의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

요약

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

초록

초파리 번데기 개발의 고유 프로세스는 이동 및 라이브 세포 이미징 동안 추적 개별 셀 동작을 어렵게 방법으로 눈의 상피 세포를 왜곡 할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 다음과 같습니다 망막 회전, 세포의 성장과 생명체의 움직임을. 번데기가이 도전 하나의 초점면에서 몇 ommatidia, 개안 이상의 포커스에있는 이미지를 수집 할 수 있도록, 이미징을위한 준비로서 또한, 미묘한 범프 등 상피의 토폴로지, 불규칙 자주 소개 주름입니다. 워크 플로는 초파리 번데기 눈 개발하는 동안 세포 과정의 쉬운 분석을 가능하게 구제 여기 이러한 문제를 설명했다. 적절하게 준비된 번데기 용이 대부분 실험실에서 조립 될 수 촬상 장비에 배치되어 유비퀴틴 DE 카데 :. GFP와 GMR-GAL4 구동 형 UAS-α 카테닌 : GFP를 눈 상피 ¹ 셀 경계를 시각화하는데 사용 ^-3입니다. 디컨 볼 루션은 후다중 초점면에서 촬영 된 형광 화상에 적용된 최대 투사 화상은 각 시점에 대해 생성 및 편집 소프트웨어를 사용하여 강화된다. 정렬 알고리즘은 추적 할 개별 셀의 동작은 더 쉽게, 빠르게 불필요한 움직임을 안정화하는 데 사용됩니다.

서문

화합물 초파리의 눈은 액세서리 색소 세포 ^4,5의 벌집 격자로 구분하여 그 ~ 750 ommatidia, 개안의 틀에 박힌 배열을 특징으로한다. 로컬 셀 움직임 세포 성장, 세포 형상의 변화, 세포 사멸 이러한 색소 세포는 이벤트 코디 조합에 의해 패터닝된다. 이 상피 세포의 실시간 시각화 하나는 생리 학적으로 적절하고 교란 입체 맥락에서 이러한 이벤트를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

이전의 프로토콜 ^-6,7- 대조적으로, 여기에 설명 된 기술들은 화상 형성 공정에서 커플 해제 할 수없는 불필요한 조직의 움직임을 안정화시키기위한 효율적인 방법을 포함한다. 영상의 과정을 통해, 성장 회전하는 조직과 변화 -이 방법은 개발 초파리 번데기 눈 상피 세포 행동의 연구를 강화한다. 또한 모션 안정화 기술에서는 드여기에 스 크라이 빙 외부 이동되기 다른 상황에서 세포를 연구하는 데 유용 할 것입니다.

눈 특정 드라이버 GMR-GAL4 ^1-3의 통제하에 GFP : GFP뿐만 아니라 UAS-α-catenin의를 : 초파리 망막 분야에서 셀 경계를 시각화하기 위해 유전자 변형 플라이 라인은 UBI-DE-cadherin의 발현가 생성되었다. 두 GFP 태그가 막 마커의 사용은 낮은 강도의 빛 셀 경계의 시각화 수 있습니다. 이는 고 에너지의 파장에 반복 노출 활성화, 증가 된 프레임 레이트 및 동영상 구간에 조직 손상을 최소화하고 광표백. UAS-DCR-2는 제 2 플라이 라인 ^(8)에 통합되었다의 RNAi 유전자의 효능을 강화합니다.

이전의 프로토콜의 세 번째 업데이트에서는 실험실에서 가장 용이하게 조립된다 촬상 간단한 장비를 설명한다. 이 장치는 특수 촬상 R을 갖도록 요구를 미연에 방지IG는 대학의 '기계 공장'또는 이와 유사한 서비스에 의해 생성. 이 영상 장비는 이미지를 다른 번데기 조직 ^{9, 10에} 사용되는 것과 유사하다.

직접 17-42 시간 puparium 형성 HR (APF) ~ 후 안구로부터 패터닝에 기여 형태 발생 이벤트를 평가하기 위해 사용될 수있는 단순한 라이브 셀 이미징 프로토콜이 여기에 제시했다. 즉,이 프로토콜은 번데기 개발 중에 유전자 발현을 변경하는 결과를 결정하기 위해 하나를 가능하게한다.

프로토콜

그림 3은 실험 절차의 요약을 보여줍니다.

1. 조직 준비

1. C를 중복에 다음 십자가를 설정 관심의 유전자의 변형 된 표현의 결과를 결정하고 25 °로 유지하려면 UAS - 유전자 (수컷) X는 GMR-GAL4; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b (처녀 여성) 참고 : 제어 조직 크로스 UAS-의 lacZ를 얻으려면이 GMR-GAL4에 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP 여성. β - 갈 락토시다 아제는 망막 세포의 행동에 결함을 생성하지 않습니다.
2. 의 RNAi 유전자의 효능을 향상시키기 위해 크로스 UAS-의 RNAi는 GMR-GAL4, UAS-DCR-2 수컷; UAS-α-고양이 : GFP, UBI-DE-의 CAD : GFP; + / SM5-TM6b 처녀 여성.
   주 : 이소성 DCR-2 발현이 관찰되었다 망막 세포 거동이 이따금 결함 (데이타 미기재). 각성이 방법을 사용하면 좋습니다.
3. 에스1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 당선자 흰색 해당 유전자형의 사전 번데기 및 장소. 번데기가 DCR-2를 표현하는 경우, 남성 또는 여성 중 번데기를 선택 UAS-DCR-2, X 염색체에 삽입,의 발현은 남성에 강하다. 번데기는 번데기 경우의 색소 침착 전에 0 시간 APF에서 성별화해야한다 - 남성의 생식기는 번데기 (후방에서 약 3 분의 1)의 측면에 큰 투명 글로브로 볼 수 있습니다.
4. 25 ° C에서 깨끗한 플라스틱 팁 상자에 번데기를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 품어. 번데기 장소의 팁 상자에 증류수에 담가 조직의 10cm ² 조각, 탈수를 방지합니다.
   참고 : 팁 상자에 습도가 너무 높아지면 번데기 경우 다음 단계에서 해부하는 기운이 어려운 경우가 있습니다.
5. 적절한 시간 동안 품어. 약 17 시간 APF, 20 시간의 APF 또는 24 시간 AP에서 이미징을위한 번데기를 준비, 눈을 패터닝과 관련된 세포의 행동을 캡처하려면F.은 특정 세포의 행동이 최선 관찰하는 경우에 대한 자세한 논의는 대표 결과를 참조하십시오.
6. 검은 실 가드 해부 접시에 신선한 양면 테이프의 조각을 놓습니다. 양면 테이프 (그림 1A)에 부착 된 번데기의 머리 위로 번데기, 등쪽의 위치를 .Try는 양면 테이프로 번데기의 흉부와 복부를 준수하지. 핀셋으로 조심스럽게 들어 올려 번데기 머리를 노출 아가미를 제거합니다. 한쪽 눈 주위를 노출 번데기 케이스의 측면을 따라 눈물.
7. 조심스럽게 접착 테이프에서 번데기를 제거합니다. 번데기가 부착 남아 있으면 접착력을 약화 번데기 케이스와 테이프 사이의 접합에 증류수의 작은 볼륨을 적용합니다.

2. 장착

1. 압지에서 작은 15mm ² 프레임을 구축하고 middlethat에 구멍을 펀치 직경 5.5 mm (그림 1B)입니다. 증류수와 장소에 담가현미경 슬라이드의 중심. 바셀린의 균일 한 반지를 집어 넣은, 30 CC 주사기를 사용하면 압지 프레임을 둘러싸는. 석유 젤리 링이 번데기의 폭보다 링의 직경이 커버 슬립의 폭보다 변두리에 작은 그 변두리에 더 높은 있는지 확인합니다.
2. 석유 젤리 비드 (그림 1D)에서 지원하는 측면에서, .Carefully 번데기를 준비 압지 (그림 1C)에 펀치 구멍에 직접 슬라이드에 석유 젤리의 작은 구슬을 추가합니다.
3. 석유 젤리 링의 상단에 커버 슬립을 놓고는 접촉 눈 neuroepithelium (그림 1D) 위의 상피 있도록. 부드럽게 바셀린 대해 커버 슬립을 밀봉하고 번데기 눈 영역 및 커버 슬립 사이에 작은 편평한 접촉 표면을 생성하는 제제를 압축.

3. 형광 이미징

1. 이미지를 사용하여 번데기 준비형광 현미경. 모든 7 분 캡처 adherens 접합의 지역에서 눈 neuroepithelium의 꼭대기의 도메인을 통해 시리얼 섹션.
   참고 :) 적절한 직렬 섹션은 보통 4-5 0.2 μm의 Z-단계로 구성 Z-스택 당이다. b)는 가벼운 충돌과 주름을 포함하여 상피 세포의 토폴로지에서 부정, 조직의 큰 영역에 초점 이미지를 수집하는 것이 도전 할 수 있습니다. 촬상 동안, 하나의 초점으로 관심 영역의 부분을 찾을 수 있으며, 이웃 영역 포커스 아웃한다. 번데기 눈 및 커버 슬립 사이에 증류수 작은 액 적을 포함하면 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계의 약간 고르지 토폴로지 특성 일부 급성 티슈하지만 주름을 제거 할 수 없다. 이러한 경우에는 합초 슬라이스는 전체 필드에 대해 획득 될 때까지 스택 Z를 확장하여 조직을 오버 샘플링. C) 매 7 분 상당한 redu없이 3 시간 4 라이브 이미징을 사용하도록 설정해야합니다 시리얼 부분을 캡처이미지 품질을 손상시킬 수 GFP 형광의 강도 ction의. 짧은 시간 구간은 영상의 총 시간을 감소시킬 수도있다.
2. 3 ~ 4 시간 동안 영상을 계속합니다. 번데기 성장과 체액의 펌핑 망막의 위치를​​ 이동하기 때문에 많은 형광 현미경에 사용할 수있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오 경계 다시 초점을 맞추고 매 14 ~ 21 분 필요합니다. 느리게하거나 눈의 형태 형성을 멈출 수 4시간 넘어 그 영상을 참고.
3. 배경을 줄이고 직렬 단면 영상의 콘트라스트를 향상시키기 위해 적절한 컨벌루션 소프트웨어를 사용한다. 각각의 Z-스택 파일의 경우, (재료의 표 참조) LAS AF 소프트웨어에서 다음을 수행 도구 패널로 이동, 3D 역대을 선택하고 적용을 클릭합니다.
4. 각 deconvoluted 스택 파일의 최대 투사 (MP) 이미지 생성 도구 패널로 이동, 3D 프로젝션을 선택하고 적용을 클릭합니다.
   참고 : 최대 투사 알고리즘이 유니폼을 생성하는 데 실패 할 수오버 샘플링 된 조직에 대한 LY 포커스에있는 이미지입니다. - 초점 영역을 선명하게하는 기술 단계 5.2에 설명되어있다.

4. 번데기 구조 및 표현형 확인을 포스트 - 이미징

1. 집게가 커버 슬립을 제거하고 음식을 깨끗한 유리 병에 번데기를 전송하여 : 아티팩트가 도입 또는 이미징 동안 피해 번데기가 조심스럽게 이미징 장비에서 번데기를 제거되었는지를 해결하기 위해. 실온에서 보관 또는 25 ° C 성인 플라이가 나올 때까지.
2. 조심스럽게 성인 눈의 표현형을 조사하고 원래 플라이 십자가에서 신흥 성인 파리의 눈에 비교합니다.

5. 이미지 처리

1. 자동 이미지 정렬 :
   참고 : 라이브 초파리 조직은 이동 및 촬영 과정을 통해 성장할 것입니다. 따라서, 이미지 센터는 초파리 조직에서 동일한 지점에 대응하지 않을 수도 연속 시점에서 모였다. 또한에서전체 망막 디스크는 21 ~ 23 시간의 APF 사이에 약 30 ° 회전합니다. 개별 셀 동작을 선택하고 생명체의 성장으로 인한 산만 함을 줄이고,이 수동으로 수행 할 수있는 각 MP image.While, 여기에 사용되는 이미지 편집 소프트웨어를 정렬하려면 프로세스를 신속하게 처리 할 수 있습니다 내장 된 알고리즘을하고있다 (재료의 표 참조).
   1. 스택에 메인 메뉴를 열고 스크립트로드를 선택 파일의 파일 탭에서.
   2. 로드 레이어 패널에 MP 이미지 파일을 가져 오기하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
      주 :이 옵션을 선택하면, 소프트웨어는 이미지 데이터를 왜곡 정렬 알고리즘을 이용할 수도있다.
   3. 모든 MP 파일은 레이어 창에로드 한 후, 모든 이미지는 최초의 시점은 레이어 스택의 상단에되도록 시간 순서에 있는지 확인하십시오. 층은 올바른 순서, 드래그에없는 그들이 정렬 될 때까지 놓는 경우올바르게.
   4. 메인 메뉴의 편집 탭에서 자동 정렬 레이어를 선택합니다. 들어 오도록을 선택하고 확인을 클릭합니다.
   5. 자동 정렬 알고리즘은 해당 초점에 프레임 방향을 실패 할 경우, 이동 도구를 사용하여 약간의 조정을합니다.
2. 복합 선명 :
   참고 : 초기 MP 이미지의 포커스 아웃 영역은 '자르기'LAS AF 소프트웨어에 해당 deconvoluted 스택에 의해 날카롭게 할 수 있습니다. 스택 파일 자르기 한 수동 최대 투영 알고리즘을 실시 Z 스택의 간격을 제한 할 수있다.
   1. (프로세스 탭 아래) 도구 패널에서 자르기 기능을 찾습니다. 수동 그들이 초기 포커스 아웃 영역 내에서만 부착 벨트 스팬되도록 초기 및 최종 슬라이스를 제한. 이 지역에 최적화 된 새로운 스택 파일을 생성 적용을 클릭합니다.
   2. TIFF 파일로 로컬에 최적화 된 스택 및 수출을위한 새로운 최대 투사를 생성합니다.
   3. 일에전자 이미지 편집 소프트웨어 (재료의 표 참조), 스택에 (메인 메뉴의 파일 탭에 위치) 오픈 스크립트로드를 선택 파일.
   4. 로드 레이어 패널에 특정 시점의 초기 MP 이미지 파일을 로컬에 최적화 된 MP 파일을 가져하고 [확인]을 선택합니다. 자동으로 소스 이미지 옵션을 맞 춥니 다하려는 시도가 선택되지 않았는지 확인합니다.
   5. 창 레이어의 두 레이어를 선택하고 균일 망막 분야에 초점을 맞 춥니 산출, 자동으로 두 이미지의 해당 영역을 마스크 (메인 메뉴의 편집 탭에 위치) 자동 혼합 레이어를 선택합니다. TIFF 파일로이 합성 이미지를 저장합니다.
   6. 반복하여 모든 차선 MP 이미지에 대한 5.2.5을 통해 5.2.1 단계를 반복합니다.
3. 또한 조정 : 회전, 자르기 및 조정 동영상 레이어의 레벨 :
   1. 모든 레이어를 선택한 상태 망막의 지느러미 - 복부 축이 정렬되도록 이미지를 회전 변환 도구 (편집> 자유 변형)을 사용하여동영상 프레임의 Y 축에 관한 것이다.
   2. 필요한 경우, 원하는 크기와 형상으로 시야를 감소시키기 자르기 도구를 사용한다.
   3. 세포막과 전지 본체 사이에 콘트라스트를 향상시킬 수 있도록 (각 프레임의) 레벨 조정을 사용한다.
   4. 문체의 목적을 위해 각 프레임에 대한 관심의 포인트를 강조하기 위해 거짓 컬러를 도입, 특정 세포의 행동을 강조하는.
4. 애니메이션 : 동영상으로 이미지를 변환 :
   1. 메인 메뉴의 윈도우 탭에서 애니메이션 창을 엽니 다. 애니메이션 창의 오른쪽 상단 모서리에있는 메뉴에서 레이어에서 프레임 만들기를 선택합니다.
   2. 층 스택의 바닥부터 시작하여 순차적으로 애니메이션 창에 추가되어 있습니다. 먼저 모든 프레임을 선택하고 애니메이션 창 메뉴에서 역방향 프레임을 선택, 프레임의 순서를 반대로합니다.
   3. 엄지 아래 프레임 드롭 다운 메뉴를 사용하여 각 프레임에 대한 프레임 지연 시간을 선택손톱.
      참고 : (1) 본 논문에서는 4 영화의 프레임 지연은 0.8 초이다.
   4. 주 메뉴를 열고 수출의 파일 탭에서 비디오 렌더링을 선택합니다. 파일 옵션에서 QuickTime 내보내기를 선택하고 원하는 비디오 형식을 선택합니다. 옵션 정의에 프레임 속도를 설정 렌더링에서, 15의 프레임 속도를 입력하고 렌더링을 클릭합니다.

결과

번데기 눈의 라이브 영상은 neuroepithelium의 패턴에 기여하는 세포의 행동을 관찰하는 성공적인 전략이다. 특정 단백질의 역할은 쉽게 눈 개발하는 동안 단백질 수준을 수정하여 유전자 발현을 평가할 수있다. 이 GMR-GAL4을 할 수있는 형태 형성 고랑 뒤에 유전자 발현을 구동하는 데 사용된다. 이것은 처음 두 령 유충 동안 눈 필드를 확립 이전 이벤트를 교란하지 않는 이점을 제공한다. 또한 ?...

토론

야생형 개발 위의 설명은 RNAi의 패터닝에서 이벤트 또는 과발현 유전자형의 비교를위한 기초를 형성한다. 세포의 행동이 관심의 단백질에 의해 조절되는 정확하게 결정할 때 라이브 조직 개발의 비교는 매우 중요하다. 또한, 설명을 생략하고, 생균 촬상 한 그 패턴 눈 이벤트에 관심 유전자의 역할을 정 성적 및 / 또는 정량적으로 설명을 할 수있다. 30 ~ 32 시간의 APF으로 대부분의 색소 세포가 안?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems