Demonstration der Ratte ischämische Hautwunde Modell

Zusammenfassung

Die Ratte, aufgrund seiner Größe, Verfügbarkeit und eher fügsam Verhalten hat als Forschungsmodell für viele Jahre in Anspruch genommen. Das Ziel des Protokolls ist es, die Ratte als ischämische Haut Wundheilung Modell zu verwenden, um einen wertvollen Einblick in die Pathophysiologie von chronischen Wunden bereitzustellen.

Zusammenfassung

Die Neigung für chronische Wunden bei Menschen erhöht die mit dem Altern, Krankheiten wie Diabetes und beeinträchtigten kardiovaskulären Funktion und unrelieved Druck aufgrund Unbeweglichkeit. Tiermodelle wurden, die versuchen, diese Bedingungen für den Zweck, das Verständnis für die Komplexität von chronischen Wunden nachahmen entwickelt. Das hier beschriebene Modell ist eine Ratte ischämische Hautlappen-Modell, das eine anhaltende Verringerung des Blutflusses, was zu Verletzungen, die ischämischen geworden und ähneln einer chronischen Wunde Phänotyp (reduzierte Durchblutung, erhöhte Entzündung und verzögerten Wundverschluss) ermöglicht. Es besteht aus einem bipedicled Dorsallappen mit 2 ischämischen Wunden zentral platziert und 2 nicht-ischämischen Wunden seitlich an der Klappe als Kontrollen. Eine neuartige Neben dieser ischämischen Hautlappen Modell ist die Platzierung einer Silikonfolie unter der Klappe, die als Barriere und einer Schiene an Revaskularisierung Verhinderung und Verringerung Kontraktion, wie die Wunden zu heilen funktioniert. Trotz derDiskussion der Verwendung von Ratten für Wundheilungsstudien aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen anatomischen und physiologischen Unterschieden im Vergleich zum Menschen (das heißt, das Vorhandensein eines Panniculus carnosus Muskel, kurze Lebensdauer, erhöhte Anzahl der Haarfollikel und ihre Fähigkeit, infizierten Wunden zu heilen) die in diesem Modell verwendeten Modifikationen machen es eine wertvolle Alternative zu bisher entwickelten ischämische Hautlappen Modelle.

Einleitung

Effektive Medikamentenentwicklung und anderen Wundheilungstherapeutika erfordern geeignete In-vivo-Modelle, trotz bekannter Probleme bei der Übersetzung Befunde in Tiermodellen für die menschliche Therapien ^ein. Was folgt, ist eine Beschreibung eines detaillierten Protokolls für die Verwendung von einem Rattenmodell der Ischämie die Wundheilung der Haut zu Mechanismen, die weiter das Verständnis der pathologischen Wundheilung zu untersuchen. Die Rattenarten aufgrund seiner breiten Verfügbarkeit, Größe häufig eingesetzt, und fügsam Natur ist für Wundheilungsstudien verwendet, da sie groß genug, um eine geeignete Hautstelle für incisional und excisional Verwundung, Imaging und Gewebesammlung ² zu liefern. Es sollte jedoch sorgfältig prüfen, die die Haut einer Ratte und einem Menschen unterschiedlich sind anatomisch genommen werden, mit Ratten, die als lose-gehäutet genannten Tiere. Diese ausgeprägte Merkmal ermöglicht Wundkontraktion statt Epithelialisierung signifikant zur Schließung der Rattenhaut w beitragenounds ^2. Zusätzlich kann die Gegenwart eines subkutanen Panniculus carnosus Muskel in Ratten, trägt zur Heilung sowohl Kontraktion und Kollagenbildung ^3,4. Diese sehr wichtige anatomische Unterschiede in der Entwicklung der ischämischen Hautwunde Modell Ratte betrachtet und spezifische Änderungen wurden implementiert, um Wundkontraktion verringern und den Einfluss der Panniculus carnosus ^Muskel-5.

In diabetischen Fußgeschwüren, Ulcus cruris und Dekubitus wird die Heilung verzögert und diese Wunden gelten als chronisch. Die Wunden werden durch übermäßige Entzündung, das die Wunde vom Weiterkommen in die nächsten Phasen der Wundheilung ⁶ verhindert wird. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Entwicklung einer chronischen Wunde lokalisiert Gewebeischämie (reduzierte Blutfluss) ^5, die zur Unfähigkeit, eine Entzündung zu löschen. Zu dem Zeitpunkt, in dem dieses Modell wurde entwickelt und validiert (in 2003-4), Gab es keine standardisierten Tiermodellen, die genügend Gewebe zur Induktion von Angiogenese im Wundbett, einer Schlüsselphase während der normalen Wundheilung und die Motivation für die Entwicklung dieses Modells ⁵ testen bieten könnte. Das heißt, die hier vorgestellte Modell ist eine Modifikation des ischämischen Wundmodell ursprünglich von Schwartz et al. ⁷ und in der Folge beschrieben, in modifizierter Form von Chen et al. ⁸

In der modifizierten ischämischen Wundmodell wurden Änderungen vorgenommen, um die oben genannten anatomischen Eigenschaften des Ratten, die Heilung durch Kontraktion statt Epithelialisierung führt zu umgehen: (1) zwei Voll Dicke Exzisionswunden innerhalb eines bipedicled dorsale Hautlappen und die erstellte Panniculus carnosus Muskel aus der Wunde durch Sezieren knapp über dem Muskelfaszie Bett entfernt. (2) Die Klappe selbst engeren Dimensionen, um sicherzustellen, dass die Blutversorgung ist zufällig und die Wunden in der Mitte des t gelegener Klappe sind ischämische. Unter der Klappe (3) Ein Silikonfolie eingesetzt, verhindert readherence und Reperfusion der Klappe vom darunterliegenden Gewebe. Wundkontraktion wird durch Verankerung oder Vernähen der Klappe an der Silikonfolie ⁵ begrenzt (nicht ausgeschaltet).

Das Modell wurde kürzlich in Studien von hyperbare Sauerstoff Auswirkungen auf ischämischen Wundheilung ^9,10 ischämischen Wundheilung bei jungen gegenüber alten Ratten ¹¹ eingesetzt und hat sich als ein zuverlässiges Modell der verlängerten Gewebeischämie sein. Die Abmessungen der Klappe bipedicled haben auch zu verschiedenen Rattenstämmen, einschließlich Sprague Dawley (11 cm lang und 2 cm breit) und F344-Ratten (10,5 cm lang und 3,0-3,5 cm breit) und anderen Spezies, einschließlich Schweine ¹² und Mäusen angepaßt ^13,14. Dieses Video nutzt die F344 Inzuchtrattenstamm in der Demonstration der ischämische Hautwunde Modell.

Zulassung für alle nachfolgend dargestellt Tierverfahren war zu erhaltened an der University of Animal Care Committee Südfloridas (IACUC) und sich an alle Anforderungen des Tierschutzgesetzes und des Leitfadens für Pflege und Verwendung von Labortieren.

Protokoll

HINWEIS: Zulassung für alle nachfolgend dargestellt Tierverfahren wurde von der University of Animal Care Committee Südfloridas (IACUC) erhalten und sich an den Anforderungen des Tierschutzgesetzes und des Leitfadens für Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Herstellung der Silikon Bettwäsche und chirurgische Instrumente

1. Vorgeschnittene Streifen (10.5 cm x 3.0 cm) von unverstärkten 0,01 Dicke, medizinischem Silikon-Folien und sterilisieren Verwendung eines Autoklaven.
2. Reinigen und zu sterilisieren geeignete chirurgische Instrumente (Scheren, Pinzetten und Gardinen oder Handtücher, einen sterilen Bereich während der Operation zu erstellen).

2. Versuchstiere

1. Verwenden Sie die männlichen oder weiblichen Ratten mit einem Gewicht im Bereich von 250 bis 350 g von einem kommerziellen Züchter erhalten. Bei alten Ratten eingesetzt werden, sollten sie ≥350 g, um bessere Überlebenschancen nach der Operation zu gewährleisten. Vor Beginn jeder Experimenten akklimatisieren alle Tiere für mindestens7 Tage unter Standardbedingungen von 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum.

3. Anästhesie, präoperative Analgesie und operative Vorbereitung

1. Induzieren eine Vollnarkose mit Hilfe Isofluran bei 3% -4% über eine Induktionskammer und zu warten (über die Verwendung eines Nasenkegel) bei 1% bis 2% mit O ₂ während der Vorbereitung der Haut und Chirurgie. Überwachung der Narkosetiefe durch Beobachtung der Frequenz und Tiefe der Atmung, Inter Prise oder Augenlidblinkreflex.
   HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann ein Tierarzt Salbe auf den Augen platziert werden, um Trockenheit zu verhindern, während das Tier unter Narkose ist.
2. In einem Ort entfernt von dem sterilen OP-Bereich, legen Sie die Ratte in der Bauchlage und rasieren der Rücken mit Schermaschinen von der Basis des Halses nach unten ca. 11 cm. Schablone mit Permanent-Marker, der Entwurf für die 3,0 cm x 10,5 cm Klappe (siehe Abbildung 1A).
3. Bewegen Sie die Ratte auf einem sauberen, bezeichnet surgical-Bereich mit einem zugelassenen Heizkissen und sterile OP-Abdeckungen und Handtüchern ausgestattet. Injizieren Sie 5 mg / kg subkutan Ketoprofen vor den ersten chirurgischen Einschnitten für die Schmerztherapie. Zusätzliche Flüssigkeiten (Kochsalzlösung) kann je nach Bedarf gegeben werden (bis zu 5 cc) subkutan.
4. Weitere Bereiten Sie die Haut durch Abtupfen zunächst mit 70% igem Isopropylalkohol und zweiten mit 0,2% Chlorhexidin, gelten sterilen Tüchern um ein steriles Feld zu erstellen. 10% Povidon-Iod (Betadine) können ebenfalls verwendet werden.
   HINWEIS: Ein Antibiotikum (Ampicillin, bei 15 mg / kg) subkutan verabreicht werden, aber wenn gute aseptische Techniken verwendet werden, dies nicht erforderlich ist.

4. Erstellen Exzisionswunden und Bipedicled Flap

1. Mit einem sterilen Einweg 6 mm Biopsie Stanzwerkzeug, erstellen Sie zwei Kreis "ischämische" Wunden in der Mitte der bezeichneten Klappenbereich (1B). Die Tiefe der Wunde sollte auf (nicht über) die zugrunde liegende Faszie des Panniculus Carno seinsus Muskel (1B kleines Bild).
2. Mit einer Pinzette heben Sie die Haut in der Mitte der Wunde Umrisse, die durch die Stanzbiopsie und verwenden Sie dann Iris Schere (mit gebogenen Spitzen), um das kreisförmige Stück Gewebe (einschließlich der Panniculus carnosus Muskel) herauszuschneiden. Das Ergebnis ist eine volle Dicke der Fascia als Base der Wunde gewickelt werden.
   HINWEIS: Der herausgeschnittene Gewebe (Wund Stecker) können in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in 10% gepuffertem Formalin-O / N für die spätere Verarbeitung als Kontrolle normaler Haut befestigt werden.
3. Erstellung einer bipedicled Klappe durch Einschnitte mit einem sterilen Skalpell auf jeder Seite der ischämischen Wunden entlang der vorgezeichneten Linien (1C), die 10,5 cm in der Länge und 3,0 cm auseinander liegen. Die Tiefe der Einschnitte vorzusehen, um den paraspinous Muskeln. Mit Iris Schere, trennen die Panniculus carnosus Faszie aus den paraspinous Muskeln, dabei darauf achten, die Faszie intakt wie der "Basis" der 6 mm Stempeln zu halten (Fild 1D).
4. Nehmen Sie 1 sterile vorgeschnittenen Silikonfolie und legen Sie es in zwischen der Panniculus carnosus Verkleidung und die paraspinous Muskeln (1E) zu gewährleisten, dass das Blatt nicht wellt oder aussteigen. Mit schwarzen, nicht-resorbierbares Nahtmaterial (Größe 4,0) schließen Sie beide Einschnitte durch die Verankerung der Silikonfolie auf der Haut mit mindestens 8 unterbrochen Maschen auf jeder Seite, die entlang der Länge der Klappe (1F und 1G).
5. Verwendung eines sterilen Einweg-Biopsie Stanzwerkzeug werden zwei interne Kontrolle "nicht-ischämischen" Wunden (bis zu den vorderen Faszie des Panniculus carnosus Muskel) 1 cm seitlich der ischämischen Wunden auf beiden Seiten der Klappe (Figur 1G).
6. Legen Sie ein Lineal unter den Wunden und digitale Fotos für die Wundmesszwecken (siehe 3A). Zu diesem Zeitpunkt kann die Durchblutung (Perfusion) unter Verwendung von Laser-Doppler oder andere Manipulationen (topisches Arzneimittel placement) ausgeführt überwacht werden.
7. Tragen Sie eine genehmigte flüssigen Klebstoff sowohl kranialen und kaudalen auf die Wunden und eine transparente Folienverband, die feuchten Wundmilieu und sauber (steril) zu halten. Ein zusätzlicher Verband kann am kaudalen Ende der Klappe angeordnet sein, um das Tier vor dem Entfernen der kaudalsten Nähte zu verhindern.

5. Postoperative Verfahren

1. Zeigen Tiere in Käfigen (Einzelhaltung) mit flachen Feedern, um die Operationsstelle von Reibung an der Zuführung zu verhindern. Die Tiere sollten nicht unbeaufsichtigt gelassen oder an die Firma von anderen Tieren zurückgegeben, bis sie ausreichend Bewusstsein Brustlage erhalten und weisen gezielte Bewegung wieder werden. Heizmatten sollte die Hälfte des Käfigs für bis zu 2 Tage während der Wiederherstellung platziert werden.
2. Um Schmerzen nach der Operation zu verwalten, zu verwalten Ketoprofen (5 mg / kg) subkutan an Tieren am nächsten Morgen und 1x pro Tag für bis zu 48 Stunden nach der Operation. Tiere sollten täglich überwacht werdenlängere Anzeichen von Schmerzen, Gewichtsverlust oder postoperativen Wundinfektionen.

6. Nachfolgende Messungen und Wundverbandwechsel

1. Messen Sie ischämischen und nicht-ischämischen Wunden häufig unter Vollnarkose mit Isofluran bei 3% -4% über eine Induktionskammer und (über einen Nasenkegel) bei 1% bis 2% mit O _2, wie in Schritt 3.1 erhalten.
2. Entfernen Sie den Verband vorsichtig, um den Klebstoff von der Haut nicht ziehen. Zu diesem Zeitpunkt zusätzliche digitale Fotos werden zur Wund Messungen, topische Behandlungen wieder angewendet, Laser-Doppler-Bildgebung (LDI) oder andere Manipulationen durchgeführt, um den Prüfer Bedürfnisse.
3. Klebstoff und einem sauberen Verband und bieten, damit sie wie in Schritt 5.1 wiederherstellen.

7. Wund Sammlung und Euthanasie

1. Ernte ischämischen und nicht-ischämischen Wunden (an den Tagen der Ermittler für angemessen hält) während sich das Tier in Narkose mit Isofluran bei 3% -4% über einen induction Kammer und auf 1% bis 2% mit O ₂ gehalten (über einen Nasenkegel), wie in Schritt 3.1.
2. Mit einem Skalpell einen quadratisch Exzision um die Wunde herum, um etwas gesundes Gewebe um die Wunde schließen. Legen Sie die Entfernung in ein 1,5-ml-Schnappdeckel Rohr und Schnapp Einfrieren in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) für zukünftige molekulare Analyse oder Inkubation in 10% gepuffertem Formalin O / N bei RT zur histologischen Verarbeitung.
   HINWEIS: Die Wunde Exzisionen kann auch in zwei Hälften geschnitten werden, um mehr Proben für die Analyse zur Verfügung.
3. Nach dem Wundgewebe Entfernung, einschläfern das Tier mit dem zugelassenen Verfahren der CO ₂ Inhalation.

Ergebnisse

Die Ratte ischämischen Wundheilung Musterprotokoll sollte etwa 20 Minuten pro Tier zu nehmen, wenn effizient durchgeführt. Vor dem Aufbringen eines Verbandes sollte das Modell angezeigt, wie in Figur 1G dargestellt ist. Es wird wichtig sein, um sicherzustellen, dass die bipedicled Klappe und Wunden darin sind ischämische. Die subkutane Sauerstoffpartialdruck (PSCO ₂₎ auf der Ebene der Wunden wurde bei der Validierung des Modells ^5, indem Sie einen polarographischen Elektrode in ...

Diskussion

Die Wundheilung bei Ratten war oft das Thema der Debatte durch ihre Fähigkeit, infizierten Wunden und hohe Variabilität interanimal ⁵ heilen. Einer der ursprünglichen Zielen des Modells während der Entwicklung war es, diese Schwankung zu verringern. Modifikationen an der Breite der Verschlußklappe, die Verringerung der Anzahl der Wunden, die mit bestimmten Platzierungs (zentriert auf der Klappe mit konsistenten kraniokaudale location) und Einführung einer Silikonfolie wurde dieses Ziel erreicht. W...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128