Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Zusammenfassung

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Zusammenfassung

Inhärenten Prozesse der Drosophila Puppenentwicklung können sich verschieben und verdrehen die Augen Epithel in einer Weise, die einzelnen Zellverhalten schwer in lebenden Zellen zu verfolgen, zu machen. Diese Prozesse umfassen: Netzhautrotation, das Zellwachstum und organismischen Bewegung. Zusätzlich Falten Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich feinen Unebenheiten und oft eingeführt, wie die Puppe zur Abbildung hergestellt, es schwer machen, in unscharfe Bilder von mehr als ein paar Ommatidien in einer einzigen Brennebene zu erwerben. Der Workflow skizzierten Heil diese Fragen, was eine einfache Analyse zellulärer Prozesse bei Drosophila Puppenaugenentwicklung. Passenderstufigen Puppen sind in einem bildgebenden rig, die leicht in den meisten Labors montiert werden kann angeordnet Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP und GMR-GAL4 -driven UAS-α-Catenin: GFP werden verwendet, um Zellgrenzen im Auge Epithel ¹ visualisieren ^-3. Nach Dekonvolution istFluoreszenzbildern mit mehreren Fokusebenen erfasst angewendet werden maximale Projektionsbilder für jeden Zeitpunkt erzeugt und verstärkt mit einer Bildbearbeitungssoftware. Alignment-Algorithmen verwendet werden, um schnell zu stabilisieren flüssige Bewegung, so dass einzelne Zelle Verhalten leichter zu verfolgen.

Einleitung

Die Verbindung Drosophila Auge wird durch die stereotype Anordnung seiner ~ 750 Ommatidien von einem Wabengitter von Zubehörpigmentzellen ^4,5 getrennt sind. Lokale Zellbewegungen, Zellwachstum, die Veränderungen in der Zellform und Apoptose: Diese Pigmentzellen werden durch eine koordinierte Kombination von Ereignissen gemustert. Live-Anzeige dieser Epithel ermöglicht es, die molekularen Mechanismen, auf denen diese Ereignisse in einem physiologisch relevanten und gelassen dreidimensionalen Kontext zu untersuchen.

Im Gegensatz zu bisherigen Protokolle ^6,7, die Technik hier skizzierten umfasst ein effizientes Verfahren zum Stabilisieren von äußerem Gewebe Bewegung, die nicht entkoppelt von dem Abbildungsprozess sein kann. Dieses Verfahren verbessert die Untersuchungen des Zellverhaltens in dem Entwicklungs Drosophila Puppenauge Epithel - einem Gewebe wächst dreht und verschiebt sich im Laufe der Bildverarbeitung. Neben der Bewegungsstabilisierungstechnik dehier beschrieben wird zur Untersuchung von Zellen in anderen Zusammenhängen, wo Fremdbewegung auftritt.

Um Zellgrenzen in der Netzhautfeld Drosophila sichtbar zu machen, wurden transgene Fliegenlinien erzeugt, die ubi-DE-Cadherin Ausdruck: GFP sowie UAS-α-Catenin: GFP unter Kontrolle des Auges spezifischen Treiber GMR-GAL4 ^1-3. Die Verwendung von zwei GFP-markierten Membranmarker erlaubt die Visualisierung von Zellgrenzen zu niedrigeren Lichtintensität. Dies minimiert Gewebeschäden und Photobleaching auf wiederholte Exposition gegenüber Hochenergiewellenlängen, so dass erhöhte Bildrate und Filmdauer. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der RNAi-Transgene, UAS-DCR-2 wurde auch in eine zweite Fliege Linie ⁸ eingearbeitet.

In einem dritten Update von früheren Protokollen wird ein einfacher Bild rig, die leicht in den meisten Labors zusammengesetzt beschrieben. Diese Vorrichtung vermeidet die Erfordernis, eine spezielle Abbildungs ​​r habenig von einer Universität "Werkstatt" oder ähnlichen Dienst generiert. Diese Bild rig ist ähnlich wie die Bild anderen Puppen Gewebe ^9,10 verwendet.

Präsentiert hier ist eine einfache Live-Cell-Imaging-Protokoll, das verwendet werden kann, um direkt bewerten die morphogenetischen Ereignisse, die zu Augen Strukturierung von ~ 17 bis 42 Stunden nach der Pupariumbildung (hr APF) beitragen. Insbesondere ermöglicht es dieses Protokoll, um die Konsequenzen der Modifizierung Genexpression während Puppenentwicklung zu bestimmen.

Protokoll

3 zeigt eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren.

