のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

要約

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

要約

ショウジョウバエの蛹の開発の固有のプロセスがシフトし、生細胞イメージングの間に追跡する個々の細胞の挙動を困難にする方法で、眼の上皮を歪めることができます。これらのプロセスとしては、網膜回転、細胞増殖と生物の動きを。蛹は、それが困難な単一の焦点面で数個眼以上の焦点の合った画像を取得するために行う、画像化のために準備されるように加え、微妙なバンプとを含む上皮のトポロジにおける不規則性はしばしば導入襞。ワークフローは、ここにショウジョウバエの蛹の眼の開発中に細胞プロセスの容易な分析を可能に救済こ ​​れらの問題を、説明した。適切ステージ蛹を簡単にほとんどの研究室で組み立てることができる撮像リグに配置されているユビキチンDEカドヘリン：GFPとGMR-GAL4駆動型UAS-αカテニン：GFPを眼の上皮¹のセル境界を視覚化するために使用されている^-3。デコンボリューションは、された後複数の焦点面において捕捉蛍光画像に適用し、最大値投影画像は、各時点で生成され、画像編集ソフトウェアを使用して強化される。アラインメントアルゴリズムを迅速に追跡するために、個々の細胞の挙動が容易になり、余分な動きを安定化させるために使用される。

概要

化合物ショウジョウバエの眼は、アクセサリ色素細胞^4,5のハニカム格子で区切り、その〜750個眼のステレオタイプの配置によって特徴づけられる。ローカル細胞運動、細胞増殖、細胞形状の変化、及びアポ​​トーシスこれらの色素細胞は、イベントの協調組み合わせによってパターニングされる。この上皮のライブ可視化は1つが生理学的に関連し、非摂動3次元コンテキストでこれらのイベントを支える分子機構を研究することができます。

以前のプロトコル^6,7とは対照的に、ここで説明する技術は、イメージングプロセスから分離することができない無関係な組織の動きを安定化するための効率的な方法を組み込んでいる。 、成長回転し、画像化の過程でシフト組織-このメソッドは、開発ショウジョウバエの蛹のアイ上皮における細胞の挙動の研究を強化する。加えて、動き安定化技術デここにスクライブ余分な動きが発生した他のコンテキストで細胞を研究するために有用であろう。

アイ固有のドライバGMR-GAL4 ^1-3の制御下にGFP：GFPなどUAS-αカテニン：シ ​​ョウジョウバエ網膜のフィールドにセル境界を視覚化するために、トランスジェニックハエラインはUBI-DEカドヘリン発現する生成した。 2 GFPタグ付きの膜マーカーの使用は、より低い強度の光でセル境界の視覚化を可能にする。これは、組織の損傷を最小限に抑え、高エネルギー波長に繰り返し暴露に退色増加フレームレート、動画継続を可能にする。 RNAiの導入遺伝子の有効性を高めるために、UAS-DCR-2は、第2フライライン⁸に組み込まれた。

以前のプロトコルから第三の更新では、簡単にほとんどの実験室で組み立てられた単純なイメージングリグについて説明する。この装置は、特殊なイメージングrを持つ必要性をなくす大学の「機械工場 'または類似のサービスによって生成されたIG。この結像リグ画像他蛹組織^9,10に用いられるものと同様である。

ここで提示直接蛹殻形成（時間APF）後〜17から42時間の眼のパターニングに寄与形態形成事象を評価するために使用できる単純な生細胞イメージングプロトコルである。具体的には、このプロトコルは、蛹の開発中に遺伝子発現を改変する結果を決定するために、1つを可能にする。

プロトコル

図3は、実験手順の概要を示しています。

1.組織調製

1. 目的の遺伝子の改変された表現の結果を判断するには、重複して、次のクロスを設定し、25℃で維持する：UAS-導入遺伝子 （オス）X GMR-GAL4。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b（処女雌）注：コントロール組織のクロスUAS-lacZをを得るためには、GMR-GAL4に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP女性 。 βガラクトシダーゼは、網膜内の細胞の挙動に欠陥を発生しない。
2. RNAiの導入遺伝子の有効性を強化するために、クロスUAS-RNAiは、GMR-GAL4、UAS-DCR-2に雄。 UAS-α-CAT：GFP、UBI-DE-CAD：GFP。 + / SM5-TM6b処女雌。
   注：異所性DCR-2を発現する網膜における細胞挙動の臨時欠陥が（データは示さない）が観察されている。警戒は、このアプローチを使用している場合をお勧めします。
3. S1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内の適切な遺伝子型と場所の白の前蛹を選出。蛹はDCR-2を発現する、男性または女性のどちらか蛹を選択した場合：UAS-DCR-2、X染色体上の挿入体の発現が、 ​​男性では強い。蛹は蛹のケースの色素沈着の前に0時間APFで性欲べきである - 男性の生殖腺は、蛹（後部から約3分の1）の側面に大きな透明地球儀として表示されます。
4. 25℃で清潔なプラス​​チックチップ-BOXに、蛹を含むマイクロ遠心チューブをインキュベートします。先端-ボックスに、蒸留水に浸した組織の10cm ²のピース、蛹場所の乾燥を防ぐために。
   注：チップインボックス内の湿度が高くなりすぎると蛹の場合は、後の工程で解剖することがねっとりと困難になることがある。
5. 適切な時間インキュベートする。目のパターニングに関連する細胞の挙動を取り込むには、約17時間のAPF、20時間のAPFまたは24時間のAPでイメージング用の蛹を準備F.は、特定の細胞の挙動を最もよく観測された場合にさらなる議論のための代表的な結果を参照してください。
6. 黒シルガードの解剖皿に新鮮な両面テープの一部を置きます。両面テープ（ 図1A）に付着した蛹の頭を持つ位置蛹、背側まで、.Try両面テープに蛹の胸部と腹部領域を接着するためではない。ピンセットで慎重に持ち上げて、蛹の頭部を露出させるために蓋を取り外します。片方の目の周りの領域を露出させるために蛹のケースの側面に沿って裂ける。
7. 静かに粘着テープから蛹を削除します。蛹が付着したままの場合は、接着力を弱めるために蛹のケースとテープの間の接合部に、少量の蒸留水を適用します。

2.実装

1. 吸い取り紙から小さな15ミリメートル²フレームを構築し、middlethatで穴を開け、直径5.5ミリメートル（ 図1B）がある。蒸留水に浸し、中に配置します顕微鏡スライドの中心。 30ccのシリンジを使用して、吸い取り紙のフレームを取り囲むようにワセリンの均一なリングを絞り出す。ワセリンリングは蛹の幅よりもわずかに高く、リングの直径は、カバースリップの幅よりわずかに小さいことをことを確認してください。
2. スライド上に直接ワセリンの小さなビーズを追加し、穴に.Carefully石油ゼリービーズ（ 図1D）でサポートされて、その側面に、さなぎを手配吸い取り紙（ 図1C）に打ち抜い。
3. ワセリンリングの上にカバースリップを置きに接触眼の神経上皮（ 図1D）上記上皮ようにします。穏やかワセリンに対するカバースリップを密封し蛹目領域とカバーガラスとの間の小さな平坦な接触面を生成するための準備を圧縮する。

3.蛍光イメージング

1. 画像使い蛹準備を蛍光顕微鏡。すべての7分接着結合の領域で、眼の神経上皮の頂端ドメインを介して連続切片をキャプチャします。
   注：A）適切なシリアルのセクションでは、通常、0.2μmのZ-のステップで構成さzスタックあたり4-5である。 b）は、軽度の衝撃や折り目を含む上皮のトポロジーにおける不規則性、組織の大きな領域の焦点の合った画像を取得することが困難なことがあります。画像化しながら、一合焦であると関心領域の一部を見つけることが、隣接領域がピンボケすること。蛹の目とカバーガラスの間に蒸留水の小液滴を含めると、いくつかの急性組織襞ではなく、蛹の眼の形態形成の初期段階の穏やかに不均一なトポロジー特性を排除することができます。これらの例では合焦スライスフィールド全体について取得されるまで、zスタックを拡張することによって、組織をオーバーサンプリングする。 C）連続切片ごとに7分のキャプチャ重要なのReduずに3から4時間のライブイメージングを有効にする必要があります画像品質を損なう可能性GFPの蛍光強度のction。短い時間間隔で画像化の合計時間を減少させることができる。
2. 3から4時間イメージングを続行します。蛹の成長と血リンパのポンプが網膜との位置を移動させるので、多くの蛍光顕微鏡で提供されていますオートフォーカスと時間関数を使用しないでください警戒再焦点ごとに14-21分を必要としている。 4時間を超えたことイメージングが遅くなったり、目の形態形成を停止することがあります。
3. バックグラウンドを低減し、連続切片の画像のコントラストを向上させるために適切なデコンボリューションソフトウェアを使用する。各zスタックファイルの場合は、（材料の表を参照）LAS AFソフトウェアで次の手順を実行します。ツールパネルに移動し、3Dデコンボリューションを選択し、[適用]をクリックします。
4. 各デコンボリューションスタック·ファイルの最大投影（MP）イメージの生成：ツールパネルに移動し、3D投影]を選択し、[適用]をクリックします。
   注：最大投影アルゴリズムは、均一の生成に失敗することがありますオーバーサンプリングされた組織のためのLY焦点画像。焦点外の領域を鮮鋭化するための技術は、ステップ5.2に概説されている。

4.ポスト·イメージング蛹レスキューと表現型の検証

1. アーティファクトが導入または蛹は、撮影時に傷つけられたかどうかを検討するために、慎重にイメージング·リグから蛹​​を削除します。使用して鉗子は、カバースリップを削除し、食品のきれいなバイアルに蛹を転送する。室温または25℃で保存大人のハエが出現するまで。
2. 慎重に大人の目の表現型を調べ、元のフライのクロスから出てくる大人のハエの目と比較する。

