Демонстрация Крыса ишемической кожной раны модели

Резюме

Крыса, из-за его размера, доступности и достаточно послушный поведения, был использован в качестве модели исследования на протяжении многих лет. Цель этого протокола заключается в использовании крысу ишемического кожи модели заживления раны, чтобы обеспечить ценную информацию о патофизиологии хронических ран.

Аннотация

Склонность к хронических ран у человека увеличивается с возрастом патологических состояний, таких как диабет и нарушения функции сердечно-сосудистой и беспросветной давление из-за неподвижности. Животные модели были разработаны, что попытка имитировать эти условия с целью углубления нашего понимания сложности хронических ран. Модель, описанная здесь, крыса ишемическая кожа лоскут модель, которая позволяет длительное снижение кровотока в результате ранений, которые становятся ишемическая и напоминают хронический раны фенотип (снижение васкуляризации, повышение воспаление и задержки заживления раны). Она состоит из bipedicled спинной створки с 2 ишемических ран, расположенных в центре и 2 неишемических ран латеральнее лоскута в качестве контрольной группы. Новым добавлением к этому ишемической модели кожного лоскута является размещение силиконового листа под клапаном, который функционирует как барьер и шину для предотвращения реваскуляризация и снизить усадку как заживление ран. Несмотря наОбсуждение на крысах для заживления ран обучение в связи с их совершенно разных анатомических и физиологических различий по сравнению с людьми (например, наличие panniculus carnosus мышцы, короткий жизненный период, увеличение числа волосяных фолликулов, и их способность исцелять инфицированных ран) модификации, используемые в этой модели сделать это полноценной альтернативой ранее разработанных ишемических моделях кожного лоскута.

Введение

Эффективное развитие наркотиков и другими заживлении ран терапия требует необходимости в моделях естественных условиях, несмотря на известные проблемы в переводе выводы на животных моделях для человека терапии ^1. Далее следует описание подробный протокол для использования крысиной модели ишемического кожи заживление ран, чтобы исследовать механизмы, которые в дальнейшем понимание патологического заживления ран. Виды крыса, часто используемые из-за его широкой доступности, размера и покладистый характер используется для заживления ран исследований, так как достаточно большой, чтобы обеспечить подходящую поверхность кожи для разреза и эксцизионная ранения, изображений и коллекции тканей ^2. Однако следует принимать во тщательного рассмотрения, что кожа крысы и человека отличаются анатомически, с крысы именуются сыпучих кожей животных. Эта отличительная характеристика позволяет контракции раны, а не эпителизации внести значительный вклад в закрытие кожи крыс шounds ^2. Кроме того, наличие подкожной panniculus carnosus мышцы у крыс, способствует заживлению путем сжатия как и коллагена формирования ^3,4. Эти очень важные анатомические различия были рассмотрены в развитии ишемии у крыс модели кожной раны, и были осуществлены определенные модификации, чтобы снизить сжатие раны и уменьшить влияние panniculus carnosus мышцы ^5.

В диабетических язв стопы, трофических язв и пролежней, лечение затягивается, и эти раны считается хроническим. Раны характеризуются чрезмерной воспаление, которое предотвращает рану от прогрессирующих до следующих этапах заживления ран ^6. Одним из главных факторов в развитии хронической раны локализован ишемии тканей (снижение кровотока) ⁵ вклад в неспособности очистить воспаление. В то время, в течение которого эта модель в настоящее время разработаны и утверждены (в 2003-4), Не было никаких стандартизированных моделей животных, которые могли бы обеспечить достаточно ткани, чтобы проверить индукции ангиогенеза в ране, ключевой этап в процессе нормального заживления раны и мотивации для разработки этой модели ^5. Тем не менее, представленная здесь модель является модификацией модели ишемии раневой первоначально описанной Шварц и др. ⁷ и затем использовали в модифицированном виде Ченом и др. ⁸

В модифицированной ишемической модели раны, были внесены изменения, чтобы обойти вышеуказанные анатомические характеристики крысы, которые приводят к заживлению сжатием, а не эпителизации: (1) Два полных толщины эксцизионная раны создаются в bipedicled клапаном спинной кожи и panniculus carnosus мышцу удал ют из раны кровати рассечения чуть выше мышечной фасции. (2) сам клапан имеет более узкие размеры, гарантируя, что кровоснабжение является случайным и раны, расположенные в середине тон заслонки ишемическая. (3) силиконовые лист вставлен под клапаном, предотвращая readherence и реперфузии заслонки от основной ткани. Сокращение раны ограничено (и не устранены) крепления или ушивание лоскута силиконовый лист ^5.

Модель недавно использовалась в исследованиях, начиная от гипербарической эффектов кислорода на ишемической заживления ран ^9,10 ишемической заживления ран у молодых против старых крыс ¹¹ и оказалась надежная модель длительного ишемии тканей. Размеры bipedicled заслонки были также адаптированы к различным линий крыс, в том числе Sprague Dawley (длиной 11 см и 2 см в ширину) и F344 крыс (длинный 10,5 см и 3,0-3,5 см шириной) и другие виды, в том числе свиней ¹² и мышей ^13,14. Это видео использует F344 инбредных крыс напряжение в демонстрации ишемической модели кожной раны.

Утверждение для всех процедур животных, представленных ниже, был получитьред из Университета комитета Южной Флориды Уход за животными (IACUC) и соблюдать все требования Закона об охране животных и Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Утверждение для всех процедур животных, представленных ниже, была получена из Университета комитета Южной Флориды Уход за животными (IACUC) и соблюдать все требования Закона об охране животных и Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка силиконовые листы и хирургические инструменты

1. Каркасные полосы (10,5 см х 3,0 см), не усиленный 0,01 толщину, медицинского силикона простыни и стерилизовать в автоклаве.
2. Очистите и стерилизовать подходящие хирургические инструменты (ножницы, щипцы и шторы или полотенца, чтобы создать стерильное поле во время операции).

2. Экспериментальные животные

1. Используйте для взрослых самок и самцов крыс весом в диапазоне от 250-350 г полученного от коммерческого селекционера. Если в возрасте крыс используются, они должны быть ≥350 г в целях обеспечения лучшей выживаемости после операции. Перед началом каких-либо экспериментов акклиматизироваться всех животных, по крайней мере,7 дней в стандартных условиях 12 ч свет-темнота цикла с пищей и водой вволю.

3. Анестезия, Pre-оперативная Обезболивание и оперативной подготовки

1. Общей анестезии с использованием изофлуран на уровне 3% -4% с помощью индукционной камеры и поддерживать (через использование носового конуса) на 1% -2% с O ₂ при подготовке кожи и хирургии. Мониторинг глубины анестезии при наблюдении частоты и глубины дыхания, межпальцевых травмировать или глазной мерцания рефлекса.
   Примечание: В это время, ветеринар мази могут быть размещены на глаз, чтобы предотвратить сухость в то время как животное находится под анестезией.
2. В месте, удаленном от стерильной хирургической области, поместите крысы в ​​положении лежа и брить спинки с садовыми ножницами из основания шеи вниз примерно 11 см. Трафарет с перманентным маркером, план для 3,0 см х 10,5 см клапаном (рис 1а).
3. Перемещение крысы чистой, назначенного surgicaл зона с утвержденным грелку и стерильных хирургических салфеток или полотенца. Подайте 5 мг / кг Кетопрофен подкожно до первых хирургических разрезов для лечения боли. Дополнительные жидкости (физиологический раствор) могут быть предоставлены (до 5 см), подкожно, как это необходимо.
4. Подготовьте кожу дополнительно моечные сначала 70% изопропилового спирта и второй с 0,2% хлоргексидина, а затем применить стерильные шторы, чтобы создать стерильное поле. 10% повидон-йод (Бетадин) также может быть использован.
   Примечание: антибиотиками (ампициллин в количестве 15 мг / кг) можно вводить подкожно, но если используются хорошие асептические методики не требуется.

4. Создание Эксцизионная раны и Bipedicled Flap

1. С помощью стерильной, одноразовые 6 мм инструмент биопсии удар, создают две круговые "ишемические" раны в центре обозначенной области закрылка (Фиг.1В). Глубина раны должны быть до (не до конца) основной фасция panniculus КарноSUS мышцы (рис 1B вставка).
2. Использование щипцов поднять кожу в середине контура раны, создаваемого пункционную биопсию, а затем использовать диафрагмы ножницы (с изогнутыми наконечниками) для вырезания круговой кусок ткани (в том числе panniculus carnosus мышцы). Результатом будет полный Толщина намотаны с панелью в качестве основания раны.
   Примечание: Иссеченную ткани (раневые заглушки) могут быть быстро замораживали в жидком азоте или фиксировали в 10% забуференном формалине-O / N для последующей обработки в качестве контроля, нормальной кожи.
3. Создание bipedicled клапан, делая надрезы со стерильным скальпелем с каждой стороны ишемических ран вдоль предварительно обращено линий (рис 1c), которые 10,5 см в длину и 3,0 см друг от друга. Глубина надрезов должна быть до paraspinous мышц. Использование диафрагмы ножницами, отделить panniculus carnosus панель из paraspinous мышц, будьте осторожны, чтобы фасции нетронутыми, как "база" ММ ударов 6 (Figure 1D).
4. Принимать по 1 стерильный силиконовый лист нарезанные и поместите его между panniculus carnosus фасции и paraspinous мышц (рис 1E) обеспечение того, лист не пряжки или сбросить карты. Использование черной, не рассасывающиеся нити (размер 4,0) закрыть оба разрезы анкерными силиконовый лист на кожу, по меньшей мере 8 прерванных стежков на каждой стороне, вдоль длины крылышка (фиг 1F и 1G).
5. С помощью стерильной, одноразовые биопсии инструмент удар, создают две внутреннего контроля "не-ишемические" раны (вплоть до передней фасции panniculus carnosus мышцы) 1 см латеральнее ишемических ран по обе стороны от клапана (фиг 1G).
6. Поместите линейку ниже раны и делать цифровые фотографии для заживления целей измерения (рис 3а). В это время, кровотока (перфузии) можно контролировать с помощью лазерного доплеровского или других манипуляций (местное размещения препарат), выполненных.
7. Применить утвержденный жидким клеем и краниально и каудально к ранам и прозрачная пленка одеваться, чтобы сохранить окружающую среду раны влажные, чистые (стерильный). Дополнительным туалетный могут быть размещены на хвостовом конце клапана, чтобы предотвратить животное от удаления наиболее хвостовые швов.

5. Послеоперационные процедуры

1. Поместите животных в клетках (по отдельности размещены), оснащенных мелких питателей, чтобы предотвратить хирургическую сайт от трения против подачи. Животные не должны оставаться без присмотра или вернулся в компанию других животных, пока они не восстановить достаточный сознание, чтобы сохранить грудины лежачее положение и выставлять целенаправленное движение. Нагревательные маты должны быть помещены под половине клетки до 2 дней, в течение восстановления.
2. Для управления боль после операции, управлять кетопрофен (5 мг / кг) подкожно животных следующее утро и 1 раз в день в течение до 48 ч после операции. Животные тоже должны контролироваться ежедневно в течениедлительные признаки боли, потеря веса или хирургических инфекций.

6. Последующие измерения раны и Отделочные Изменения

1. Измерьте ишемических и неишемические раны часто под общим наркозом с использованием изофлуран на уровне 3% -4% с помощью индукционной камеры и поддерживается (с помощью носового конуса) на 1% -2% с O _2, как в шаге 3.1.
2. Снимите повязку мягко, чтобы не тянуть клея от кожи. В это время дополнительные цифровые фотографии взяты для измерения раны, актуальные лечения вновь применен, лазерная допплеровская томография (МИГ) и другие манипуляции, выполняемые в соответствии с потребностями следователя.
3. Нанесите клей и чистой повязки и позволяют животному восстановить, как в шаге 5.1.

7. рана Сбор и Эвтаназия

1. Урожай ишемических и неишемические раны (в дни следователь сочтет это целесообразным), а животное находится под общей анестезией изофлуран на уровне 3% -4% через Indед ен ие камера и поддерживается (с помощью носового конуса) на 1% -2% с O _2, как в шаге 3.1.
2. Использование скальпеля, сделать квадратной формы иссечение вокруг раны, чтобы включить некоторые здоровые ткани вокруг раны. Поместите иссечение в 1,5 мл оснастки колпачок трубки и оснастки замораживание в жидком азоте (хранить при -80 ° С) для последующего анализа или молекулярного инкубировать в 10% забуференном формалине O / N при комнатной температуре в течение гистологической обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: раны иссечения также могут быть снижены в два раза, чтобы обеспечить больше образцов для анализа.
3. После заживления удаления ткани, усыпить животное с использованием утвержденной метод CO ₂ ингаляции.

Результаты

Протокол крыса ишемическая модели заживления раны занимает приблизительно 20 мин на одно животное, если оно проводится эффективно. Перед нанесением соус модели должны появиться как показано на рисунке 1G. Важно, чтобы убедиться, что bipedicled заслонки и раны в нем ишемическая. Подк?...

Обсуждение

Заживление ран у крыс часто предметом обсуждения в связи с их способностью исцелять инфицированных ран и высокий уровень interanimal изменчивости ^5. Один из первоначальных целей моделью во время его разработки было уменьшить этот вариант. Изменения в ширину створки, уменьшая колич...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128