Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

Resumo

O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas.

Resumo

A propensão para feridas crônicas em humanos aumenta com a idade, condições de doenças como diabetes e função cardiovascular prejudicada e pressão unrelieved devido à imobilidade. Os modelos animais têm sido desenvolvidos que a tentativa para imitar estas condições para o propósito de promover a compreensão da complexidade de feridas crónicas. O modelo aqui descrito é um modelo de rato de isquemia aba de pele que permite uma redução prolongada do fluxo sanguíneo resultando em feridas que se tornam isquémica e se assemelham a um fenótipo ferida crónica (vascularização reduzida, aumento de inflamação e de encerramento de feridas retardada). Ele consiste de um retalho dorsal bipediculado com 2 feridas isquêmicas colocados centralmente e 2 feridas não-isquêmicas lateral à aba como controles. Uma nova adição a este modelo isquémico aba de pele é a colocação de uma folha de silicone sob a aba que funciona como uma barreira e uma tala para prevenir e reduzir a contração revascularização como as feridas cicatrizam. Apesar dodebate de usar ratos para estudos de cicatrização de feridas devido a suas diferenças anatômicas e fisiológicas bastante distintas em comparação com os seres humanos (ou seja, a presença de um músculo panniculus carnosus, curto tempo de vida, aumento do número de folículos pilosos, e sua capacidade de curar as feridas infectadas) as modificações empregadas neste modelo o tornam uma alternativa valiosa para modelos retalhos cutâneos isquêmicos anteriormente desenvolvidos.

Introdução

Desenvolvimento de medicamentos eficazes e outras terapêuticas de cura de feridas requerem adequada em modelos in vivo, apesar dos problemas conhecidos em traduzir achados em modelos animais para terapias humanas ^1. O que se segue é uma descrição de um protocolo detalhado para a utilização de um modelo de rato da cicatrização de feridas isquémico para investigar os mecanismos que ainda mais a compreensão da cicatrização de feridas patológico. As espécies de rato, muitas vezes empregadas devido à sua ampla disponibilidade, tamanho e natureza dócil é usado para estudos de cicatrização de feridas, pois é grande o suficiente para fornecer uma área de pele adequada para ferir incisional e excisional, imagem e coleta de tecido ^2. No entanto, deve ser tido em consideração que o cuidado da pele de um rato e um ser humano são anatomicamente diferente, com ratos a ser referido como animais de pele soltas. Esta característica distinta permite a contração da ferida, ao invés de epithelialization de contribuir significativamente para o encerramento da pele do rato wounds ^2. Além disso, a presença de um músculo panículo carnoso subcutânea em ratos, contribui para a cura por ambos contracção e formação de colagénio ^3,4. Estas distinções anatómicas muito importantes que foram considerados no desenvolvimento do modelo de ferida cutânea do rato isquémica e modificações específicas foram implementadas para diminuir contracção da ferida e reduzir a influência do panículo carnoso muscular ^5.

Em úlceras de pé diabético, úlceras venosas e úlceras de pressão, a cura é atrasada e essas feridas são consideradas crônicas. As feridas são caracterizadas pela inflamação excessiva, o que impede a ferida de progredir para as próximas fases do reparo de feridas ^6. Um dos principais factores no desenvolvimento de uma ferida crónica é localizada isquemia tecidual (fluxo sanguíneo reduzido) ⁵ contribui para a incapacidade para limpar a inflamação. No momento em que este modelo foi sendo desenvolvida e validada (em 2003-4), Não havia modelos animais padronizados que poderiam fornecer tecido suficiente para testar a indução de angiogênese no leito da ferida, um processo importante durante a cicatrização normal e a motivação para o desenvolvimento deste modelo ^5. Dito isto, o modelo aqui apresentado é uma modificação do modelo de ferimento isquémico originalmente descrito por Schwartz et ai. ⁷ e posteriormente utilizado na forma modificada por Chen et al. ⁸

No modelo de ferida isquêmica modificado, as alterações foram feitas para contornar as características anatômicas mencionadas acima do rato que levam à cura pela contração ao invés de epithelialization: (1) duas feridas por excisão de espessura total são criadas dentro de uma aba e da pele dorsal bipediculado músculo panículo carnoso é removido do leito da ferida por meio de dissecção logo acima da fáscia muscular. (2) A aba em si tem dimensões mais estreitas, garantindo que o fornecimento de sangue é aleatório e as feridas localizadas no ponto central de tele aba são isquêmicos. (3) A folha de silicone é inserida abaixo da aba, impedindo readherence e reperfusão do retalho de tecido subjacente. Contração da ferida é limitada (não eliminados), ancorando ou suturar o retalho para a folha de silicone ^5.

O modelo foi recentemente utilizada em estudos que vão desde efeitos oxigênio hiperbárico sobre ferida isquêmica cura ^9,10 para a cicatrização de feridas isquêmica em jovem contra ratos com idade entre ¹¹ e provou ser um modelo confiável de isquemia tecidual prolongada. As dimensões da aba bipediculado também foram adaptados para diferentes estirpes de ratos, incluindo Sprague Dawley (11 cm de comprimento por 2 cm de largura) e ratos F344 (10.5 cm por 3,0-3,5 cm de largura) e outras espécies, incluindo ratos e porcos ^{12 13,14.} Este vídeo utiliza o F344 estirpe, ratos na manifestação do modelo de pele ferida isquêmica.

Aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foi obtered da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

Protocolo

NOTA: A aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foram obtidos a partir da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação de folhas de silicone e instrumentos cirúrgicos

1. Tiras pré-cortadas (10,5 cm x 3,0 cm), de não reforçado 0,01 espessura, folhas de silicone de grau médico e esterilizar utilizando uma autoclave.
2. Limpar e esterilizar instrumentos cirúrgicos adequados (tesouras, pinças e cortinas ou toalhas para criar um campo estéril durante a cirurgia).

2. Animais Experimentais

1. Use adulto masculino ou ratas com peso na faixa de 250-350 g obtido a partir de um criador comercial. Se ratos idosos são utilizados, eles devem ser ≥350 g, a fim de garantir uma melhor sobrevivência pós-cirurgia. Antes do início de todas as experiências os animais aclimatizar durante, pelo menos7 dias em condições normais de um ciclo de luz-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

3. A anestesia, analgesia pós-operatória e Preparação operativo

1. Induzir a anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e manutenção (através da utilização de um cone de nariz) a 1% -2% com _O2 durante a preparação da pele e cirurgia. Monitore a profundidade da anestesia pela observação do ritmo e profundidade da respiração, pitada interdigital ou palpebral reflexo de piscar.
   NOTA: neste momento, uma pomada veterinário pode ser colocado sobre os olhos para evitar a secura, enquanto o animal está sob anestesia.
2. Em uma remota localização da área cirúrgica esterilizada, coloque o rato em decúbito ventral e raspar o dorso com clippers a partir da base do pescoço para baixo cerca de 11 cm. Stencil com marcador permanente, o esboço para o 3,0 centímetros x 10,5 centímetros aba (ver Figura 1A).
3. Mova o rato para, um surgica designado limpol área equipada com uma almofada de aquecimento aprovado e campos cirúrgicos estéreis ou toalhas. Injetar 5 mg / kg por via subcutânea cetoprofeno antes das primeiras incisões cirúrgicas para tratamento da dor. Os fluidos adicionais (solução salina) pode ser determinado (máximo de 5 cc) por via subcutânea, conforme necessário.
4. Prepare a pele ainda mais limpando primeiro com 70% de álcool isopropílico e em segundo lugar com 0,2% de clorexidina, em seguida, aplicar campos estéreis para criar um campo estéril. 10% de povidona-iodo (Betadine) também pode ser usado.
   NOTA: Um antibiótico (ampicilina a 15 mg / kg) pode ser administrado por via subcutânea, mas, se forem utilizadas técnicas assépticas boas, não é necessário.

4. Criação de Feridas excisional e bipediculado Flap

1. Usando um, descartável 6 milímetros ferramenta biópsia estéril, crie duas circulares feridas "isquêmicos" no centro da área do retalho designado (Figura 1B). A profundidade da ferida deve ser até (e não através) a fáscia do panículo Carnosus músculo (Figura 1B inserção).
2. Usando fórceps levantar a pele no meio do contorno da ferida criada pelo perfurador de biópsia e, em seguida, utilizar tesouras íris (com pontas curvas) para excisar a peça circular de tecidos (incluindo o músculo panniculus carnosus). O resultado será um de espessura total da ferida com a fáscia como a base da ferida.
   NOTA: O tecido excisado (tampões de feridas) pode ser congelado rapidamente em azoto liquido ou fixadas em 10% de formalina tamponada com O / N para processamento posterior, como controlo, a pele normal.
3. Criar uma aba bipediculado fazendo incisões com um bisturi estéril em cada lado das feridas isquémicas ao longo das linhas de pré-retiradas (Figura 1C) que são 10,5 centímetros de comprimento e 3,0 cm de distância. A profundidade das incisões deve ser baixo para os músculos paraspinous. Usando uma tesoura de íris, separar o fascia panniculus carnosus dos músculos paraspinous, tomando cuidado para manter a fáscia intacto como a "base" dos mm socos 6 (Figura 1D).
4. Tome uma folha de silicone pré-corte estéril e colocá-lo no meio da fáscia panniculus carnosus e os músculos paraspinous (Figura 1E), assegurando que a folha não está torto ou desistir. Usando preto, suturas não absorvíveis (tamanho 4.0) fechar as duas incisões, ancorando a folha de silicone para a pele, com pelo menos 8 interrompidos pontos de cada lado, ao longo do comprimento da aba (Figura 1F e 1G).
5. Utilizando uma ferramenta de punção de biópsia descartável estéril, criar duas feridas de controlo "não-isquémicos" internos (para baixo para a face anterior do músculo panículo carnoso) lateralmente a 1 cm dos ferimentos isquémicos em cada lado da aba (Figura 1G).
6. Coloque uma régua abaixo as feridas e tirar fotos digitais para fins de avaliação da ferida (ver Figura 3A). Nesta altura, o fluxo sanguíneo (perfusão) pode ser monitorizada por utilização de Doppler a laser ou outras manipulações (colocação tópica do fármaco) realizadas.
7. Aplique um adesivo líquido aprovado tanto cranial e caudal para as feridas e uma película transparente vestir para manter o ambiente húmido e limpo (estéril). Um curativo adicional pode ser colocado na extremidade caudal da aba para impedir que o animal de remover as suturas mais caudal.

Procedimentos 5. pós-operatórias

1. Colocar os animais em gaiolas (alojados individualmente) equipados com alimentadores rasas, de modo a impedir que o local cirúrgico de fricção contra o alimentador. Os animais não devem ser deixados sozinhos ou devolvido à companhia de outros animais, até que recupere a consciência suficiente para manter decúbito esternal e apresentam movimento proposital. Esteiras de aquecimento deve ser colocado sob a metade da gaiola para até 2 dias durante a recuperação.
2. Para controlar a dor no pós-operatório, administrar cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea aos animais pela manhã e 1x por dia seguinte para até 48 horas pós-cirurgia. Animais também devem ser monitorados diariamente porsinais prolongados de dor, perda de peso ou infecções de sítio cirúrgico.

6. Medidas feridas subsequentes e troca de curativos

1. Medir feridas isquémicas e não isquémicos frequentemente sob anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O ₂ como no passo 3.1.
2. Remover o penso suavemente a não puxar o adesivo da pele. Neste momento fotos digitais adicionais sejam tomadas para medições ferida, tratamentos tópicos reaplicado, o Doppler laser (LDI) ou outras manipulações realizadas para atender às necessidades do investigador.
3. Aplique o adesivo e um curativo limpo e permitir que o animal possa recuperar como no passo 5.1.

7. Wound Recolha e eutanásia

1. Isquêmica Colheita e feridas não-isquêmicas (em dias o investigador considerar apropriada), enquanto o animal está sob anestesia geral com isoflurano em 3% -4% através de uma indução câmara e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O ₂ como no passo 3.1.
2. Utilizando um bisturi, fazer uma excisão em forma quadrada em torno da ferida para incluir algum tecido saudável em redor da ferida. Coloque a excisão em 1,5 ml de um tubo com tampa de encaixe e encaixe de congelação em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) para análise molecular futuro ou incubar em 10% de formalina tamponada O / N à temperatura ambiente durante o processamento histológico.
   NOTA: As excisões ferida também pode ser cortado pela metade para fornecer mais amostras para análise.
3. Após a remoção do tecido da ferida, a eutanásia do animal usando o método aprovado de inalação de CO _2.

Resultados

O protocolo de rato modelo cura isquêmico ferida deve demorar cerca de 20 min por animal se realizada de forma eficiente. Antes da aplicação de um penso, o modelo deve aparecer como representado na Figura 1G. Será importante verificar que a aba e as feridas bipediculado aí são isquémicos. Tensão de oxigénio subcutânea (PSCO ₂₎ ao nível das feridas foi medido durante a validação deste modelo ^5, colocando um eléctrodo polarográfico no tecido subcutâneo entre os dois f...

Discussão

A cicatrização de feridas em ratos tem sido muitas vezes objecto de debate, devido à sua capacidade de curar feridas infectadas e alta taxa de variabilidade interanimal ^5. Um dos objetivos originais do modelo durante o seu desenvolvimento foi para diminuir essa variação. Modificações na largura do retalho, reduzindo o número de feridas com posicionamento específico (centrada na aba com localização crânio-caudal consistente) e introdução de uma folha de silicone tem conseguido esse objetivo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sil-Tec medical grade sheeting	Technical Products Inc.	500-3	nonreinforced, 0.01 inches in thickness
Mini Iris scissors, 8 cm, curved, SS	World Precision Instruments	#503671
Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	1964G	black, size 4.0, PC-3 16 mm needles (3/8 circle)
Laser Doppler Imager	Moor Instruments	moorLDI2-IR	Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8
ImageJ	NIH	free download	http://rsb.info.nih.gov/ij/
Mastisol	Henry Schein	Cat # 7289210	Fisher Scientific NC9774929
Tegaderm	Medical Specialties	3M1624W	Fisher Scientific NC9922128