5.画像処理

1. 自動画像調整：
   注：ライブショウジョウバエ組織が ​​シフトし、画像化プロセスを通して成長します。したがって、画像の中心は、ショウジョウバエ組織内の同じポイントに対応しないことが連続した時間点で収集した。加えて全体網膜ディスクは、〜21と23時間APFとの間で約30°回転します。個々の細胞の挙動を強調表示して生物成長による注意散漫を低減し、これを手動で実行することができ、各MP image.While、ここで使用される画像編集ソフトウェアを整列するプロセスを促進することができ、組み込みのアルゴリズムた（ 材料の表を参照のこと）。
   1. スタックにメインメニュー、オープンスクリプトおよびロード]を選択ファイルのファイルタブから。
   2. ロードレイヤーパネルにMPイメージファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。
      注：このオプションを選択した場合、ソフトウェアは、画像データを歪めるアラインメントアルゴリズムを使用してもよい。
   3. すべてのMPファイルはレイヤーペインにロードされた後は、全ての画像が最も早い時点は、層スタックの一番上になるように、時系列順になっていることを確認してください。層が正しい順序になっていない場合、それらが順序付けされるまで、それらをドラッグアンドドロップ正しく。
   4. メインメニューの[編集]タブから自動整列レイヤーを選択します。再配置を選択し、[OK]をクリックします。
   5. 自動位置合わせアルゴリズムは、関連する焦点にフレームを配向させるために失敗した場合は、移動ツールを使用してマイナーな調整を行う。
2. コンポジットシャープ：
   注：初期MPイメージのピンボケの領域は「トリミング」LAS AFソフトウェアで対応するデコンボリューションスタックによって先鋭化することができます。スタックファイルをトリミングすると、1が手動で最大投影アルゴリズムに供されるzスタックの間隔を制限することができます。
   1. （[プロセス]タブの下）ツールパネルのクロップ機能を探します。手動で彼らが最初に焦点外の領域内にのみ接着ベルトにまたがるように最初と最後のスライスを制限する。この地域のために最適化された新しいスタックファイルを生成するために、[適用]をクリックします。
   2. TIFFファイルとしてローカルに最適化されたスタックと輸出のための新しい最大投影を生成します。
   3. 目で電子画像編集ソフトウェア（材料の表を参照）、スタックに（メインメニューの[ファイル]タブにあります）を開いているスクリプトとロード]を選択ファイル。
   4. ロードレイヤーパネルに特定の時点の初期MPイメージファイルと、ローカルに最適化されたMPファイルをインポートし、[OK]を選択します。自動的にソースイメージのオプションを整列させるためにしようとしましたが選択されていないことを確認してください。
   5. ペイン層内の両方の層を選択して、均一に網膜のフィールドを、合焦得自動的に二つの画像の適切な領域をマスクする（メインメニューの[編集]タブにあります）オートブレンドレイヤーを選択します。 TIFFファイルとしてこの合成画像を保存します。
   6. 繰り返しますが、すべての次善のMP画像について5.2.5を通じて5.2.1繰り返します。
3. さらに調整：回転、トリミング、ムービーレイヤーのレベルを調整します。
   1. すべてのレイヤー選択した状態で、網膜の背腹軸が揃うように、画像を回転させるように変形ツール（編集>自由変形）を使用しますムービーフレームのy軸に。
   2. 必要であれば、所望のサイズおよび形状に視野を減らすために切り抜きツールを使用。
   3. 細胞膜と細胞体の間のコントラストを強化するために（個々のフレームの）レベル調整を使用してください。
   4. 文体の目的のために、各フレームにおける関心の点を強調するために偽色を紹介し、特定の細胞の挙動を強調する。
4. アニメーション：映画に画像を変換する：
   1. メインメニューの、Windowsのタブからアニメーションのペインを開きます。アニメーション枠の右上隅にあるメニューからレイヤーからフレームを作成]を選択。
   2. 層は、スタックの底から始まる順番にアニメーション枠に追加されることに注意してください。フレームの順序を逆にするには、最初のフレームをすべて選択して、アニメーション枠メニューからリバースフレームを選択。
   3. フレーム親指の下にドロップダウンメニューを使用して、各フレームのフレーム遅延時間を選択ネイル。
      注：本稿の4映画1フレーム遅延は0.8秒である。
   4. メインメニュー、オープン輸出の[ファイル]タブからとビデオをレンダリングを選択します。ファイルオプションの下QuickTime書き出しを選択し、目的のビデオ形式を選択します。カスタムフレームレート設定レンダリングオプション]で、15のフレームレートを入力して、レンダリングをクリックします。

結果

蛹の目のライブイメージングは​​、神経上皮のパターニングに貢献する細胞の挙動を観察する成功した戦略である。特定のタンパク質の役割は、容易に眼の開発中のタンパク質レベルを変更する導入遺伝子を発現することによって評価することができる。このGMR-GAL4を行うために形態形成溝の背後に導入遺伝子発現を駆動するために使用される。これは最初の2幼虫齢の間、目のフィ?...

ディスカッション

野生型開発（上記）の説明は、RNAiパターニングイベントまたは過剰発現遺伝子型の比較のための基礎を形成する。正確に決定する際に生きている組織の発達の比較は、細胞の挙動、目的のタンパク質によって調節される非常に貴重である。さらに、ここでは説明しない、生細胞イメージングは​​1つが、そのパターンの目のイベントに関心のある遺伝子の役割の定性的および/または定量的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems