Dimostrazione del Topo ischemica pelle ferita Modello

Riepilogo

Il ratto, grazie alle sue dimensioni, disponibilità e comportamento piuttosto docile, è stato utilizzato come modello di ricerca per molti anni. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare il ratto come una pelle ferita modello ischemico guarigione per fornire informazioni preziose sulla fisiopatologia delle lesioni croniche.

Abstract

La propensione per le ferite croniche negli esseri umani aumenta con l'invecchiamento, condizioni di malattia come il diabete e la funzione cardiovascolare compromessa, e la pressione non alleviata a causa di immobilità. I modelli animali sono stati sviluppati che tentativo di imitare queste condizioni al fine di promuovere la nostra comprensione della complessità delle ferite croniche. Il modello qui descritto è un modello lembo cutaneo ischemica topo che permette una riduzione prolungata del flusso sanguigno con conseguente ferite che diventano ischemica e assomigliano un fenotipo cronica ferita (ridotta vascolarizzazione, una maggiore infiammazione e la chiusura della ferita in ritardo). È costituito da un lembo dorsale bipedicled con 2 ferite ischemiche posizionati centralmente e 2 ferite non ischemiche laterale al lembo come controlli. Un romanzo Oltre a questo modello ischemico lembo cutaneo è il posizionamento di un foglio di silicone sotto il lembo che funziona come una barriera e una stecca per prevenire rivascolarizzazione e ridurre la contrazione come le ferite guariscono. Nonostante ladibattito di utilizzare ratti per la guarigione delle ferite studi a causa delle loro differenze anatomiche e fisiologiche ben distinte rispetto per l'uomo (cioè, la presenza di un muscolo pannicolo carnosus, breve durata, aumento del numero dei follicoli piliferi, e la loro capacità di guarire le ferite infette) le modifiche impiegati in questo modello lo rendono una valida alternativa ai modelli lembo cutaneo ischemici precedentemente sviluppate.

Introduzione

Lo sviluppo di farmaci efficaci e di altre terapie cicatrizzanti richiedono appropriati modelli in vivo, nonostante i problemi noti a tradurre i risultati in modelli animali per le terapie umane ^1. Quella che segue è una descrizione di un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un modello di ratto di ischemico pelle guarigione delle ferite per indagare meccanismi che ulteriormente la comprensione della cicatrizzazione patologica. Le specie di ratto, spesso impiegato per la sua ampia disponibilità, le dimensioni e la natura docile viene utilizzato per gli studi la guarigione di ferite come è grande abbastanza per fornire una zona di pelle adatta per incisionale ed escissionali ferimento, l'imaging e la raccolta dei tessuti ^2. Tuttavia dovrebbe essere preso in attenta considerazione che la pelle di un topo e un essere umano sono diversi anatomicamente, con i ratti è stata sottoposta agli animali come sciolto dalla pelle. Questa caratteristica permette distinto per ferita contrazione, piuttosto che epithelialization contribuire in modo significativo alla chiusura di pelle di ratto wounds ^2. Inoltre, la presenza di un pannicolo sottocutaneo carnosus muscolare nei ratti, contribuisce alla guarigione sia contrazione e formazione di collagene ^3,4. Queste distinzioni molto importanti anatomici sono stati considerati nello sviluppo del modello ischemico ferita della pelle di ratto e specifiche modifiche sono state attuate per diminuire ferita contrazione e ridurre l'influenza del pannicolo carnosus muscolare ^5.

In ulcere diabetiche del piede, ulcere venose e ulcere da pressione, la guarigione è ritardata e queste ferite sono considerate croniche. Le ferite sono caratterizzati da infiammazione eccessiva, che impedisce la ferita di progredire alle successive fasi di riparazione della ferita ^6. Uno dei principali fattori di sviluppo di una ferita cronica è localizzato ischemia tissutale (ridotto flusso di sangue) ⁵ contribuire alla incapacità di eliminare l'infiammazione. Al momento in cui questo modello è stato sviluppato e validato (nel 2003-4), Non c'erano modelli animali standardizzati che potrebbero fornire abbastanza tessuto per testare l'induzione dell'angiogenesi nel letto della ferita, una tappa fondamentale nel normale guarigione delle ferite e la motivazione per lo sviluppo di questo modello ^5. Detto questo, il modello qui presentato è una modifica del modello ischemico ferita originariamente descritto da Schwartz et al. ⁷ e successivamente utilizzato in forma modificata da Chen et al. ⁸

Nel modello ferita ischemica modificata, sono state apportate modifiche di eludere le caratteristiche anatomiche di cui sopra del topo che conducono alla guarigione dalla contrazione piuttosto che epithelialization: (1) Due ferite escissionali tutto spessore vengono create all'interno di un lembo cutaneo dorsale bipedicled e la panniculus muscolare carnosus viene rimosso dal letto della ferita sezionando appena sopra la fascia muscolare. (2) Il lembo stesso ha dimensioni più strette, assicurando che apporto di sangue è casuale e le ferite poste nel punto medio di tegli lembo sono ischemica. (3) Un foglio di silicone è inserito sotto il lembo, impedendo readherence e riperfusione del lembo di tessuto sottostante. La contrazione della ferita è limitata (non eliminato) per l'ancoraggio o la sutura del lembo al foglio di silicone ^5.

Il modello è stato utilizzato di recente negli studi che vanno dagli effetti di ossigeno iperbarico sulla ferita ischemica guarigione ^9,10 per ischemico guarigione della ferita in giovane contro ratti anziani ^{di 11} e ha dimostrato di essere un modello affidabile di ischemia del tessuto prolungata. Le dimensioni del lembo bipedicled sono state adattate a differenti ceppi di ratto, compresi Sprague Dawley (lunga 11 cm e larga 2 cm) e ratti F344 (lunghezza 10,5 centimetri da 3,0-3,5 cm di larghezza) e altre specie, tra ¹² e suina topi ^13,14. Questo video utilizza la F344 ceppo di ratti inbred nella dimostrazione del modello ischemico ferita pelle.

L'approvazione per tutte le procedure, presentato sotto era ottenereed all'Università del comitato Animal Care del South Florida (IACUC) e rispettare tutti i requisiti della legge sulla protezione degli animali e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

Protocollo

NOTA: approvazione per tutte le procedure, presentato di seguito è stato ottenuto presso l'Università del comitato Animal Care del South Florida (IACUC) e rispettare tutti i requisiti della legge sulla protezione degli animali e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione di fogli di silicone e strumenti chirurgici

1. Strisce pretagliate (10,5 centimetri x 3,0 cm) di non rinforzati 0,01 di spessore, di grado medico teli di silicone e sterilizzare in autoclave.
2. Pulire e sterilizzare idonei strumenti chirurgici (forbici, pinze e tende o asciugamani per creare un campo sterile durante l'intervento chirurgico).

2. Gli animali sperimentali

1. Utilizzare maschio adulto o ratti femmina di peso nella gamma 250-350 g ottenuti da un allevatore commerciale. Se vengono utilizzati ratti anziani, dovrebbero essere ≥350 g per garantire post-chirurgia migliore sopravvivenza. Prima dell'inizio di qualsiasi esperimenti acclimatarvi tutti gli animali per almeno7 giorni in condizioni standard di un ciclo luce-buio 12 ore con cibo e acqua ad libitum.

3. Anestesia, Analgesia pre-operatoria e di preparazione operativa

1. Indurre anestesia generale utilizzando isoflurano al 3% -4% tramite una camera di induzione e mantenere (mediante uso di un cono) a 1% -2% di O ₂ durante la preparazione della pelle e chirurgia. Monitorare la profondità dell'anestesia dall'osservazione del tasso e la profondità della respirazione, pinch interdigitale o palpebrale riflesso corneale.
   NOTA: In questo momento, un unguento veterinario può essere posizionato sugli occhi per prevenire la secchezza mentre l'animale è sotto anestesia.
2. In una remota località della zona chirurgica sterile, collocare il topo in posizione prona e radersi il dorso con Clippers dalla base del collo in giù circa 11 centimetri. Stencil con pennarello indelebile, la traccia per il 3,0 centimetri x 10,5 centimetri falda (vedi Figura 1A).
3. Spostare il ratto di un ambiente pulito, surgica designatozona l dotato di un rilievo di riscaldamento approvato e teli o asciugamani chirurgici sterili. Iniettare 5 mg / kg per via sottocutanea ketoprofene prima delle prime incisioni chirurgiche per la gestione del dolore. Altri fluidi (saline) possono essere dati (fino a 5 cc) per via sottocutanea come necessario.
4. Preparare la pelle ulteriormente tampone prima con 70% di alcool isopropilico e secondo con clorexidina 0,2%, quindi applicare teli sterili per creare un campo sterile. 10% iodopovidone (Betadine) può essere utilizzato anche.
   NOTA: Un antibiotico (ampicillina a 15 mg / kg) può essere somministrato per via sottocutanea, ma se sono usate buone tecniche asettiche non è necessaria.

4. Creazione di Ferite escissionali e Bipedicled Flap

1. Utilizzando un sterili monouso 6 millimetri strumento biopsia, creare due ferite circolari "ischemici" nel centro dell'area lembo designata (Figura 1B). La profondità della ferita dovrebbe essere giù a (non attraverso) la fascia sottostante del Carno pannicolosus muscolare (Figura 1B nel riquadro).
2. Uso pinze sollevare la pelle al centro del contorno ferita creata dalla biopsia e quindi utilizzare le forbici iris (con punte curve) per asportare il pezzo circolare di tessuto (compreso il carnosus muscolo pannicolo). Il risultato sarà un tutto spessore avvolto con la fascia come base della ferita.
   NOTA: Il tessuto asportato (tappi ferita) può essere a scatto congelati in azoto liquido o fissati in 10% tamponata-formalina O / N per l'elaborazione successiva come il controllo, la pelle normale.
3. Creare un lembo bipedicled facendo incisioni con un bisturi sterile su ogni lato delle ferite ischemiche lungo le linee pre-elaborato (Figura 1C) che sono 10,5 centimetri di lunghezza e 3,0 centimetri di distanza. La profondità delle incisioni dovrebbe essere giù ai muscoli paraspinali. Utilizzando forbici iris, separare la fascia pannicolo carnosus dai muscoli paraspinali, facendo attenzione a mantenere intatta la "base" dei punzoni 6 millimetri la fascia (FIGURA 1D).
4. Prendere 1 sterile foglio di silicone pre-tagliati e posizionarlo tra la fascia pannicolo carnosus e muscoli paraspinali (Figura 1E) assicurando che il foglio non fibbia o piegare. Usando nero, suture non assorbibili (formato 4.0) chiude entrambi incisioni ancorando il foglio di silicone per la pelle con almeno 8 interrotte punti su ciascun lato, lungo la lunghezza del lembo (Figura 1F ed 1G).
5. Utilizzando un sterili monouso punzone biopsia, creare due controllo ferite "non-ischemici" interni (fino alla fascia anteriore del muscolo carnosus panniculus) 1 cm lateralmente alle ferite ischemici su entrambi i lati del lembo (Figura 1G).
6. Posizionare un righello sotto le ferite e scattare foto digitali per scopi di misurazione della ferita (vedi Figura 3A). In questo momento, il flusso di sangue (perfusione) può essere monitorato utilizzando Doppler laser o altre manipolazioni (collocamento farmaco topico) eseguite.
7. Applicare un adesivo liquido approvato sia craniale e caudale per le ferite e una pellicola trasparente spogliatoio per mantenere l'ambiente umido e pulito (sterile). Una medicazione supplementare può essere posizionato all'estremità caudale del lembo per impedire all'animale di rimuovere le suture più caudale.

Procedure 5. post-operatorie

1. Inserire animali in gabbia (singolarmente alloggiati) dotati di alimentatori superficiale in modo da prevenire il sito chirurgico da sfregamento contro l'alimentatore. Gli animali non devono essere lasciati incustoditi o restituiti alla compagnia di altri animali fino a che riprendano conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale ed esibire movimento deciso. Tappeti di riscaldamento devono essere posti sotto la metà della gabbia per un massimo di due giorni durante il recupero.
2. Per gestire il dolore post-operatorio, amministrare Ketoprofene (5 mg / kg) per via sottocutanea per gli animali al mattino e 1 volta al giorno successivo per la post-intervento chirurgico fino a 48 ore. Gli animali devono essere monitorati ogni giorno persegni prolungati di dolore, perdita di peso o infezioni del sito chirurgico.

6. Misure Ferita successive e cambi di medicazione

1. Misurare ferite ischemiche e non ischemiche spesso in anestesia generale con isoflurano al 3% -4% tramite una camera di induzione e mantenuto (tramite un cono) al 1% -2% di O ₂ come al punto 3.1.
2. Rimuovere delicatamente la medicazione per non tirare l'adesivo dalla pelle. In questo momento altre foto digitali sono prese per le misure della ferita, i trattamenti topici ri-applicati, laser Doppler Imaging (LDI) o altre manipolazioni effettuate in base alle esigenze del ricercatore.
3. Applicare l'adesivo e una medicazione pulita e permettere all'animale di recuperare come al punto 5.1.

7. Ferita Collection e l'eutanasia

1. Harvest ischemica e le ferite non ischemiche (nei giorni sperimentatore ritenga necessari), mentre l'animale è in anestesia generale con isoflurano al 3% -4% tramite un indCamera uzione e mantenuto (tramite un cono) al 1% -2% di O ₂ come al punto 3.1.
2. Usando un bisturi, fare una escissione di forma quadrata attorno alla ferita per includere qualche tessuto sano intorno alla ferita. Posizionare il escissione in un 1,5 ml scatto tubo cap e scatto congelamento in azoto liquido (conservare a -80 ° C) per l'analisi molecolare futuro o incubare nel 10% formalina tamponata O / N a RT per l'elaborazione istologica.
   NOTA: Le escissioni ferita possono essere tagliati a metà per fornire più campioni per l'analisi.
3. Dopo la rimozione del tessuto della ferita, eutanasia l'animale con il metodo approvato CO ₂ inalazione.

Risultati

Il protocollo di ratto ischemico modello guarigione dovrebbe durare circa 20 minuti per ogni animale se eseguita in modo efficiente. Prima dell'applicazione di una medicazione modello dovrebbe apparire come rappresentato nella figura 1G. Sarà importante verificare che il lembo e ferite bipedicled ivi sono ischemico. Tensione di ossigeno sottocutaneo (PSCO ₂₎ a livello delle ferite è stata misurata durante la convalida del modello ⁵ posizionando un elettrodo polarografico nel ...

Discussione

La guarigione delle ferite nei ratti è stata spesso oggetto di dibattito a causa della loro capacità di guarire le ferite infette e alto tasso di variabilità interanimal ^5. Uno degli obiettivi originali del modello durante il suo sviluppo è stato quello di ridurre questa variazione. Modifiche alla larghezza del lembo, riducendo il numero di ferite con posizionamento specifico (centrate sul lembo con coerente posizione cranio-caudale) e l'introduzione di una carta siliconata ha compiuto questo ob...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128