Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Резюме

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Аннотация

Врожденные процессы развития Drosophila куколки могут смещаться и искажать глаз эпителий способами, которые делают индивидуальное поведение клеток трудно отследить во время съемки живых клеток. Эти процессы включают в себя: сетчатки вращение, рост клеток и организменном движение. Кроме того, нарушения в топологии эпителия, в том числе тонких ударов и складки часто вводят в куколки получают для работы с изображениями, сделать это сложно приобрести в фокусе изображения более чем на несколько омматидиев в одном фокальной плоскости. Рабочий процесс описанный здесь исправляет эти вопросы, что позволяет легко анализировать клеточных процессов во время Drosophila развития куколки глаз. Соответственно, в постановке куколки расположены в буровой изображений, которые можно легко собрать в большинстве лабораторий убиквитин-ДЕ-кадгерин:. GFP и ГМР-GAL4 управляемом БАС-α-катенин: GFP используются для визуализации границ клеток в эпителии глаз ^{1 -3.} После деконволюцииприменяется для флуоресцентных изображений, снятых при нескольких фокальных плоскостях, максимальный выступ изображения создаются для каждого момента времени и улучшено с использованием редактирования изображений программное обеспечение. Выравнивание алгоритмы используются для быстрого стабилизации лишнего движения, что делает индивидуальное поведение клеток легче отслеживать.

Введение

Соединение дрозофилы глаз характеризуется стереотипной расположения его ~ 750 омматидиев разделенных сотовой решетки-вспомогательных пигментных клеток ^4,5. Эти пигментные клетки с рисунком с помощью согласованной комбинации событий: местных движений клеток, клеточного роста, изменение формы клеток и апоптоз. Живая визуализация этого эпителия позволяет изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий в физиологически необходимой и невозмущенной трехмерной контексте.

В отличие от предыдущих протоколов ^6,7, методика описано здесь, включает в себя эффективный способ стабилизации посторонние движение ткани, которая не может быть отсоединен от процесса формирования изображения. Этот способ повышает исследований поведения клеток в развивающемся Drosophila куколки глаз эпителия - ткани, который растет, вращается, и сдвиги в течение визуализации. Кроме того движение стабилизация техника деописано здесь, будет полезным для изучения клеток и в других контекстах, где происходит постороннее движение.

Для визуализации границ клеток сетчатки в области Drosophila, трансгенные линии мух, которые были получены выражения Ubi-ДЕ-кадгерин: GFP, а также UAS-α-катенин: GFP под контролем водителя глаз конкретного ГМР-GAL4 ^1-3. Использование двух GFP-меченый мембранных маркеров позволяет для визуализации границ клеток в нижней интенсивности света. Это сводит к минимуму повреждения тканей и фотообесцвечивание на повторном воздействии высоких энергий длин волн, позволяя увеличенную частоту кадров и продолжительности фильма. Для повышения эффективности RNAi трансгенов, UAS-DCR-2 также включены во второй летучей линии ^8.

В третьем обновления из предыдущих протоколов, простой визуализации буровой которые легко собран в большинстве лабораторий описано. Этот аппарат устраняет требование, чтобы иметь специализированный изображений RIG генерируется университета "механический цех" или подобный сервис. Это визуализации установка аналогична той, что используется в графических других куколок тканей ^9,10.

Представленные здесь простой протокол изображения живых клеток, которые могут быть использованы непосредственно оценить морфогенетические события, которые способствуют глаз паттерна от ~ 17 до 42 ч после образования пупария (HR НПФ). В частности, этот протокол позволяет определить последствия изменения экспрессии генов во время развития куколки.

протокол

Рисунок 3 показывает обзор экспериментальной процедуры.

1. Подготовка ткани

1. Чтобы определить последствия изменений экспрессии гена, настроить следующие крест в двух экземплярах и сохранить при 25 ° C: UAS-трансгенов (мужчины) X GMR-GAL4; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (Виргинские женщины) ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения контрольных сечениях ткани UAS-LacZ мужчин в GMR-GAL4; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP женщины. β-галактозидазы не создает никаких дефектов в поведении клеток в сетчатке.
2. Для повышения эффективности RNAi трансгенов, кросс UAS-РНК-интерференции мужчин в GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-кошка: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b девственные самки.
   Примечание: Иногда дефекты в поведении клеток в сетчатке, экспрессирующие наблюдались внематочной DCR-2 (данные не показаны). Бдительность рекомендуется при использовании этого подхода.
3. SИзбранный белый предварительно куколки соответствующих генотипов и место в 1,5 мл микропробирок. Если куколки выразить DCR-2, выберите мужского или женского пола куколок: выражение UAS-DCR-2, вставка на Х-хромосоме, сильнее мужчин. Куколки должны быть сексуально в 0 ч НПФ перед пигментации куколки случае - гонады самцов видны как крупных полупрозрачных глобусов на боковых сторонах куколки (примерно одна треть от задней).
4. Инкубируйте микроцентрифужных пробирки, содержащие куколки, в чистой пластиковой коробке наконечника при 25 ° С. Чтобы предотвратить высыхание куколок месте 10 см ² кусок ткани, смоченной в дистиллированной воде, в наконечник коробки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: если влажность в коробка Tip-Box становится слишком высокой куколки случае может стать сырым и трудно анализировать в последующих стадиях.
5. Инкубировать в течение соответствующего времени. Для захвата клеток поведения, связанные с рисунка глаз, подготовить куколки для работы с изображениями в пределах 17 ч НПФ, 20 ч НПФ или 24 ч APF. См Представитель Результаты для дальнейшего обсуждения о том, когда специфических клеточных поведения лучше всего наблюдается.
6. Место кусок свежего двухсторонней ленты на черном Sylgard рассечение блюдо. Установите куколки, спинной стороной вверх, с головой куколки, прикрепленной к двухсторонней ленты (рис 1А) .Try не придерживаться грудной и брюшной области куколки в двухсторонней ленты. С пинцетом осторожно поднимите и снимите крышечку, чтобы разоблачить куколки головой. Tear вдоль стороны куколки случае подвергать области вокруг одного глаза.
7. Аккуратно удалите куколки с клейкой лентой. Если куколка остается приверженцем, нанесите небольшой объем дистиллированной водой до перекрестка между куколки случае и ленты, чтобы ослабить адгезию.

2. Монтаж

1. Построить небольшой 15 мм ² кадр из промокательной бумаги и пробить дыру в middlethat 5,5 мм в диаметре (рис 1B). Погрузитесь в дистиллированной воде и поместите вцентр предметное стекло микроскопа. Использование 30 см шприц, выдавите равномерное кольцо вазелина, чтобы окружить промокательной бумаги кадр. Убедитесь, что вазелин кольцо незначительно выше, чем ширина куколки и что диаметр кольца незначительно меньше, чем ширина покровным стеклом.
2. Добавить маленькую каплю вазелина непосредственно на слайде, в отверстие, пробитое в промокательной бумаги (рис 1в) .Carefully организовать куколки, со своей стороны, при поддержке вазелином шарик (рис 1D).
3. Поместите покровное в верхней части вазелином кольца таким образом, что она контактирует с над глазом нейроэпителии (рис 1D) эпителия. Осторожно сжимать препарат для герметизации покровное против вазелина и генерировать небольшую плоскую контактную поверхность между областью куколки глаз и покровное.

3. флуоресценции изображений

1. Изображение куколки подготовку, используяфлуоресцентный микроскоп. Каждый 7 мин захвата серийные срезы через апикальную области глаз нейроэпителии, в области слипчивых соединений.
   ПРИМЕЧАНИЕ:) соответствующие серийные срезы, как правило, 4-5 в Z-стек, состоящий из 0,2 мкм Z-шагов. б) Нарушения в топологии эпителия, в том числе мягких ударов и складок, может сделать это сложно приобрести в фокусе изображения крупных регионов ткани. В то время как изображения, можно найти часть области интереса, чтобы быть в фокусе, а соседний регион, чтобы быть вне фокуса. В том числе небольшой капли дистиллированной воды между куколки глаз и покровное может устранить некоторые складки острые ткани, но не слегка неравномерной топологии характеристика ранних стадиях куколки морфогенеза глаз. В этих случаях дополнительной выборки ткани от продления Z-стек до фокусировки ломтики приобретены для всей области. в) Захват серийных срезов каждые 7 мин должно позволить жить-визуализацию для 3 до 4 ч без существенного Редуие интенсивности GFP флуоресценции, которые могут поставить под угрозу качество изображения. Более короткие временные интервалы могут уменьшить общее время визуализации.
2. Продолжить изображений от 3 до 4 часов. Не использовать автоматическую фокусировку и временную функцию, которая доступна на многих люминесцентных микроскопов с куколки рост и накачка гемолимфы перемещает положение сетчатки и бдительность переориентации требуется каждый 14-21 мин. Обратите внимание, что воображение более 4 часов может замедлить или остановится морфогенез глаз.
3. Используйте соответствующее программное обеспечение деконволюции для уменьшения фона и повышения контрастности разделе изображений сериала. Для каждого файла Z-стека, выполните следующие действия в программном обеспечении LAS AF (табл материалов) Перейдите к панели инструментов, выберите 3D Deconvolution и нажмите кнопку Применить.
4. Создание максимальный выступ (МП) образ для каждого разрешенный файл стека: Перейдите к панели инструментов, выберите 3D проекции и нажмите кнопку Применить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная проекционного алгоритма, может не порождать формуLY в фокусе изображение для тканей, которые были выборка. Техника для заточки вне фокуса регионов описано в пункте 5.2.

4. После визуализации куколки аварийно-спасательных и фенотипа Проверка

1. Для решения были ли введены артефакты или куколки пострадал во время съемки, аккуратно удалите куколки с изображения установки: с помощью щипцов снимите покровное и передать куколки в чистый сосуд пищи. Хранить при комнатной температуре или 25 ° C до взрослой мухи не возникает.
2. Внимательно изучите фенотип взрослого глаза и сравните глазах взрослых мух, выходящих из оригинального креста лету.

Обработка 5. Изображение

1. Автоматическое выравнивание изображения:
   ПРИМЕЧАНИЕ: живая Drosophila ткань будет смещаться и расти на протяжении всего процесса визуализации. Следовательно, центры изображений собрались в последовательных временных точках может не соответствовать той же точке в Drosophila ткани. В дополнение кВся сетчатки диск вращается около 30 ° между ~ 21 и 23 ч НПФ. Чтобы выделить индивидуальное поведение клеток и снизить отвлекаться, вызванные организменном роста, совместите каждый депутат image.While Это может быть выполнено вручную, программное обеспечение для редактирования изображений используется здесь (смотрите таблицу материалов) имеет встроенные алгоритмы, которые могут ускорить этот процесс.
   1. На вкладке Файл главного меню откройте Сценарии и выберите Загрузить файлы в стек.
   2. Импорт файлов изображений MP в панели Загрузка слоев и выберите OK. Убедитесь, что попытка автоматического выравнивания изображений для параметра Источник не выбран.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрана эта опция, программное обеспечение может использовать алгоритм выравнивания, которая искажает данные изображения.
   3. После того, как все файлы MP загружен в панели Layers, чтобы убедиться, что все изображения расположены в хронологическом порядке, так что ранняя точка времени в верхней части стека слоев. Если слои не в правильном порядке, перетащите их, пока они не упорядоченыправильно.
   4. Выберите Auto-Align Layers на закладке Edit главного меню. Выберите репозиция и нажмите кнопку ОК.
   5. Если алгоритм Автоматическое выравнивание не удается ориентировать кадров в соответствующей фокальной точки, внести незначительные коррективы с помощью инструмента Move.
2. Композитный Заточка:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Out-Of-фокус регионы начальной MP изображение может быть заточена под «обрезки», соответствующий деконволюции стека в программе LAS AF. Обрезка файл стека позволяет вручную ограничить интервал Z-стека, который подвергается к максимальному проекционного алгоритма.
   1. Найдите функцию Crop на панели инструментов (на вкладке Process). Вручную ограничить начальные и конечные дольки, так что они охватывают только адгезию ленты в регионе изначально из фокуса. Нажмите кнопку Применить, чтобы создать новый файл стека, который оптимизирован для этого региона.
   2. Создайте новый максимальный выступ для локально оптимизированный стек и экспорта в виде файла TIFF.
   3. В гое программы редактирования изображений (табл материалов), открытые Сценарии (находится в вкладке Файл главного меню) и выберите Загрузить файлы в стек.
   4. Импорт исходного файла MP изображения и локально оптимизированный файл MP для конкретного момента времени в панели Загрузка слоев и выберите OK. Убедитесь, что попытка автоматического выравнивания изображений для параметра Источник не выбран.
   5. Выберите оба слоя в слоях панели, а затем выберите Auto-Blend Layers (находится на вкладке Правка основного меню), чтобы автоматически маскировать соответствующие области двух изображений, уступая равномерно в фокусе поля сетчатки. Сохранить составное изображение в виде файла TIFF.
   6. Повторите шаги 5.2.1 через 5.2.5 для всех неоптимальных изображений депутат.
3. Дальнейшие корректировки: Поворот, кадрирование, и отрегулируйте уровни слоев фильм:
   1. Со всеми слоями выбран, используйте Transform Tool (Edit> Free Transform), чтобы повернуть изображения так, чтобы спинной-вентральной оси сетчатки выравниваетсяк оси у кадра кинофильма.
   2. Если необходимо, используйте инструмент Crop, чтобы уменьшить поле зрения до нужного размера и формы.
   3. Используйте регулировку уровня (отдельных кадров), чтобы помочь повысить контраст между клеточной мембраной и телом клетки.
   4. Для стилистических целей и подчеркнуть определенные клеточные поведения, ввести в ложном, чтобы выделить пункты, представляющие интерес в каждом кадре.
4. Анимация: Преобразование изображений в кино:
   1. Откройте Анимация панель на вкладке окна главного меню. Выберите Сделать кадры из слоев из меню, расположенном в верхнем правом углу анимации панели.
   2. Следует отметить, что слои будут добавлены в анимации панели в последовательном порядке, начиная с нижней части стопки. Чтобы изменить порядок кадров, сначала выберите все кадры, а затем выберите Frames Обратный из меню Animation панели.
   3. Выберите время задержки кадра для каждого кадра с помощью под рамой пальца выпадающее менюногтей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: задержка кадров Фильмы от 1 до 4, представленной в этой статье составляет 0,8 сек.
   4. На вкладке Файл главного меню откройте Экспорт и выберите Просмотреть видео. Выберите Экспорт QuickTime в разделе Параметры файла и выберите нужный формат видео. Под Рендер Параметры, заданные частоту кадров обычаю, введите частоту кадров 15, и нажмите Render.

Результаты

Live-визуализация куколки глаза успешная стратегия для наблюдения клеток поведения, которые способствуют нанесению нейроэпителия. Роль специфических белков может быть легко оценена путем экспрессии трансгенов, которые изменяют уровни белка в процессе разработки глаз. Для этого GMR-GAL...

Обсуждение

Описание разработки дикого типа (выше) образует основу для сравнения паттерна событий в РНК-интерференции или избыточной экспрессии генотипов. Сравнение развития живой ткани имеют неоценимое значение при определении, какие именно клеточные поведения регулируются белка. Кроме того, и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems