Live-imagerie de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nymphe yeux

Résumé

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Résumé

Processus inhérents à la nymphose Drosophila peuvent changer et de fausser l'épithélium de l'oeil de manière à rendre le comportement de cellules individuelles difficiles à suivre lors de l'imagerie de cellules vivantes. Ces procédés comprennent: la rotation de la rétine, la croissance cellulaire et le mouvement organismal. En outre, des irrégularités dans la topologie de l'épithélium, y compris bosses subtiles et se replie souvent présentés comme la nymphe est préparé pour l'imagerie, font qu'il est difficile d'acquérir des images de mise au point de plus que quelques ommatidies dans un plan focal unique. Le workflow décrit ici remédie à ces questions, ce qui permet une analyse facile de processus cellulaires au cours du développement des pupes des yeux drosophile. Nymphes appropriée à étages sont disposés dans un appareil de formation d'image qui peut être facilement assemblé dans la plupart des laboratoires Ubiquitin-DE-Cadhérine. GFP et GMR-GAL4 axées sur l UAS-α-caténine: GFP sont utilisés pour visualiser les limites des cellules dans l'épithélium oculaire ^{1 -3.} Après déconvolution estappliqué aux images fluorescentes capturées à plusieurs plans focaux, images maximales de projection sont générés pour chaque point de temps et améliorées en utilisant un logiciel de retouche d'image. Algorithmes d'alignement sont utilisés pour stabiliser rapidement le mouvement superflu, qui rend le comportement de cellules individuelles plus facile à suivre.

Introduction

Le composé de Drosophila yeux est caractérisée par la disposition de ses stéréotypé ~ 750 ommatidia séparés par un treillis en nid d'abeilles de cellules de pigment accessoire ^4,5. Ces cellules pigmentaires sont modelés par une combinaison coordonnée d'événements: les mouvements de cellules locales, la croissance cellulaire, les changements dans la forme des cellules et l'apoptose. La visualisation en direct de cet épithélium permet d'étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces événements dans un contexte tridimensionnel physiologiquement pertinente et imperturbable.

Contrairement aux protocoles précédents ^6,7, la technique décrite ici comprend un procédé efficace pour la stabilisation de mouvement de tissu étranger qui ne peut pas être désaccouplé du processus d'imagerie. Cette méthode améliore les études de comportement des cellules dans le développement de la drosophile épithélium pupe des yeux - un tissu qui se développe, tourne, et les changements au cours de l'imagerie. En outre, la technique de mouvement de stabilisationdécrit ici sera utile pour l'étude des cellules dans d'autres contextes où le mouvement se produit étrangère.

Pour visualiser les limites des cellules de la rétine dans le domaine de la drosophile, mouche lignes transgéniques ont été générés qui expriment ubi-DE-Cadherin: GFP ainsi que UAS-α-caténine: GFP sous le contrôle du pilote spécifique de l'oeil GMR-GAL4 ^3.1. L'utilisation de deux marqueurs membranaires GFP étiqueté permet la visualisation des limites des cellules à la lumière d'intensité plus faible. Cela minimise les dommages des tissus et photoblanchiment sur l'exposition répétée à des longueurs d'onde de haute énergie, permettant taux de trame augmenté et la durée du film. Pour améliorer l'efficacité de transgènes ARNi, UAS-DCR-2 a également été incorporé dans une deuxième ligne de mouche ^8.

Dans une troisième mise à jour de protocoles précédents, une plate-forme d'imagerie simple qui est facile à assembler dans la plupart des laboratoires est décrite. Cet appareil permet d'éviter l'obligation d'avoir une imagerie spécialisée rig généré par 'la boutique de machine »d'une université ou d'un service similaire. Cette plate-forme d'imagerie est similaire à celle utilisée pour l'image d'autres tissus pupes ^9,10.

Présenté ici est un protocole simple d'imagerie des cellules vivantes qui peut être utilisé pour évaluer directement les événements morphogénétiques qui contribuent à la structuration de l'œil de ~ 17 à 42 h après la formation du puparium (h APF). Plus précisément, ce protocole permet de déterminer les conséquences de la modification de l'expression des gènes au cours du développement de chrysalide.

Protocole

La figure 3 montre un résumé de la procédure expérimentale.

1. Préparation des tissus

1. Pour déterminer les conséquences de l'expression modifiée d'un gène d'intérêt, mis en place la croix suivante en double exemplaire et de maintenir à 25 ° C: UAS-transgéniques (mâles) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (Les femelles vierges) NOTE: Pour obtenir contrôle croix de tissu UAS-lacZ mâles à GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: femelles GFP. β-galactosidase génère pas de défauts dans le comportement des cellules dans la rétine.
2. Pour améliorer l'efficacité de transgènes ARNi, croix UAS-ARNi mâles à GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b femelles vierges.
   REMARQUE: défauts occasionnels dans le comportement des cellules dans la rétine exprimant ectopique DCR-2 ont été observées (données non présentées). Vigilance est recommandé si vous utilisez cette approche.
3. Sélus blanc pré-pupes de génotypes appropriés et dans 1,5 ml microtubes. Si les nymphes exprimer DCR-2, sélectionnez pupes soit mâle ou femelle: expression de SAMU-DCR-2, un insert sur ​​le chromosome X, est plus forte chez les hommes. Pupes devrait être sexué à 0 h APF avant la pigmentation de la coque de nymphose - les gonades mâles sont visibles grands globes translucides sur les côtés latéraux de la pupe (environ un tiers de la partie postérieure).
4. Incuber microtubes contenant les nymphes, dans une boîte de pointe de plastique propre à 25 ° C. Pour éviter le dessèchement des pupes place un 10 cm ² morceau de tissu, imbibé d'eau distillée, dans la boîte de pointe.
   REMARQUE: si l'humidité dans la boîte de pointe devient trop élevée, la coque de nymphose peut devenir détrempé et difficile à disséquer dans les étapes ultérieures.
5. Incuber pendant le temps approprié. Pour capturer les comportements cellulaires associés à modeler l'œil, préparer pupes pour l'imagerie à environ 17 h APF, 20 h ou 24 h APF APF. Voir résultats représentatifs pour la discussion sur le moment où les comportements de cellules spécifiques sont mieux observées.
6. Placez un morceau de ruban adhésif double face douce sur un plat de dissection Sylgard noir. Placer un côté nymphe, dorsale en place, avec la tête de la pupe adhéré au ruban adhésif double face (figure 1A) .Essayez ne pas adhérer thoraciques et abdominaux régions de la nymphe à l'adhésif double face. Avec des pinces soulevez délicatement et retirer l'opercule pour exposer la tête de chrysalide. Déchirez le long du côté de la coque de nymphose pour exposer la zone autour de l'œil.
7. Retirez délicatement la nymphe du ruban adhésif. Si la nymphe reste adhérente, appliquer un petit volume d'eau distillée à la jonction entre la coque de nymphose et la bande à affaiblir l'adhérence.

2. Montage

1. Construire un petit 15 mm ² trame du papier buvard et percer un trou dans le middlethat est de 5,5 mm de diamètre (figure 1B). Plongez dans l'eau distillée et placer dansle centre d'une lame de microscope. En utilisant une seringue de 30 cc, presser un anneau uniforme de la gelée de pétrole pour entourer le cadre de papier buvard. Assurez-vous que la bague de gelée de pétrole est légèrement supérieure à la largeur de la nymphe et que le diamètre de l'anneau est légèrement inférieure à la largeur d'une lamelle.
2. Ajouter une petite perle de gelée de pétrole directement sur ​​la diapositive, dans le trou percé dans le papier buvard (figure 1C) .Carefully organiser la pupe, de son côté, soutenu par le cordon de la gelée de pétrole (figure 1D).
3. Déposer une lamelle couvre-objet au-dessus de la bague de gelée de pétrole afin qu'il entre en contact au-dessus de l'épithélium de la neuro-épithélium oculaire (figure 1D). Comprimer doucement la préparation pour sceller la lamelle contre la gelée de pétrole et de générer une petite surface de contact à plat entre la région des yeux pupe et la lamelle.

3. Fluorescence Imaging

1. Image de la préparation de chrysalide en utilisant unmicroscope à fluorescence. Chaque 7 min capture des coupes en série par l'intermédiaire du domaine de la neuro-épithélium apical des yeux, dans la région des jonctions adhérentes.
   REMARQUE: a) les articles de série appropriés sont généralement 4-5 par z-pile composé de 0,2 um z-étapes. b) Irrégularités dans la topologie de l'épithélium, y compris des bosses et des plis légers, peuvent rendre difficile d'acquérir des images de mise au point des grandes régions de tissu. Alors que l'imagerie, on peut trouver le cadre d'une zone d'intérêt d'être mise au point, et une région voisine d'être out-of-focus. Y compris une petite goutte d'eau distillée entre l'œil et la pupe lamelle peut éliminer certains plis de tissus aigus mais pas la topologie caractéristique légèrement inégale des premières étapes de la morphogenèse des yeux chrysalide. Dans ces cas-échantillonner le tissu en étendant le z-pile de mise au point jusqu'à ce que les tranches sont acquis pour l'ensemble du domaine. c) Capture coupes en série tous les 7 min devrait permettre live-imagerie pour 3-4 heures sans un redu importantsction de l'intensité de fluorescence de GFP qui peuvent compromettre la qualité de l'image. Courts intervalles de temps peuvent réduire la durée totale de l'imagerie.
2. Continuer imagerie pour 3-4 heures. Ne utilisez pas de mise au point automatique et la fonction de temps qui est disponible sur de nombreux microscopes à fluorescence, puisque la croissance des pupes et le pompage de l'hémolymphe déplace la position de la rétine et vigilante recentrage est nécessaire tous les 14 à 21 min. NOTE que l'imagerie delà de 4 heures peut ralentir ou bloquer la morphogenèse de l'œil.
3. Utilisez un logiciel de déconvolution appropriée pour réduire fond et d'améliorer le contraste des images de section de série. Pour chaque fichier z-pile, procédez comme suit dans le logiciel LAS AF (voir tableau des matériaux): Allez dans le panneau Outils, sélectionnez 3D Déconvolution et cliquez sur Appliquer.
4. Générer une image projection maximale (MP) pour chaque fichier de pile déconvolué: Allez dans le panneau Outils, sélectionnez Projection 3D et cliquez sur Appliquer.
   NOTE: L'algorithme de projection maximale peut échouer à générer un uniformely image focalisée de tissu qui a été échantillonné. Une technique pour l'affûtage des régions hors-focus est décrite dans l'étape 5.2.

4. Post-imagerie nymphe de sauvetage et de vérification phénotype

1. Pour examiner si des artefacts ont été introduits ou la pupe lésés lors de l'imagerie, retirer délicatement la nymphe de la plate-forme d'imagerie: l'aide de pinces supprimer la lamelle et de transférer la nymphe dans un flacon propre de la nourriture. Entreposer à la température ambiante ou 25 ° C jusqu'à ce que la mouche adulte émerge.
2. Examiner attentivement le phénotype de l'œil adulte et comparez les yeux de mouches adultes émergents de la croix de mouche d'origine.

5. Traitement d'image

1. Alignement automatique de l'image:
   NOTE: Le tissu vivant Drosophila se déplacera et se développer tout au long du processus d'imagerie. Par conséquent, les centres d'images recueillies à des moments successifs peuvent ne pas correspondre au même point dans le tissu drosophile. En outre, ledisque entier rétinienne tourne environ 30 ° entre ~ 21 et 23 h APF. Pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance organismal, aligner chaque image.While MP cela peut être effectué manuellement, le logiciel de retouche d'image utilisée ici (voir le tableau des matériaux) a algorithmes intégrés qui peuvent accélérer le processus.
   1. De l'onglet Fichier du menu principal, Scripts ouvertes et sélectionnez Fichiers de charge dans la pile.
   2. Importez les fichiers d'image MP dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l'option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée.
      NOTE: Si cette option est sélectionnée, le logiciel peut utiliser un algorithme d'alignement qui fausse les données d'image.
   3. Une fois tous les fichiers MP ont chargé dans le panneau Calques, assurez-vous que toutes les images sont dans l'ordre chronologique de telle sorte que le point de temps plus tôt est au sommet de la pile de couches. Si les couches ne sont pas dans le bon ordre, faites glisser et déposez-les jusqu'à ce qu'ils soient commandéscorrectement.
   4. Sélectionnez Alignement automatique des calques dans l'onglet Modifier du menu principal. Choisissez Repositionner et cliquez sur OK.
   5. Si l'algorithme Auto-Align ne parvient pas à orienter les cadres à un point focal pertinent, faire des ajustements mineurs à l'aide de l'outil Déplacer.
2. Affûtage Composite:
   REMARQUE: les régions hors de mise au point d'une image initiale de MP peuvent être affûtées par «culture» de la pile déconvolué correspondant dans le logiciel LAS AF. Rognage d'un fichier de pile permet de restreindre manuellement l'intervalle d'une pile-z qui est soumise à l'algorithme de projection maximum.
   1. Recherchez la fonction de la culture dans le panneau Outils (sous l'onglet Processus). Restreindre manuellement les tranches initiales et finales de telle sorte qu'ils se étendent seulement la courroie d'adhérence dans la région initialement hors-foyer. Cliquez sur Appliquer pour générer un nouveau fichier de pile qui est optimisé pour cette région.
   2. Générer une nouvelle projection maximale de la pile optimisé localement et l'exportation sous forme de fichier TIFF.
   3. En ee logiciel de retouche d'image (voir le tableau des matériaux), des scripts ouverts (située dans l'onglet Fichier du menu principal) et sélectionnez Charger des fichiers dans la pile.
   4. Importez le fichier d'image de député initiale et fichier MP optimisée localement pour un point de temps particulier dans le panneau Calques de charge et sélectionnez OK. Assurez-vous que la tentative l'option Source Images à aligner automatiquement ne est pas sélectionnée.
   5. Sélectionnez les deux couches dans les couches volet puis choisissez Fusion automatique des calques (situé dans l'onglet Modifier du menu principal) pour masquer automatiquement les régions appropriées des deux images, ce qui donne un uniforme de mise au point de la rétine domaine. Enregistrer l'image composite d'un fichier TIFF.
   6. Répétez les étapes 5.2.1 à travers 5.2.5 pour toutes les images MP sous-optimales.
3. Corrections supplémentaires: rotation, recadrage, et ajustez les niveaux des couches film:
   1. Avec toutes les couches sélectionné, utilisez l'outil Transformation (Edition> Transformation) pour faire pivoter les images de sorte que l'axe dorso-ventrale de la rétine est alignéà l'axe Y du cadre du film.
   2. Si nécessaire, utilisez l'outil Recadrage de réduire le champ de vision d'une taille et la forme souhaitées.
   3. Utilisation ajustement de niveau (de trames individuelles) pour aider à améliorer le contraste entre la membrane cellulaire et le corps de la cellule.
   4. Pour des raisons de style et de souligner les comportements de cellules spécifiques, introduire des fausses couleurs pour souligner les points d'intérêt dans chaque trame.
4. Animation: convertir les images dans un film:
   1. Ouvrez le volet de l'animation dans l'onglet Windows du menu principal. Sélectionnez faire des cadres à partir de couches dans le menu situé dans le coin supérieur droit de la fenêtre d'animation.
   2. On notera que les couches sont ajoutés à la sous-fenêtre d'animation dans un ordre séquentiel en commençant par le bas de la pile. Pour inverser l'ordre des images, sélectionnez d'abord tous les cadres et sélectionnez Inverser les images dans le menu Animation volet-là.
   3. Sélectionnez un temps de retard de trame pour chaque trame en utilisant le menu déroulant ci-dessous le cadre pouceongle.
      NOTE: Le retard de trame pour Films 1-4 présentée dans cet article est de 0,8 sec.
   4. De l'onglet Fichier du menu principal, ouvert Exporter et sélectionnez Rendu vidéo. Choisissez exportation QuickTime sous Options de fichier et sélectionnez un format vidéo de votre choix. Sous Options de rendu mis Frame Rate Personnalisé, entrez un taux de 15 de trame, et cliquez sur Rendu.

Résultats

Live-imagerie de l'oeil pupe est une stratégie efficace pour observer les comportements de cellules qui contribuent à la structuration de la neuroépithélium. Le rôle des protéines spécifiques peut être aisément évaluée par expression de transgènes qui modifient les taux de protéines au cours du développement de l'œil. Pour ce faire, GMR-GAL4 est utilisé pour diriger l'expression du transgène derrière le sillon morphogénétique. Ceci offre l'avantage de ne pas perturber les év...

Discussion

La description du développement de type sauvage (ci-dessus) constitue la base pour les comparaisons d'événements de structuration dans ARNi ou des génotypes de surexpression. Les comparaisons de développement direct de tissu sont très précieux pour déterminer précisément quels comportements cellulaires sont réglementés par une protéine d'intérêt. En outre, et non décrit ici, imagerie des cellules vivantes permet de faire une des descriptions qualitatives et / ou quantitatives sur le rôle d'u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems