Démonstration de la peau plaies Modèle Rat ischémique

Résumé

Le rat, en raison de sa taille, la disponibilité et le comportement plutôt docile, a été utilisé comme un modèle de recherche depuis de nombreuses années. L'objectif de ce protocole est d'utiliser le rat comme un modèle de cicatrisation de la peau de la plaie ischémique de fournir de précieux renseignements sur la physiopathologie des plaies chroniques.

Résumé

La propension des plaies chroniques chez les humains augmente avec le vieillissement, les conditions de maladies telles que le diabète et les troubles de la fonction cardiovasculaire, et une pression constante en raison de l'immobilité. Les modèles animaux ont été développés qui tentent d'imiter ces conditions dans le but d'approfondir notre compréhension de la complexité des plaies chroniques. Le modèle décrit ci-après est un modèle de lambeau cutané ischémique du rat qui permet une réduction prolongée de la circulation sanguine dans les plaies résultant qui deviennent ischémiques et ressemblent à un phénotype d'une plaie chronique (vascularisation réduite, une inflammation accrue et un retard de fermeture de la plaie). Il se compose d'un rabat dorsal bipedicled avec 2 plaies ischémiques placés au centre et deux plaies non ischémiques au rabat latéral comme témoins. Une nouvelle addition de ce modèle de lambeau cutané ischémique est le placement d'une feuille de silicone sous le rabat qui fonctionne comme une barrière et une attelle pour empêcher et réduire la contraction revascularisation que les blessures guérissent. Malgré ledébat sur ​​des rats pour cicatrisation des études en raison de leurs différences anatomiques et physiologiques bien distinctes par rapport à l'homme (ce est à dire, la présence d'un muscle pannicules carnosus, courte durée de vie, augmentation du nombre de follicules pileux, et leur capacité à guérir les plaies infectées) les modifications employées dans ce modèle en font une alternative intéressante aux modèles de lambeau de peau ischémiques développés précédemment.

Introduction

Le développement de médicaments efficaces et d'autres agents thérapeutiques de cicatrisation des plaies exigent appropriée dans des modèles in vivo, malgré les problèmes connus en traduire les résultats dans des modèles animaux pour les thérapies humaines ^1. Ce qui suit est une description d'un protocole détaillé pour l'utilisation d'un modèle de rat de la peau ischémique cicatrisation des plaies pour étudier les mécanismes qui favorisent la compréhension de la guérison de la plaie pathologique. Les espèces de rats, souvent employée en raison de sa grande disponibilité, la taille et la nature docile est utilisé pour les études de cicatrisation car il est assez grand pour fournir une zone de la peau approprié pour blessure par incision et excision, l'imagerie et la collecte de tissus ^2. Toutefois, il devrait être pris en considération attention à ce que la peau d'un rat et d'un humain anatomiquement sont différents, avec des rats étant désignées animaux lâches peau. Cette caractéristique distincte permet de contraction de la plaie, plutôt que épithélialisation contribuer de manière significative à la fermeture de la peau de rat w² plaies. En outre, la présence d'un panniculus carnosus muscle sous-cutanée chez le rat, contribue à la guérison à la fois par la contraction et la formation de collagène ^3,4. Ces distinctions anatomiques très importantes ont été prises en compte dans le développement du modèle de plaie ischémique de la peau de rat et des modifications spécifiques ont été mises en œuvre pour diminuer contraction de la plaie et de réduire l'influence de la panniculus carnosus musculaire ^5.

Dans les ulcères du pied diabétique, les ulcères de jambe veineux et les ulcères de pression, la guérison est retardée et ces blessures sont considérée comme chronique. Les plaies sont caractérisées par une inflammation excessive, ce qui empêche la plaie de progresser aux prochaines phases de la cicatrisation des plaies ^6. L'un des principaux facteurs dans le développement d'une plaie chronique est une ischémie localisée des tissus (réduction du flux sanguin) ⁵ contribuer à l'incapacité de supprimer l'inflammation. À l'heure au cours de laquelle ce modèle a été mis au point et validé (dans 2003-4), Il n'y avait pas d'animaux modèles standardisés qui pourraient fournir assez de tissu pour tester l'induction de l'angiogenèse dans le lit de la plaie, une étape clé lors de la cicatrisation normale des plaies et de la motivation pour développer ce modèle ^5. Cela dit, le modèle présenté ici est une modification du modèle de blessure ischémique initialement décrite par Schwartz et al. ⁷ et par la suite utilisés sous forme modifiée par Chen et al. ⁸

Dans le modèle de blessure ischémique modifié, des changements ont été effectués pour contourner les caractéristiques anatomiques mentionnées ci-dessus du rat qui conduisent à la guérison par contraction plutôt que épithélialisation: (1) Deux plaies d'excision pleine épaisseur sont créées au sein d'un volet et la peau dorsale bipedicled panniculus carnosus muscle est retiré du lit de la plaie en disséquant juste au dessus du fascia musculaire. (2) Le volet lui-même a des dimensions plus étroites, en se assurant que l'approvisionnement en sang est aléatoire et les plaies situées au milieu de til sont rabat ischémique. (3) Une feuille de silicone est inséré sous le rabat, la prévention et la reperfusion readherence du rabat de tissu sous-jacent. Contraction de la plaie est limitée (pas éliminé) par ancrage ou suturer le rabat à la feuille de silicone ^5.

Le modèle a été récemment utilisé dans les études des effets allant de l'oxygène hyperbare sur blessure ischémique guérison ^9,10 pour la cicatrisation des plaies ischémiques chez les jeunes rats âgés de ¹¹ par rapport à et se est avérée être un modèle fiable de l'ischémie tissulaire prolongée. Les dimensions du volet bipedicled ont également été adaptés à différentes souches de rats Sprague Dawley, y compris (11 cm de long sur 2 cm de large) et des rats F344 (10,5 cm de long sur 3,0 à 3,5 cm de large) et d'autres espèces, y compris les porcs et les souris ^{12 13,14.} Cette vidéo utilise la souche de rat consanguine F344 dans la démonstration du modèle de plaie cutanée ischémique.

Approbation de toutes les procédures d'animaux présentés ci-dessous était obtenired de l'Université de Comité de protection des animaux de Floride du Sud (IACUC) et respecter toutes les exigences de la Loi sur la protection des animaux et le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Protocole

REMARQUE: Approbation de toutes les procédures d'animaux présentés ci-dessous a été obtenue de l'Université de Comité de protection des animaux de Floride du Sud (IACUC) et respecter toutes les exigences de la Loi sur la protection des animaux et le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation des feuilles de silicone et des instruments chirurgicaux

1. bandes prédécoupées (10,5 cm x 3,0 cm) de non-renforcées 0,01 épaisseur, des bâches en silicone de qualité médicale et stériliser l'aide d'un autoclave.
2. Nettoyer et stériliser les instruments chirurgicaux appropriés (ciseaux, pinces et des stores ou des serviettes pour créer un champ stérile pendant la chirurgie).

2. animaux d'expérimentation

1. Utilisez mâle adulte ou rats femelles pesant dans la gamme de 250 à 350 g obtenu d'un éleveur commercial. Si les rats âgés sont utilisés, ils devraient être ≥350 g afin d'assurer une meilleure survie post-chirurgie. Avant le début de toutes les expériences acclimater tous les animaux pendant au moins7 jours dans des conditions normales d'un cycle lumière-obscurité de 12 h avec de la nourriture et de l'eau ad libitum.

3. Anesthésie, analgésie pré-opératoire et la préparation opérationnelle

1. Induire une anesthésie générale à l'aide d'isoflurane à 3% à 4% par l'intermédiaire d'une chambre d'induction et maintenir (via l'utilisation d'un cône de nez) à 1% -2% de O ₂ pendant la préparation de la peau et la chirurgie. Surveiller la profondeur de l'anesthésie par l'observation de la vitesse et la profondeur de la respiration, une pincée interdigital ou palpébrale réflexe de clignement.
   NOTE: A ce moment, un onguent vétérinaire peut être placé sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que l'animal est sous anesthésie.
2. Dans un endroit éloigné de la zone chirurgicale stérile, placer le rat en position couchée et se raser le dos avec une tondeuse de la base du cou vers le bas d'environ 11 cm. Pochoir avec un marqueur permanent, les grandes lignes du 3,0 cm x 10,5 cm volet (voir la figure 1A).
3. Déplacez le rat, une Surgica désigné proprel espace équipé d'un coussin chauffant approuvé et des rideaux ou des serviettes chirurgicales stériles. Injecter 5 mg / kg par voie sous cutanée kétoprofène avant les premières incisions chirurgicales pour la gestion de la douleur. Fluides supplémentaires (salines) peuvent être donnés (jusqu'à 5 cc) sous-cutanée au besoin.
4. Préparer la peau plus loin en frottant d'abord avec 70% d'alcool isopropylique et le second avec 0,2% de chlorhexidine, puis appliquer des champs stériles pour créer un champ stérile. 10% de povidone-iode (Bétadine) peut également être utilisé.
   REMARQUE: Un antibiotique (ampicilline à 15 mg / kg) peut être administré par voie sous cutanée, mais si bonnes techniques aseptiques sont utilisés, il ne est pas nécessaire.

4. Création plaies d'excision et Bipedicled Flap

1. En utilisant un outil stérile, à usage unique 6 mm biopsie punch, créer deux plaies circulaires "ischémiques" dans le centre de la zone désignée de volet (figure 1B). La profondeur de la plaie doit être réduit à (pas de passage) du fascia sous-jacent de la carno panniculusSus musculaire (figure 1B encadré).
2. Aide d'une pince soulever la peau au milieu du contour de la plaie créée par la biopsie de poinçon puis utilisez des ciseaux iris (avec des conseils courbes) pour exciser la pièce circulaire de tissu (y compris le panniculus carnosus musculaire). Le résultat sera une épaisseur complète de la plaie avec la planche de bord en tant que base de la plaie.
   NOTE: Le tissu excisé (bouchons plaies) peuvent être congelés rapidement dans de l'azote liquide ou fixés à 10% O tamponnée de formol / N pour un traitement ultérieur que le contrôle, la peau normale.
3. Insérer un rabat bipedicled en faisant des incisions avec un scalpel stérile sur chaque côté des plaies ischémiques le long des lignes pré-établi (figure 1c) qui sont 10,5 cm de longueur et 3,0 cm. La profondeur des incisions devrait être réduit à les muscles paraspinous. Utilisation iris ciseaux, séparer le fascia pannicules carnosus des muscles paraspinous, en veillant à conserver le fascia intact comme la «base» des poinçons 6 mm (Figure 1D).
4. Prenez une feuille de silicone pré-coupés stérile et le placer entre le fascia pannicules carnosus et les muscles paraspinous (figure 1E) assurant que la feuille ne bouclent pas leur ceinture ou se coucher. Avec du noir, des sutures non résorbables (taille 4,0) fermer deux incisions en ancrant la feuille de silicone sur la peau avec au moins huit points de suture interrompues de chaque côté, le long de la longueur de la patte (Figure 1F et 1G).
5. L'utilisation d'un outil stérile, jetable biopsie poinçon, créer deux plaies contrôle internes "non ischémiques" (en bas à la planche de bord antérieur du panniculus carnosus muscle) 1 cm en dehors des plaies ischémiques part et d'autre de la patte (figure 1G).
6. Placez une règle ci-dessous les blessures et prendre des photos numériques à des fins de mesure des plaies (voir la figure 3A). A ce moment, le flux de sang (de perfusion) peut être contrôlé par l'utilisation de laser Doppler (ou d'autres manipulations de placement de médicament topique) effectuées.
7. Appliquer un adhésif liquide approuvé deux crânienne et caudale aux blessures et un film transparent pansement pour maintenir l'environnement humide et propre (stérile). Un pansement supplémentaire peut être placé à l'extrémité caudale de la trappe pour empêcher l'animal de retirer les sutures les plus caudale.

5. Procédures post-opératoires

1. Placez les animaux individuellement dans des cages (logé) équipés de dispositifs d'alimentation peu profondes de manière à empêcher le site chirurgical de frotter contre le dispositif d'alimentation. Animaux ne devraient pas être laissés sans surveillance ou retournés à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal et présentent mouvements volontaires. tapis de chauffage doivent être placés sous la moitié de la cage jusqu'à 2 jours lors de la récupération.
2. Pour gérer la douleur post-opératoire, administrer kétoprofène (5 mg / kg) par voie sous cutanée à des animaux le matin et 1 fois par jour suivant pour un maximum de 48 heures après la chirurgie. Les animaux doivent aussi être inspectés quotidiennement poursignes prolongés de la douleur, la perte de poids ou des infections du site opératoire.

6. Mesures de plaies ultérieures et les changements de pansement

1. Mesurer plaies ischémiques et non ischémiques souvent sous anesthésie générale en utilisant de l'isoflurane à 3% -4% via une chambre d'induction et maintenu (via un cône de nez) à 1% -2% de O ₂ comme à l'étape 3.1.
2. Enlever le pansement doucement pour ne pas tirer l'adhésif de la peau. A cette époque photos numériques supplémentaires sont prises pour les mesures de la plaie, les traitements topiques ré-appliquées, l'imagerie laser Doppler (LDI) ou d'autres manipulations effectuées pour répondre aux besoins de l'enquêteur.
3. Appliquer la colle et un pansement propre et laisser l'animal de récupérer comme dans l'étape 5.1.

7. Blessure Collection et l'euthanasie

1. ischémique de récolte et de blessures non ischémiques (les jours de l'enquêteur juge approprié) alors que l'animal est sous anesthésie générale à l'isoflurane à 3% -4% via un indchambre de uction et maintenus (par l'intermédiaire d'un cône de nez) à 1% -2% de O ₂ comme à l'étape 3.1.
2. Avec un scalpel, faire une excision de forme carrée autour de la plaie afin d'inclure certains tissus sains autour de la plaie. Placez l'excision dans un composant logiciel enfichable 1,5 ml tube de bouchon, et refixer gel dans l'azote liquide (conserver à -80 ° C) pour l'analyse moléculaire futur ou incuber dans 10% de formol tamponné O / N à la température ambiante pour le traitement histologique.
   NOTE: Les excisions de la plaie peuvent également être coupés en deux pour donner plus d'échantillons pour analyse.
3. Après élimination des tissus de la plaie, euthanasie de l'animal en utilisant la méthode de CO ₂ inhalation approuvée.

Résultats

Le protocole de modèle de cicatrisation de la plaie ischémique du rat devrait prendre environ 20 minutes par animal si elle est effectuée de manière efficace. Avant l'application d'un pansement le modèle doit apparaître comme représenté sur la figure 1G. Il sera important de vérifier que le volet et blessures bipedicled y sont ischémique. Pression d'oxygène sous-cutanée (PSCo ₂₎ au niveau des plaies a été mesurée lors de la validation de ce modèle ⁵ en p...

Discussion

La cicatrisation des plaies chez les rats a souvent été l'objet de débats en raison de leur capacité à guérir les plaies infectées et le taux élevé de variabilité interanimal ^5. Un des objectifs initiaux du modèle lors de son développement était de réduire cette variation. Modifications à la largeur de la patte, ce qui réduit le nombre de blessures avec emplacement spécifique (centrées sur le volet avec l'emplacement de cranio-caudale cohérente) et l'introduction d'une...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128