1. Gewebepräparation

1. Um die Folgen der veränderten Expression eines Gens von Interesse, die folgende Quer in zweifacher Ausfertigung zur Ermittlung und Pflege bei 25 ° C: UAS-Transgen (Männer) X GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfräulichen Weibchen) HINWEIS: Um Kontrollgewebe Quer UAS-lacZ erhalten Männchen zu GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP Frauen. β-Galactosidase erzeugt keine Mängel in den Zellverhalten in der Netzhaut.
2. Um die Wirksamkeit der RNAi Transgenen zu verbessern, Männchen Quer UAS-RNAi, um GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfräulichen Weibchen.
   HINWEIS: Gelegentliche Fehler in das Zellverhalten in retinae Ausdruck Eileiter DCR-2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wachsamkeit ist empfehlenswert, wenn mit diesem Ansatz.
3. Select weiß Pre-Puppen von geeigneten Genotypen und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn die Puppen zum Ausdruck DCR-2, wählen Sie entweder männlich oder weiblich Puppen: Ausdruck der UAS-DCR-2 ist ein Einsatz auf dem X-Chromosom, ist stärker bei Männern. Puppen sollten bei 0 h APF vor Pigmentierung der Puppenhülle sexed werden - die Keimdrüsen der Männchen sind so groß scheinenden Kugeln auf den Seiten der Puppe (etwa ein Drittel aus dem hinteren) sichtbar.
4. Mikrozentrifugenröhrchen, die Puppen in einem sauberen Plastikspitze-Box bei 25 ° C inkubieren. Um Austrocknung der Puppen Ort verhindern, dass ein 10 cm ² Gewebestück, in destilliertem Wasser eingeweicht, in die Spitze-Box.
   HINWEIS: Wenn die Luftfeuchtigkeit im Tip-Box zu hoch wird die Puppenhülle kann matschig und schwer in den nachfolgenden Schritten zu sezieren werden.
5. Inkubieren für angemessene Zeit. Zur Erfassung Zelle Verhalten mit Mustern des Auges verbunden sind, vorzubereiten Puppen für die Bildgebung bei rund 17 Stunden APF, 20 Stunden oder 24-Stunden-APF APF. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die weitere Diskussion auf, wenn bestimmte Zelle Verhaltensweisen am besten beobachtet.
6. Legen Sie ein Stück frischen doppelseitigem Klebeband auf einem schwarzen Sylgard Dissektion Gericht. Positionieren Sie eine Puppe, Rückenseite nach oben, mit dem Kopf der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband (1A) eingehalten .try nicht, den Brust- und Bauch Regionen der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband haften. Mit einer Pinzette vorsichtig anheben und entfernen Sie das Operculum, den Puppenkopf aus. Reißen entlang der Seite der Puppenhülle um den Bereich um ein Auge aus.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Puppe vom Klebeband. Wenn die Puppe haften bleibt, geben Sie eine kleine Menge von destilliertem Wasser zu dem Übergang zwischen der Puppenhülle und Klebeband, um die Haftung zu schwächen.

2. Montage

1. Konstruktion eines kleinen 15 mm ² Rahmen aus Löschpapier und ein Loch in der middlethat ist 5,5 mm im Durchmesser (1B). Tauchen Sie ein in destilliertem Wasser und indie Mitte eine Mikroskop-Objektträger. Mit einem 30-ml-Spritze, Squeeze-out eine einheitliche Ring Vaseline das Löschpapier Frame zu umgeben. Sicherzustellen, daß die Vaseline Ring geringfügig höher ist als die Breite der Puppe und daß der Durchmesser des Rings geringfügig kleiner als die Breite eines Deckglases ist.
2. Fügen Sie eine kleine Raupe aus Vaseline direkt auf den Objektträger, in das Loch in das Löschpapier (1C) gestanzt .Carefully ordnen Sie die Puppe auf die Seite, von der Vaseline Wulst (1D) unterstützt.
3. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Vaseline Ring, so dass er in Kontakt mit dem Epithel über dem Auge Neuroepithel (1D). Komprimieren Sie vorsichtig die Vorbereitung auf das Deckglas gegen die Vaseline verschließen und erzeugen einen kleinen flachen Kontaktfläche zwischen dem Puppenaugenbereich und dem Deckglas.

3. Fluoreszenz-Imaging

1. Bild des Puppenvorbereitung mit einFluoreszenzmikroskop. Alle 7 min Abscheidung Serienschnitte durch den apikalen Domäne des Auges Neuroepithel, in den Bereich der Adhärenzverbindungen.
   HINWEIS: a) geeignete Serienschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel von 0,2 um z-Schritten zusammen. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich milde Beulen und Falten, kann es schwierig sein Scharf Bilder von großen Gewebebereiche zu erwerben. Während Bildgebung kann ein Teil eines Bereichs von Interesse zu finden, um in-Fokus, und eine Nachbarregion zu out-of-Fokus. Einschließlich ein kleines Tröpfchen destilliertes Wasser zwischen dem Puppen Auge und Deck einige akute Gewebefalten aber nicht beseitigen die leicht unebenen Topologie Eigenschaft der frühen Stadien der Puppenauge Morphogenese. In diesen Fällen überabzutasten das Gewebe durch die Verlängerung der Z-Stapel, bis Scharf Scheiben werden für den gesamten Bereich erworben. c) Aufnahme von Serienschnitten alle 7 min sollten Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ohne signifikante redu aktivierenction in der Intensität der GFP-Fluoreszenz, die die Bildqualität beeinträchtigen können. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung zu reduzieren.
2. Weiter Bildgebung für 3 bis 4 Stunden. Verwenden Sie keinen Autofokus und Zeitfunktion, die auf vielen Fluoreszenz-Mikroskope zur Verfügung steht, da Puppen Wachstum und Pumpen der Hämolymphe bewegt sich die Position der Netzhaut und wachsam Neuausrichtung benötigt jede 14 bis 21 min. Beachten Sie, dass Bildgebung über 4 Stunden kann verlangsamen oder zum Stillstand Morphogenese des Auges.
3. Verwenden Sie geeignete Entfaltungssoftware Hintergrund zu verringern und den Kontrast der seriellen Schnittbilder. Für jede Z-Stapel-Datei, führen Sie das folgende in LAS AF Software (siehe Tabelle der Werkstoffe): Wechseln Sie zum Werkzeugfenster, wählen Sie 3D Dekonvolution und klicken Sie auf Übernehmen.
4. Erzeugen Sie eine maximale Projektion (MP) für jeden entfaltet Stack-Datei: Navigieren Sie zu der Werkzeugleiste, wählen Sie 3D-Projektion und klicken Sie auf Übernehmen.
   Hinweis: Die maximale Projektionsalgorithmus kann fehlschlagen, ein einheitliches erzeugenly Bild in-Fokus für Gewebe, die überabgetastete hat. Ein Verfahren zum Schärfen von out-of-focus-Regionen in Schritt 5.2 beschrieben sind.

4. Post-Bildgebung Pupal Rettungs- und Phänotyp Verification

1. Um Adresse, ob Artefakte eingeführt wurden oder die Puppe während der Bildgebung zu Schaden, entfernen Sie vorsichtig die Puppe von der Bild rig: mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckglas und übertragen Sie die Puppe in eine saubere Phiole von Lebensmitteln. Bei einer Raumtemperatur oder 25 ° C, bis die erwachsene Fliege auftaucht.
2. Sorgfältig prüfen, den Phänotyp der erwachsenen Auge und im Vergleich zu den Augen der erwachsenen Fliegen, die aus dem ursprünglichen Flug Kreuz.

5. Bildverarbeitung

1. Automatische Bildausrichtung:
   HINWEIS: Die Live Drosophila Gewebe verschieben und zu wachsen in der gesamten Abbildungsprozesses. Folglich sind die Mitten der Bilder gesammelt zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkte nicht auf den gleichen Punkt in der Drosophila Gewebe entsprechen. Neben dergesamte Retina Scheibe dreht sich um 30 ° zwischen ~ 21 und 23 h APF. Um einzelne Zelle Verhaltensweisen hervorheben und Ablenkungen durch organismal Wachstum zu reduzieren, richten Sie jeden MP image.While dies kann manuell durchgeführt werden, die Bildbearbeitungs-Software verwendet hier (siehe Tabelle der Materialien) verfügt über eine integrierte Algorithmen, die den Prozess zu beschleunigen kann.
   1. Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Scripts und wählen Sie Dateien in Stapel laden.
   2. Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist.
      HINWEIS: Wenn diese Option aktiviert ist, kann die Software eine Alignment-Algorithmus, der die Bilddaten verfälscht verwenden.
   3. Sobald alle MP-Dateien in die Ebenen-Fensterbereich geladen werden, um sicherzustellen, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge, so dass der früheste Zeitpunkt ist an der Spitze des Schichtstapels. Wenn die Schichten nicht in der richtigen Reihenfolge per Drag & Drop, bis sie bestellt werdenrichtig.
   4. Wählen Ebenen automatisch ausrichten auf der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs. Wählen Sie neu positionieren und klicken Sie auf OK.
   5. Wenn die Auto-Align-Algorithmus nicht den Rahmen zu einem relevanten Schwerpunkt zu orientieren, stellen kleinere Anpassungen mit dem Verschieben-Werkzeug.
2. Verbundschleif:
   HINWEIS: Out-of-Schwerpunktregionen eines anfänglichen Bild MP kann durch "Abschneiden" der entsprechende entfaltet Stack in LAS AF Software geschärft werden. Zuschneiden eines Stack-Datei ermöglicht es, den Abstand eines Z-Stapel, der dem Maximum Projektion-Algorithmus unterzogen wird manuell zu beschränken.
   1. Suchen Sie die Crop-Funktion in der Werkzeugleiste (unter der Registerkarte Prozess). Manuell begrenzen die ersten und letzten Schichten, so dass sie nur das Haftband im anfänglich außerhalb des Fokusbereichs zu überspannen. Klicken Sie auf Übernehmen, um einen neuen Stapel-Datei, die für diese Region optimiert ist zu generieren.
   2. Generieren Sie ein neues Maximum Projektion für die lokal optimierte Stack und Export als TIFF-Datei.
   3. In the Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), offene Scripts (in der Registerkarte Datei des Hauptmenüs befindet) und wählen Sie Dateien in Stapel laden.
   4. Importieren Sie die anfängliche Bild MP-Datei und vor Ort optimiert MP-Datei für einen bestimmten Zeitpunkt in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist.
   5. Wählen Sie beide Schichten in der Ebenen-Fensterbereich und wählen Sie Ebenen automatisch überblenden (in der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs befindet), um die entsprechenden Bereiche der beiden Bilder automatisch zu maskieren, wodurch eine gleichmäßig im Fokus der Netzhaut ein. Sichern Sie das Bild Verbund als TIFF-Datei.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 bis 5.2.5 für alle suboptimalen MP Bilder.
3. Weitere Einstellmöglichkeiten: drehen, zuschneiden und stellen Sie die Pegel der Film-Schichten:
   1. Mit all den Schichten gewählt, verwenden Sie das Transformieren-Werkzeug (Edit> Free Transform), um die Bilder zu drehen, so dass der dorsal-ventralen Achse der Netzhaut ist ausgerichtetzu der y-Achse des Films Rahmen.
   2. Verwenden Sie gegebenenfalls die Freistellungswerkzeug, um das Sichtfeld auf die gewünschte Größe und Form zu reduzieren.
   3. Verwenden Pegeleinstellung (von Einzelbildern), die zur Verbesserung Kontrast zwischen der Zellmembran und Zellkörper.
   4. Für stilistischen Zwecken und an spezifische Zellverhalten zu betonen, stellen Falschfarben zu Sehenswürdigkeiten in jedem Bild zu markieren.
4. Animation: Konvertieren Sie die Bilder in einen Film:
   1. Öffnen Sie das Animationsfenster aus dem Windows-Register des Hauptmenüs. Wählen Stellen Frames von Schichten aus dem Menü in der oberen rechten Ecke des Animationsbereich entfernt.
   2. Man beachte, dass die Schichten der Animationsfenster in sequentieller Reihenfolge, beginnend von der Unterseite des Stapels hinzugefügt. Um die Reihenfolge der Frames umgekehrt, zunächst alle Bilder auswählen und dann umge Frames aus dem Animationsfenster Menü.
   3. Wählen Sie eine Bildverzögerungszeit für jedes Bild mit Hilfe der Dropdown-Menü unten am Rahmen DaumenNagel.
      HINWEIS: Die Frame-Verzögerung für Filme 1 bis 4 in diesem Papier ist 0,8 Sekunden.
   4. Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Export und wählen Sie Video Render. Wählen Sie Quicktime-Export unter Dateioptionen und wählen Sie das gewünschte Videoformat. Unter Render Optionen eingestellt Frame Rate auf Benutzerdefiniert, geben Sie eine Bildrate von 15, und klicken Sie auf Render.

Ergebnisse

Live-Bildgebung des Puppen Auge ist eine erfolgreiche Strategie zur Zelle Verhaltensweisen, die Strukturierung der Neuroepithel beitragen beobachten. Die Rolle von spezifischen Proteinen kann leicht durch Expression von Transgenen, die während der Entwicklung des Auges Protein-Ebene ändern zu bewerten. Um dieses GMR-GAL4 tun wird zur Expression des Transgens hinter dem morphogenetischen Furche fahren. Dies bietet den Vorteil, nicht zu stören früheren Veranstaltungen, die das Auge Bereich in den ersten beide...

Diskussion

Die Beschreibung der Wildtyp-Entwicklung (siehe oben) ist die Basis für Vergleiche der Strukturierung Ereignisse in RNAi oder Überexpression Genotypen. Vergleiche von lebenden Gewebeentwicklung sind von unschätzbarem Wert, wenn genau zu bestimmen, welcher Zellverhalten werden durch ein Protein von Interesse reguliert. Weitere und hier nicht beschrieben, ermöglicht Live Cell Imaging eine qualitative und / oder quantitative Beschreibungen der Rolle eines Gens von Interesse in den Ereignissen, die Muster das Auge zu ma...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems