules intactes seront claires). Continuer homogénéisation jusqu'à 90% de lyse est atteint et s'arrête ici, sur douncing peut nuire à la qualité d'extraits nucléaires.
   6. Transfert lysat dans UltraClear tubes d'ultracentrifugation et noter le volume total. Équilibrer par pesée des tubes et centrifuger à 1069 g pendant 10 min à 4 ° C.
      NOTE: L'ultracentrifugation est utilisée à cette étape en dépit de la vitesse de rotation faible, car le même tube est centrifugé à une vitesse plus élevée dans l'étape suivante. Ce spin donnera un culot assez serré recouvrant le fond du tube avec le surnageant plus nuageux ci-dessus, qui peuvent être collectées et utilisées pour les extraits S100 cytosoliques. S'il existe une couche lipidique visible sur la partie supérieure du tube, elle peut être enlevée.
   7. Retirez délicatement le surnageant avec une pipette et transférer dans anoth.. tube er Éviter de perturber le culot nucléaire NOTE: Il sera important de connaître le volume final de surnageant afin de déterminer le volume nucléaire emballé (PNV).
4. Préparation de l'extrait nucléaire
   1. Une fois que le surnageant a été soigneusement retiré, respin l'extrait nucléaire brut culot à 25 453 x g pendant 15 min à 4 ° C dans le même tube.
   2. Retirer le surnageant restant (il devrait être une petite quantité de liquide clair) et l'ajouter à la collection de surnageant précédente. Mesurer le volume final du surnageant. Calculer le PNV en soustrayant ce volume du volume total du lysat originale noté précédemment. En variante, si la pastille est assez grand, son volume peut être estimé en comparant avec le même volume d'eau dans un tube identique.
   3. Ajouter 1 PNV volume de tampon C (environ 1 ml / ml de cellules). Dégagez délicatement le culot avec une pipette et transférer dans un si appropriéehomogénéisateur zed Dounce. Si vous utilisez le même homogénéiseur avant, prélavage l'homogénéisation avec de l'eau déminéralisée stérile.
   4. Reprendre le culot avec ~ 5-10 coups via un homogénéisateur Dounce aide d'un pilon serré.
   5. Transférer le lysat nucléaire homogénéisé dans un tube refroidi et mélanger par inversion pendant 30 min à 4 ° C. Si le volume est assez grand, agiter l'aide d'une plaque d'agitation magnétique et d'un bar de spin.
   6. Transférer le lysat dans un nouveau tube de centrifugeuse ultraclear et tourner à 25 453 g pendant 30 min à 4 ° C. Le culot doit être compact. Environ 5 min avant l'essorage est terminé, hydrater les cassettes de dialyse ou des tubes qui ont un poids moléculaire approprié coupé (CMM) (par exemple 7000 kDa).
   7. Retirer le surnageant (extrait nucléaire) du tube dans un tube conique refroidi à l'aide d'une pipette de transfert alors procéder à la dialyse.
5. Dialyse
   1. Injecter les extraits dans des cassettes de dialyse hydratés comme par constructeurs instructions et dialyser les extraits nucléaires dans 500 ml de tampon D ₅₀ pendant 1 heure à 4 ° C sous agitation.
   2. Remplacez la solution avec 500 ml frais, glacé tampon D ₅₀ et dialyse pour un 4 heures supplémentaires à 4 ° C. Cette étape de 4 heures peut être divisé en deux changements 2 h à la place.
   3. Retirez les extraits de la cassette de dialyse et transférer dans des tubes réfrigérés. Faites tourner les extraits pendant 5 min à 1500 g à 4 ° C.
   4. Aliquoter des extraits dans des tubes Eppendorf, réfrigérés et enclenchez gel dans de l'azote liquide (50-100 pi par aliquote). Conserver à -80 ° C pour une utilisation future.

3. ARN Probe Synthesis

1. Préparation modèle
   REMARQUE: Les modèles utilisés pour la transcription peuvent être des fragments de PCR ou des plasmides qui contiennent un promoteur T7 ou SP6 en amont et immédiatement adjacente à la séquence de sonde souhaitée. Les modèles de Plasmide doivent être linéarisés en aval de la séquence matrice d'intEREST. Nous avons noté plus haut rendement à partir de modèles de PCR.
   1. Le promoteur de T7/SP6 peut être inséré au cours de la réaction de PCR. Concevoir l'amorce sens à l'T7/SP6 promoteur en amont de la séquence cible.
   2. Amplifier la séquence souhaitée dans 2-3 réactions par modèle par PCR selon les instructions du fabricant en utilisant une polymérase haute fidélité.
   3. Combinez réactions équivalentes et purifier par extraction de gel.
   4. Séquence des produits de PCR pour vérifier la précision du modèle. (Facultatif)
2. Transcription de l'ARN avec ³² P étiquetage
   1. Effectuer la transcription in vitro à partir de 1 pg de modèle avec un kit disponible dans le commerce qui est compatible avec le promoteur (SP6 ou T7) avec les modifications suivantes. Utiliser une pl de frais 3000 Ci / mmol ^[α-32P] UTP, 0,5 ul de 10 mM d'UTP froid, 0,1 ul d'mM GTP 10, et 0,9 ul de 10 mM m7G (5 ') ppp (5') G ARN bouchon dans un volume total final de 20 ul.
      NOTE: Le G-cap améliore la stabilité des transcrits d'ARN dans des extraits nucléaires (plafond: GTP) ratio de 10:1. L'UTP froid est ajouté pour empêcher la ³² P-UTP d'être le réactif limitant.
   2. Synthétiser un ARN taille, comme indiqué ci-dessus échelle sans le bouchon G. Modèles commerciaux sont disponibles pour générer le marqueur de taille d'ARN.
   3. Incuber les réactions de transcription à 37 ° C pendant 1 heure (pour utilisation SP6 40 ° C). Une fois terminé, effectuer digestion par la DNase du modèle pendant 15 min à 37 ° C.
   4. Après la digestion, ajouter 1 pl d'EDTA 0,5 M et 5 ul de tampon de chargement II sur les substrats d'ARN. Ajouter 20 ul tampon de charge II au marqueur.
   5. Chauffer le marqueur et les sondes ARN à 95 ° C pendant 3 minutes, puis placer sur la glace.
3. Gel de polyacrylamide Casting / Probe électrophorèse
   1. Préparer 1 L de 6% de gel de polyacrylamide (PAGE) et de mélange de 400 ml de 10% PAGE. Pour faire 6%, mélanger 150 ml de 40% 19:01 acrylamide: bis-uncrylamide avec 100 ml de 10X Tris / borate / EDTA (TBE) et 460 g d'urée. Amener à 800 ml avec de l'eau déminéralisée stérile et mélanger sur une plaque de cuisson tout en appliquant à basse température (autour de 50-80 ° C). Compléter à 1 L avec de l'eau déminéralisée.
      NOTE: La réaction est endothermique. Chauffage favorise la solubilisation de l'urée. Retirer du feu dès que l'urée est dissoute et porter la solution à 1 L avec de l'eau déminéralisée. Sinon agitation à température ambiante pendant la nuit; trop de chaleur peut initier la polymérisation.
   2. Protéger la PAGE mélange de la lumière avec une feuille d'aluminium et conserver à la température ambiante. Les mélanges de page peuvent être préparés à l'avance et sont stables pendant plusieurs mois.
   3. Préparer 400 ml de 10% PAGE mélange en combinant 100 ml de 40% d'acrylamide 19:01: bis-acrylamide, 40 ml de TBE 10x et 184 g d'urée. Après la dissolution du urée, élever à 400 ml avec de l'eau désionisée.
      Sinon, préparer une solution 19:01 d'acrylamide de 20% et de 0% solution d'acrylamide wie tampon et de l'urée seule; ceux-ci peuvent ensuite être mélangés dans n'importe quelle proportion pour donner un pourcentage compris entre 0 et 20%; urée est toujours lente à se dissoudre.
   4. Préparer 10 à 50 ml de 10% de persulfate d'ammonium (APS) en solution dans de l'eau désionisée stérile en fonction du nombre de gels d'être exprimés.
   5. Laver 20 cm x 22 cm des plaques de gel de verre avec 70% d'éthanol (EtOH). Séchez-les avec de grandes lingettes non pelucheux.
   6. Laver la plaque régulière avec 1 ml de 5 N d'hydroxyde de sodium (NaOH), puis relaver avec EtOH à 70%. Manteau de la plaque crantée avec une solution gel repoussent siliconisation en essuyant la plaque avec un petit Kimwipe saturé.
   7. Assembler les plaques en plaçant la plaque régulière sur une case vide de pointe de pipette ou un morceau de styromousse à l'élever de la table avec le côté nettoyé vers le haut. Disposer 0,4 mm d'espacement sur le bord de chacun des côtés longs.
   8. Placer délicatement la plaque à encoches sur les entretoises de telle sorte que le côté enduit sera sur l'intérieur du gel. Utilisez un rasoir ou autre instrument mince pour passerdes espaceurs pour un alignement affleurant au fond et sur les côtés des plaques de gel puis fixer avec des clips de liant sur chaque côté des plaques de gel sur les entretoises.
   9. Préparer 30 ml de 8% par gel PAGE mélange en mélangeant 15 ml de 10% et 6% par mélange dans un tube de 50 ml. Ajouter rapidement 300 ul de 10% APS suivis par 30 ul de N, N, N ', N'-tétra-méthyléthylènediamine (TEMED) pour le mélange de gel de 8%.
      Note: Les pourcentages de gel appropriées pour les tailles de sondes individuelles devraient être choisis par l'expérimentateur.
   10. Cap et 2x invertis et verser la solution dans la zone crantée des plaques de gel. Assurez-vous d'élever légèrement les plaques à la main et de maintenir un même versez jusqu'à ce que le mélange commence à PAGE s'écouler du bas.
   11. Abaissez les plaques revenir au niveau et insérez immédiatement le grand rectangle peigne 8 puits pour 0,4 mm x 20 cm gel. De petites bulles près du fond n'affectent pas le fonctionnement, mais il devrait y avoir pas de bulles dans les puits.
       NOTE: </ Strong> La place des serviettes en papier sur la table ci-dessous le bas et le haut du gel de capturer tout déversement pendant la coulée.
   12. Laisser le mélange à polymériser PAGE pendant au moins 30 min.
   13. Transférer le gel polymérisé à la chambre froide et d'assembler l'appareil d'électrophorèse. Ajouter tampon TBE froide pour les lignes de remplissage sur les chambres supérieures et inférieures.
   14. Retirer le peigne et utiliser un rasoir pour enlever les débris. Régler le gel dans l'appareil et en utilisant une agrafe de reliure pour maintenir la plaque de joint d'étanchéité. Ajouter TBE froid à la chambre supérieure jusqu'à ce qu'il se jette dans les plaques.
   15. Laver les puits avec 30 ml syringe/21 G 1-1/2 aiguille "rempli de TBE froid juste avant le chargement des substrats d'ARN marqués. Placer une plaque d'aluminium à l'arrière de la vitre afin d'aider à une distribution uniforme de la chaleur lors de l'exécution.
   16. Charge 3 ul du marqueur et de l'ensemble 25 pl de réaction de transcription chaque substrat d'ARN dans des puits séparés. Ajouter un bien entre les transcriptions de taille similaire à prevent contamination croisée. Bromophénol colorants bleus et cyanol xylène dans le tampon de charge peuvent être utilisées pour estimer la taille de la migration sur le gel.
   17. Exécuter le gel à une approprié à puissance régulée pour la taille des sondes d'ARN (par exemple, 25 watts pendant 2 heures pour les sondes de 600 nt).
4. Extraction ARN marqué et purification
   1. Après électrophorèse, égouttez les soigneusement la chambre supérieure de l'appareil de gel. La plupart de la radioactivité aura dans le gel et de la chambre inférieure; Toutefois, le tampon peut contenir un peu supérieure matières radioactives.
   2. Utilisez un plateau pour transporter le gel si passer à une autre zone de travail de matières radioactives. Retirez délicatement les entretoises en tirant la pièce en saillie sur le côté loin du gel.
   3. Séparez délicatement les plaques. Le gel doit s'en tenir à la plaque qui n'a pas été siliconée. Placez un morceau de pellicule plastique sur la plaque de gel et de verre.
   4. Placez un glogos AUTORAD marqueur autocollant sur la pellicule de plastique sur une sontun du gel qui est clair de tous les échantillons.
   5. Dans une pièce sombre, placez un morceau de film d'autoradiographie sur toute la plaque et exposer pendant au moins 1 min. Développer le film.
   6. Placez le film développé sur une surface de lumière. Ensuite, placer le côté plastique de la face vers le bas sur gel du film et aligner le repère de autoradiogramme du gel vers le marqueur sur le film exposé. Une fois aligné, utilisez un marqueur noir pour marquer l'emplacement des bandes souhaités sur le verre.
      REMARQUE: Vous pouvez également aligner les gels / film de la façon suivante pour découper des bandes d'ARN. Dans la chambre noire, placer le gel enveloppé sur une table, placer le film sur le dessus de celui-ci et placer une cassette (ou un livre, etc) sur le dessus de la pièce de film. Flick sur l'interrupteur de lumière dans la salle brièvement, puis l'éteindre. Ce sera "pré-flash" le film générer un aperçu de tous les puits sur le film en raison de la pression / protection de la lumière que la cassette sur le dessus fournit. Cela rend plus facile d'aligner le film sur le gel et découpéla bande sans l'aide de marqueurs fluorescents.
   7. Retirez délicatement la pellicule de plastique et d'utiliser un scalpel frais ou un rasoir pour chaque substrat d'ARN et exciser les bandes du gel et placer dans 1,7 ml microtubes de séparés. Utilisez une nutator pour agitations douces pendant l'élution.
   8. Ajouter 500 pi de tampon d'élution de l'ARN (0,5 M d'acétate d'ammonium, 10 mM de _MgCl2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) à chaque tube. Centrifuger brièvement pour submerger le fragment de gel. Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 3-16 heures selon la taille de la sonde.
   9. Transférer la totalité des 500 pl de matériel élue dans un nouveau tube. Éviter de transférer des morceaux de gel car ils interférer avec la purification. Ajouter 1 pi de glycogène (20 mg / ml) avec 500 ul de phénol-chloroforme acide à froid (pour l'ARN).
   10. En bref vortex, la solution doit être couvert. Tourner à la température ambiante à la vitesse supérieure (~ 16 000 xg) pour 5-6 min.
   11. Trans avec précautionfer le haut (aqueuse) superposer à de nouveaux tubes collecteurs autant que possible tout en évitant les débris de l'interphase. Ajouter une quantité égale de chloroforme à la couche aqueuse est transférée. Répétez l'étape 3.4.10 et transférer le haut (aqueuse) couche dans un nouveau tube. Ajouter 1 ml de glace-EtOH froid de 95 à 100% de la matière collectée. Incuber à -80 ° C pendant 10 min. REMARQUE: L'ARN peut être stocké pendant une nuit, si désiré.
   12. Un culot de l'ARN pendant 30 min à 16 000 xg à 4 ° C. Versez délicatement le surnageant dans un récipient de déchets radioactifs et ajouter 1 ml de glace-froid à 70% pour la biologie moléculaire EtOH à chaque pastille.
   13. Pellet l'ARN à 16 000 g pendant 15 min à 4 ° C, verser le surnageant, tourner à nouveau pendant 1 min et retirez tout EtOH résiduel via une pipette et le laisser à température ambiante avec les bouchons ouverts pour permettre l'évaporation de toute EtOH restant.
   14. Remettre en suspension les boulettes dans 20-30 pi d'eau sans RNase. ARN marqué peut être conservé à -80 ° C.
       NOTE: Un appareil de mesure radioactive doit être utilisé tout au long de la procédure d'extraction entier pour vérifier que l'ARN marqué n'a pas été perdu au cours d'une étape.
5. La quantification de l'ARN marqué pour une réaction pré-ARNm 3 'de l'ARNm Décolleté
   1. Approximer la molarité des substrats de clivage à l'aide de la procédure suivante.
      1. Prenons, par exemple, 1 ul de 3000 Ci / mmol ^[α-32P] UTP et 10 mCi / ml. (À la date de référence de l'étiquette, la concentration chimique de cette solution de réserve sera de 3,3 uM UTP. Avant cette date, il est plus élevé et une demi-vie (~ 13 jours) après la date, il est ~ 1,6 mM, etc) L'marqué UTP contribution à la concentration finale de réaction est généralement négligeable lorsque la concentration en UTP froid finale au-dessus de l'UTP K _m est utilisé. Le _m T7 RNAP K pour UTP est de 114 mM ^15.
      2. Diluer les 1 pi à 39 pi d'eau. Puis ajouter 1 pl de dilué [α- ^{32P] UTP à un volume approprié de liquide de scintillation dans un flacon à scintillation. (NOTE: fluide de scintillation n'est pas réellement nécessaire pour cette activité spécifique de 32 P comme comptage de Cerenkov donnera valeurs cpm fiables trop Vérifier le compteur manuel de scintillation de choisir le bon canal pour comptage de Cerenkov et compter un volume de 1 ml pour 1 min.).}
   2. Diluer 1 ul de chaque substrat d'ARN marqué dans des flacons séparés avec une quantité égale de liquide de scintillation utilisé dans l'étape précédente. Assurez-vous d'avoir un flacon avec uniquement du liquide de scintillation pour calculer fond. Quantifier la radioactivité dans un compteur à scintillation.
   3. Multiplier les coups par minute (cpm) pour le ^[α-32P] UTP échantillon de 40 pour tenir compte de la dilution initiale et soustraire le fond obtenu par le liquide de scintillation seul. Multiplier les chiffres pour chaque sonde d'ARN par la quantité d'eau sans RNase (20-30 pi) utilisée pour remettre le RNA sondes. Cela donne le cpm total de l'ARN purifié.
      Exemple:. Cpm Max = (cpm ^[α-32P] UTP - fond) x 40 Étiqueté échantillon d'ARN 1 = 20 000 cpm x 20 = 400 000 cpm (si 20 pi utilisés pour la remise en suspension)
   4. Si un montant autre que 1 pl de ^[α-32P] UTP a été utilisé pour faire les relevés de notes, puis tenir compte de ce volume dans le cpm finale de ^[α-32P] UTP en multipliant le cpm pour la ^[α-32 P] UTP échantillon par la quantité utilisée.
      Exemple: 2 pi de ^[α-32P] UTP est utilisé pour faire les relevés de notes. Le cpm calculé pour une pl ^[α-32P] UTP est de 500.000 cpm. Multiplier 500 000 * 2 = 1000000 cpm
   5. Diviser la marqué cpm d'ARN calculée par le cpm calculé pour ^[α-32P] UTP seul. Ce sera à peu près estimer le pourcentage de UTP marqué incorporé.
      Exemple: 400000/1000000 = 0,40 ou 40%incorporé
   6. Depuis une enzyme ne peut pas distinguer entre les isotopes, le même pourcentage d'marqué et non marqué UTP est incorporé dans l'ARN pendant la transcription. Calculer la quantité de froid en moles UTP qui est ajouté à la réaction de transcription (0,5 pi d'une solution à 10 mM = 5,0 x 10 ^-9 moles de UTP).
   7. Multiplier l'UTP moles dans la réaction par le pour cent incorporé (connu à partir de l'UTP à chaud de comptage ci-dessus), puis diviser par le nombre de uridines dans la séquence d'ARN.
      Exemple: 5,0 x 10 ^-9 moles d'UTP x 0,40 = 2 x 10 ^-9 moles UTP
      2 x 10 ^-9 moles UTP / 73 U par transcription = 2,7 x 10 ^-11 moles d'ARN
   8. Autre moles d'ARN à molarité en divisant le volume de la solution de remise en suspension de l'ARN récupéré.
      Exemple: 2,7 x 10 ^-11 moles d'ARN / 20 pl = 1370 nM ARN. Pour les transcriptions T7 RNAP fabriqués à partir d'environ 1 ug linéaireized plasmide et remis en suspension dans 20 pi d'eau, des valeurs de 200 à 1 400 nM sont typiques.
      REMARQUE: La concentration molaire de l'ARN est utilisé pour s'assurer que la concentration de substrat pré-ARNm finale dans la réaction de clivage in vitro est inférieure à 5 nM par réaction de clivage. l'efficacité de clivage peut diminuer si la concentration en ARN est soulevée de manière significative au-dessus de 5 nM.

4. 3 'de l'ARNm clivage réaction

1. Décolleté réaction Préparation des réactifs
   1. Préparer tous les réactifs nécessaires à la réaction de clivage. Faire 10% d'alcool polyvinylique (PVA) par de l'eau bouillante et ajouter lentement la quantité correcte de poudre PVA. 10% de PVA sera visqueux et prend du temps à se dissoudre. Conserver à température ambiante ou à -20 ° C.
   2. Préparer 1 M phosphate de créatine (CP) et conserver à -80 ° C. Il est important d'utiliser une M CP qui est âgé de moins de 4 mois.
   3. Préparer 1 M DTT et magasinà -20 ° C. Prendre un nouveau 0,2 M DTT dilution du 1 M DTT juste avant de faire la réaction de clivage.
   4. Préparer ETS (solution d'arrêt de clivage): 10 mM Tris pH 7,8, 10 mM d'EDTA, 0,5% de SDS. Stocker à température ambiante.
2. Décolleté réaction
   1. Chauffer l'ARN marqué à 80 ° C pendant 2 minutes, puis placer sur la glace.
   2. Vortex doucement puis tourner le 10% de PVA à la vitesse supérieure pendant 2-3 min pour éliminer les bulles.
   3. Maître mélange 1: Pour une seule réaction, combiner 3.125 pi 10% de PVA, 0,625 pi 1 M CP, 0,25 pl 0,5 M ARNt, 0,125 pi mM dATP 100, 0,13 pi 40 U / inhibiteur de RNase pl, 0,25 pi EDTA 0,1 M pH 8 , 0,1 ul de 0,2 M DTT, et 0,645 d'eau sans RNase-pi. Distribuer 5,25 pi master mix 1 par tube sur la glace.
   4. Master Mix 2: Utilisation 6,25 pl / réaction des extraits nucléaires à des concentrations supérieures à 2 mg / ml. Des extraits nucléaires peuvent être dilués avec du tampon D ₅₀ si needed.
   5. Combiner les 6,25 ul de l'extrait nucléaire avec précédemment distribué 5,25 pi de mélange maître 1. Ajouter 1 pi de substrat d'ARN marqué qui est dilué à 50 nM. Alternativement, l'ARN peut être inclus dans le mélange de Master 1 à condition que il est ajouté après l'inhibiteur de RNase, TNT et ARNt. REMARQUE: Utilisez <5 nM du substrat ARN marqué.
   6. Vortex doucement et tour rapide chaque échantillon pour éliminer les bulles. Incuber à 30 ° C pendant 2 heures, mais une évolution dans le temps doit être effectuée pour des résultats optimaux. Incubations plus longues pourraient augmenter la dégradation de fond.
3. Protéinase K digestion et purification
   1. Retirer les échantillons du feu et ajouter 182,5 pi de solution d'arrêt d'ETS pour chaque réaction. Ajouter 5 ul de 20 mg / ml de protéinase K et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 10 min.
   2. Extraire l'ARN en ajoutant 1 volume (200 pi) de l'acide phénol-chloroforme, 1/10 ^ème volume (20 ul) de sodium 3 Mde l'acétate, et 1 ul de 20 mg / ml de glycogène. Procéder à des extractions, comme décrit dans les sections 3.4.9-3.4.14.
   3. Une fois l'extraction de l'ARN est terminée, assurez-vous de retirer tous EtOH résiduelle. Remettre en suspension le culot dans 8 ul de tampon de charge (90% de formamide, 10 mM d'EDTA, avec bleu de bromophénol (BFB) (et Xylène Cyanol ou bleu)). Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C ou de procéder à une électrophorèse sur gel.
4. Décolleté réaction électrophorèse
   1. Préparer un gel d'acrylamide à 6% comme indiqué précédemment dans les sections 3.3.1-3.3.17 avec quelques modifications. Utilisez 20 cm x 42 cm plaques de gel de séquençage avec 2 clips de liant sur chaque côté long. Utilisez un peigne à 32 puits et préparer 40 ml de la composition de gel.
   2. Chargez le gel avec 3 pi de marqueur et 5 ul de chaque échantillon. Optimiser les réglages d'électrophorèse selon pré-clivage et produits clivé tailles.
   3. Lorsque l'électrophorèse est terminée, suivez les sections 3.4.1-3.4.3 </ Strong> de démonter le gel. Au lieu d'une pellicule de plastique, couper un morceau de papier filtre à la taille de la plaque de gel et soigneusement le placer sur un côté du gel exposé.
   4. Appuyez sur le papier filtre fermement sur le gel, puis retournez sur la plaque de sorte que le papier filtre est sur le fond et le verre est sur le dessus. Appuyez fermement sur le verre sur la table pour s'assurer que le gel est saisissant le papier filtre uniformément.
   5. Lentement peler le papier-filtre, qui doit avoir le gel lui est attaché, à partir de l'une des extrémités courtes jusqu'à ce que tout le papier filtre avec du gel ci-joint est retiré de la plaque de verre.
   6. Couvrir le côté de gel exposée avec une pellicule de plastique. Collez la pellicule de plastique pour le papier filtre.
   7. Placer le gel sur un séchoir à gel avec le côté du filtre tourné vers le côté d'aspiration. À sec pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que le gel est complètement sec.
      REMARQUE: si un séchoir à gel n'est pas disponible, un film à rayons X peut être utilisée pour visualiser les bandes d'ARN. L'exposition doit être effectuée dans un light-serré cassette avec écran d'intensification à -80 ° C. Le temps d'exposition est déterminée de manière empirique. Attention: de faibles gels pour cent d'acrylamide peuvent se fissurer lors de la congélation.
   8. Le gel peut maintenant être utilisé pour exposer des films ou être utilisés avec un phospho-imageur. Le temps d'exposition dépend de la force de l'ARN marqué. Initialement, une exposition de 24 heures peut être utilisé. Si vous utilisez un film, exposer à -80 ° C avec un écran d'intensification et laisser réchauffer à température ambiante avant de développer.
   9. Mesurer le rapport entre l'ARN clivé et non clivé dans chaque échantillon pour quantifier l'efficacité de clivage.

Résultats

Les résultats représentatifs d'un dosage de clivage de l'ARN poly (A) des sites de VIH-1 (Figure 2). Nous pouvons observer le substrat d'ARN non clivé, qui est le plus lent bande de migration à la surface du gel. Le produit clivé spécifique est la plus intense plus courte bande le fragment qui tourne plus vite dans le gel à la taille attendue, et est spécifiquement absente du test de clivage de la mutpoly (A) contrôle qui contient une mutation ponctuelle dans la séquence polyA (mut...

Discussion

La réaction de clivage de pré-ARNm en 3 'in vitro, réalisée dans des extraits nucléaires de cellules HeLa ou avec des facteurs de clivage fractionnés à partir de ces extraits, a permis d'identifier les principaux facteurs de clivage et de leurs principaux complexes ^16-21. Beaucoup plus de protéines associées à ces facteurs ont été récemment identifié ^22, et la réaction in vitro peuvent continuer à faire la lumière sur la façon dont ces protéines contribu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Celstir flask	Wheaton	356884	Different sizes available
4 position slow speed stirrer	VWR	12621-076
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter		Allegra x-15R with SX4500 Rotor
Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Optima L-100 XP Ultra with SW41 Rotor
Table top centrifuge 5417R	Eppendorf		Refridgerated
Thermomixer incubator	Eppendorf
250 ml conical tubes	Corning	430776
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
Ultraclear centrifuge tubes	Beckman Coulter	344059
JOKLIK modified MEM	Lonza	04-719Q
Fetal bovine serum	Atlas	F-0500-A	Heat inactivated
L-glut:pen:strep	Gemini Bio-Products	400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Potassium chloride	MP Biomedicals	194844
HEPES	Fisher	BP310-500
DTT	Alexis Biomedicals	280-001-G-010
Glycerol	Fisher	BP229-4
5 M sodium chloride solution	Mediatech	46-032-CV
EDTA 0.5 M solution	Sigma-Aldrich	E7889-100ml
EDTA	Fisher	BP120-500
PMSF	Thermo Scientific	36978
Ammonium sulfate	Fisher	A702-500
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche	04 693 132 001
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Kit	Thermo Scientific	66372	MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml
15 ml Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D9938-1SET	Different sizes available
Expand high fidelity PCR kit	Roche	11 732 650 001
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	Y02256	10 mM each nucleotide
MaxiScript SP6/T7 kit	Ambion	AM1322
m7G(5')ppp(5') G RNA cap	New England Biolabs	S1404S
Century Marker Template Plus	Ambion	AM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCi	Perkin Elmer	BLU507H250UC
Gel loading buffer II	Ambion	8546G
DEPC treated water	Ambion	AM9906
10x TAE	Fisher	BP13354
10x TBE	Ameresco Life Sciences	0658-4L
10x PBS	Fisher	BP399-20
Urea	Fisher	BP169-212
Ammonium persulfate	Bio-Rad	161-0700
TEMED	Fisher	BP150-20
Ammonium acetate	Fisher	A637-500
40% 19:1 acrylamide:bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0144
Glycogen	Roche	10 901 393 001
100% absolute ethanol 200 proof	Acros	61509-0040
Acid phenol:chloroform	Ambion	9720	For RNA
Scintilation fluid	Fisher	SX18-4
Rnase inhibitor	Promega	N261B
Polyvinyl alcohol- PVA	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Creatine phosphate	Calbiochem	2380
100 mM dATP	Fisher	BP2560-4
SDS	Acros	23042-5000
Proteinase K	Fisher	BP1700-100
Adjustable sequencing unit	Sigma-Aldrich	Z351881-1EA
Binder clips	Office Depot	838-056
20 cm x 42 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z352543	1 SET
20 cm x 22 cm glass plates	Sigma-Aldrich	Z35252-7	1 SET
20 cm x 42 cm aluminum cooling plates	Sigma-Aldrich	Z352667	1 EA
0.4 mm x 22 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z35230-6	1 SET
0.4 mm x 42 cm spacers	Sigma-Aldrich	Z352314-1	1 SET
8-well comb	Sigma-Aldrich	Z35195-4	1 EA
16-well comb	Sigma-Aldrich	Z351962	1 EA
32-well comb	Sigma-Aldrich	Z351970	1 EA
Gel repel coating	C.B.S. Scientific	SGR-0401	or SGR-0101 for individual bottle
Gel loading tips	Rainin	GT-10-4	0.1-10 μl
Sequencing PowerPac HV	Bio-Rad	PowerPac HV	5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583	Bio-Rad	Model 583
Hydrotech vacuum pump for gel dryer	Bio-Rad
Glogos II Glow-in-the-dark markers	Agilent	420201
Film 8 x 10	Midsci	BX810
Film 14 x 17	Phenix	F-BX1417
Autoradiography cassette	Fisher	FBCA 1417	8 x 10 size available