Die Transformation von probiotischen Hefe und ihre Erholung von Magen-Darm-Immun Geweben nach orale Gabe bei Mäusen

Zusammenfassung

Dargestellt ist hier die einheitliche Beschreibung von Techniken, die verwendet werden können, zu entwickeln, transformieren, zu verwalten und zu testen, die heterologe Proteinexpression der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii.

Zusammenfassung

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Einleitung

Probiotische Mikroorganismen sind eine interessante Potential mittels effizient und wirtschaftlich heterologer Proteine ​​an den Gastrointestinaltrakt zu liefern. Diese Organismen sind in der Lage Passage durch den Magen-Darm-Trakt zu überleben noch nicht kolonisieren es nicht ^ein, so dass kontrollierte Dosierung und Reduzierung der Belastung durch das Medikament zum Ausdruck gebracht. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, leicht, diese Organismen Ingenieur heterologen Proteins in großem Maßstab zu produzieren macht sie eine kostengünstige Alternative zu synthetischen Lieferung Partikel. Jedoch Entwicklung eines solchen Konzepts, wie kürzlich einen auxotrophen Stamm der probiotischen Hefe Saccharomyces boulardii ² gezeigt, verwenden, erfordert die Kenntnis von Labortechniken traditionell nicht innerhalb einer gegebenen Studie kombiniert, die von Hefen und Molekularbiologie Tierhandhabungstechniken und immunologische Verfahren. Obwohl also die sind beschrieben einzelnen Verfahren hier nicht in sich RomanLaborprotokolle ist das Ziel dieses Manuskripts eine einheitliche Einführung in Techniken zur experimentellen Erprobung probiotischer Hefen als Arzneimittelabgabevehikel zur murine Gastrointestinaltrakt erforderlich zu präsentieren. Vorausgesetzt ist eine Zusammenstellung der wesentlichen Protokolle für: 1) Erzeugung von auxotrophen Mutantenstämmen der Hefe, die leicht genetisch manipuliert werden kann; 2) Transformation von Hefe Kulturen zu exprimieren heterologes Protein; 3) Verabreichung von rekombinanten Hefe in den Darm durch orale Sondenfütterung; und 4) Wiederherstellung lebensfähiger rekombinanten probiotischen Hefe aus dem murinen Darm und die Bewertung ihrer heterologen Proteinexpression.

Erstens, obwohl zahlreiche positive und negative Selektionsverfahren für die Manipulation von Hefe-Spezies vorhanden sind, negative Selektion, wie durch die Verwendung von auxotrophen Markern erhöht sowohl die Effizienz und Leichtigkeit, mit der Hefe kann transformiert und selektiert werden. Positive Selektion von Transformanten Antibiotika, in Zusammenarbeit mitntrast, erhöht die Kosten für die Hefe-Manipulation. Weiterhin Auswahl von Hefe auf antibiotikahaltigen festen Medien können für erhöhtes Wachstum von nicht-transformierten Hintergrund Kolonien in Bezug auf Auswahl von auxotrophen Hefe auf synthetischen Tropfen aus festen Medien (unveröffentlichte Beobachtungen) ermöglichen. Auxotrophen Hefe-Stämme, die Enzyme von entscheidender Bedeutung für die Synthese von essentiellen Aminosäuren oder Uracil fehlt. Solche Hefen können nur mit dem fehlenden Metaboliten oder Stoffwechselgens, so dass, wenn negative Selektion ergänzt wachsen, wenn Hefe auf synthetischen Tropfen aus Medien plattiert ist, die die essentiellen Metaboliten fehlt. Viele häufig verwendete Saccharomyces cerevisiae Laborstämme sind in der Tat bereits auxotrophen Mutanten ^3. Industriellen, klinischen und probiotischen Hefestämme sind jedoch üblicherweise prototroph mit der Fähigkeit, alle erforderlichen Nährstoffe zu synthetisieren. So aktivieren effizienter genetische Manipulation solcher Hefe kann auxotrophen Gene ganz gezieltzu erzeugen, die ohne Antibiotika Stämme ausgewählt werden können. Spezifisches Targeting von auxotrophen Markergene können durch PCR-vermittelte Gen-Unterbrechung erreicht werden über eine homologe Rekombination zu verlassen oder in jüngerer Zeit durch CRISPR / Cas9 Targeting ^4-6. Alternativ können UV-Mutagenese schnell auxotrophen Mutanten auch in Hefestämmen erzeugen, für die Transformation mit mehreren Plasmiden ⁷ technisch schwierig ist. Während PCR-Targeting und CRISPR / Cas9 haben ausführlich an anderer Stelle beschrieben worden ist, in Teil präsentiert eine dieser Handschrift ein detailliertes Protokoll ist ein UV-Mutagenese-Ansatz beschreibt auxotrophe Stämme zu schaffen, die für die negative Selektion erlauben, anstatt positive Antibiotika-Selektion von Hefe-Transformanten.

Der nächste Schritt in der notwendigen Verwendung des auxotrophen Stämme für die orale Verabreichung von heterologen Protein ist Hefe-Transformation mit Plasmid-DNA. Seit der ersten erfolgreichen Transformation von Yeast Sphäroplasten für Saccharomyces cerevisiae 1978 berichtete ⁸ wurden zahlreiche Modifikationen charakterisiert worden, um die Effizienz zu erhöhen und die Leichtigkeit, mit der Hefe-Arten können genetisch modifiziert werden. Verwendung der Elektroporation für die erfolgreiche Transformation von DNA in S. cerevisiae wurde zuerst im Jahr 1985 beschrieben und ⁹ wurde durch Zugabe von 1 M Sorbit Inkubation osmotisch Stützzellen ¹⁰ seit verbessert. Elektroporation Effizienz ist zu den Hefearten und Dehnung gezeigt abzuhängen, Zellzahl und Wachstumsphase, Elektroporation Volumen Feldstärke weiterhin worden, und spezifische Puffer ^11. Lithiumacetat (LiOAc) Transformation, die ursprünglich von Ito et al. ^12, gehört zu den am häufigsten verwendeten Transformationsprotokolle, wie es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Weitere Analysen zeigten, dass die Effizienz der LiOAc Hefetransformation stark erhöht, wenn die Zellen in der mittleren logarithmischen Phase gesammelt werden,des Wachstums und in der Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) und DNA bei 42 ° C ¹² Hitzeschock. Inkubation von Voll intakte Hefe mit PEG ist wesentlich für eine effiziente Transformation, möglicherweise durch die Verbesserung der Befestigung von DNA an die Zellmembran wie auch über andere Auswirkungen auf die ^{Membran 13.} Lithium selbst erhöht auch die Durchlässigkeit von intakten Zellen ^14. Obwohl die meisten Labor S. cerevisiae-Stämme LiOAc Transformation leicht transformiert werden können, ^3, andere Hefearten effizienter werden können unter Verwendung alternativer Protokolle transformiert. Pichia pastoris, zum Beispiel die meisten effizient transformiert via Elektroporation statt LiOAc Transformation ^13. Entscheidend ist daher zu prüfen, multiple Methoden der Transformation und Inkubationszeiten und Reagenzienkonzentrationen zu optimieren, wenn sie genetisch eine nicht charakterisierte Hefestamm ändern versucht. Dieses Manuskript beschreibt somit sowohl LiOAc transformation und Elektroporation als Techniken für die Transformation der auxotrophen Mutante und Wildtyp S. boulardii. Interessierte Leser sind für eine gründliche Beschreibungen über die Entwicklung der Hefe-Transformation, alternative Protokolle und weitere Diskussionen über mögliche Wirkmechanismen ^13,15 auf die jüngsten Bewertungen gerichtet. Transformation von Hefe mit dem Plasmid ein leicht nachweisbares Protein codiert, ist weiterhin wesentlich für nachgeschaltete Tests, um eine geeignete Expression und Funktion des heterologen Proteins zu gewährleisten. Vielzahl verschiedener Proteine ​​kann in Abhängigkeit von dem Endzweck des therapeutischen Studie ausgewählt und die Antikörper zum Proteinnachweis durch Immunoblotting, ELISA und andere Techniken. Protokolle für diese Techniken gründlich anderswo ^16,17 beschrieben worden sind, und kann verwendet werden Niveaus von heterologen Proteinproduktion durch Vergleich mit Standardkurven von transformierten Hefe zu bestimmen. Für die Zwecke der Demonstration und zu zeigen,erfolgreiche Produktion eines sehr häufig verwendeten Protein in Hefe Biologie, stellt dieses Manuskript Transformation mit Plasmid-Codierung grün fluoreszierende Protein (GFP), die unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie zum anschließenden Nachweis ermöglicht.

Ebenso wichtig für die Herstellung von probiotischen Organismen, die heterologes Protein ist die richtige Verwaltung und Nachweis dieser Mikroorganismen in gastrointestinalen Geweben exprimieren, wie in Teilen drei und vier beschrieben. Verabreichung von rekombinanten Hefe per Schlundsonde ermöglicht die Abgabe von kontrollierten Mengen von Hefe direkt in den Magen, von der C57BL / 6-Mäuse von Erbrechen ¹⁸ natürlich nicht in der Lage sind. Allerdings, unsachgemäße Behandlung der Tiere und eine Magensonde kann zu Speiseröhrenschäden und Perforation, Magendurchbruch, Luftröhren Verwaltung führen und Aspirationspneumonie ^19,20. Schlechte Technik und Unerfahrenheit kann weiterhin Variabilität in murine Immunantworten und experimentelle resu erhöhenLTS, die zu den Tier Stress auf orale Gabe ^21,22 zugeschrieben wurden. Praxis in der richtigen Technik kann somit nicht nur Tier Beschwerden dämpfen, sondern auch Präzision der experimentellen Ergebnisse zu erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt und veranschaulicht die Behandlung der Tiere und orale Gabe für die Verwaltung der kontrollierten Dosen von rekombinanten Hefe.

Schließlich ist es wichtig, erfolgreiche Zustellung von rekombinanten Hefe zu bestätigen, indem lymphoide Gewebe auf das Vorhandensein von Hefen und heterologen Proteins zu analysieren. Die Magen-Darm-Gewebe, die Immun kann am einfachsten und vorhersehbar auf die Gegenwart von Hefe zu prüfen sind die Peyer-Plaques. Peyer-Plaques sind sekundären lymphatischen Organe entlang des Dünndarms, die wichtigsten Standorte der Schleimhautimmunantwort Induktion ²³ sind. Antigene aus dem Lumen sind durch transzellulär microfold (M) Zellen im Epithel überführt und in den Peyer-Plaques freigegeben, so umschließen Aussetzend Antigen-präsentierenden Zellen Lumen Inhalt Darm. Obwohl Partikelaufnahme über das Darmepithel kann auch durch Becherzellen erreicht werden, haben diese Zellen nur Partikel nehmen weniger als 0,02 & mgr; m im Durchmesser ²⁴ gezeigt. Transepithelialen Dendriten erstreckte sich von CD103 ⁺ dendritische Zellen (DC) auch kleine Partikel aus dem Darmlumen ²⁵ aufnehmen; gibt es jedoch noch keine Berichte zeigen, dass CD103 ⁺ DCs Partikel aufnehmen größer als Bakterien. Somit intakt probiotischen Hefe, des Durchschnittsgröße zwischen 3-6 um im Durchmesser, sind höchstwahrscheinlich durch M-Zellen aufgenommen zu werden und mit den Peyer-Plaques übertragen. Beschrieben ist hier ein Protokoll für die Sammlung und das Screening von Peyer-Plaques für lebensfähige rekombinante Hefen, obwohl dieses Verfahren auch leicht zur Auswertung Aufnahme von probiotischen Bakterien angepasst werden kann.

Zusammenfassend Beurteilung rekombinanten probiotischen Hefe für die Lieferung von dierapeutic Proteine ​​in den Darm erfordert Kenntnisse in Labortechniken der Molekularbiologie auf die Behandlung der Tiere und Immunologie überspannt. Präsentiert hier sind Protokolle für 1) die Erzeugung und das Screening von auxotrophen Hefestämmen, die leicht negativ ohne Antibiotika ausgewählt werden können, 2) alternative Protokolle zu verwandeln Hefe und ermöglichen die Expression von heterologen Proteins, 3) Demonstrationen der richtigen Tierhandhabungstechniken und orale Gabe für intragastric Lieferung von rekombinanten Hefe, und 4) Protokolle für Patch Dissektion der Peyer und Screening für lebensfähige rekombinante Hefen und funktionellen heterologen Proteins. Zusammen werden diese Protokolle für die Erzeugung und Prüfung eines probiotischen Hefestamm ermöglichen Lage ist, an den Gastrointestinaltrakt heterologe therapeutische Protein zu liefern.

Protokoll

1. UV-Mutagenese zu generieren auxotrophen Hefestämmen

1. Geneüberlebenskurven benötigten Dosen von UV-Bestrahlung zu bestimmen
   1. Bereiten YPD (Hefeextrakt Pepton Dextrose) Medien und andere in Tabelle 1 Reagenzien nach Standardverfahren ^{26 und} inokulieren Einzelkolonien in 5-10 ml YPD-Medien. Inkubieren Kulturen auf einer Rolltrommel bei 30 ° CO / N für mindestens 8 Stunden bis zur Sättigung.
   2. Bestimmen die Zellkonzentration von O / N-Kulturen unter Verwendung eines Spektrophotometers von Zellen 1:10 in Wasser in einer Kunststoffküvette verdünnt. Verdünnte Zellen auf eine Konzentration von ^{10 7 Zellen} / ml in 20 ml sterilem destilliertem Wasser.
   3. Gießen verdünnten Zellen in eine sterile Petrischale aus Kunststoff und ist mit der Deckel abgenommen wird die Platte 14 cm unter einer UV-Lampe.
   4. Expose Zellen auf serielle 5.000 & mgr; J und 10.000 & mgr; J Dosen von UV-Bestrahlung, Extrahieren 500 ul Zellen nach jedem Inkrement so dass Zellenwerden nach der Belichtung mit 0 & mgr; J abgetastet, 5000 & mgr; J, 10.000 & mgr; J, 15.000 & mgr; J, 20.000 & mgr; J, 25.000 & mgr; J, 30.000 & mgr; J, 40.000 & mgr; J und 50.000 & mgr; J von UV-Bestrahlung. Transfer extrahiert Zellproben 1,5-ml-Röhrchen in sterile und seriell um 1:10 Schritten in sterilem Wasser verdünnen.
   5. Pellet Zellen in jeder Verdünnung durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 1 min. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren in einem Volumen von 100 ul sterilem Wasser geeignet für Hefezellen Überzug. Pipette das gesamte Volumen des resuspendierten Zellen auf Platten mit YPD festen Medien und eine sterile Treuer gleichmäßig Zellen in jeder Platte verteilen.
   6. Wickeln Plattenkanten in Parafilm zu verhindern Trocknung von Medien und Abdeckplatten in Alufolie zu verhindern Foto-Reaktivierung und Reparatur von UV-induzierte Mutationen. Die Platten der Oberseite nach unten bei 30 ° C für 2-4 Tage für das Wachstum der lebensfähigen Hefekolonien (Abbildung 1) zu ermöglichen.
   7. Zählen Sie die number von Kolonien, gegebenenfalls mit Hilfe eines Stiftes gezählt Kolonien zu markieren, einem Hand elektronischen Zähler Stift oder einer Gegenstand mit Vergrößerung. Plot als Prozentsatz der gesamten plattierten Zellen an jedem uJ Dosis von UV-Bestrahlung eine Überlebenskurve für bestrahlte Hefe (Abbildung 2) zu erzeugen.
      HINWEIS: haploid Hefe-Stämme können niedrigere Dosen von UV-Bestrahlung relativ zu diploiden Stämme erfordern dürfte die gleiche prozentuale Überlebensrate zu erreichen. Ein Hefestamm fehlt funktionellen DNA-Reparatur-Enzyme, wie die rad1 S. cerevisiae Mutante, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden, um die Anwesenheit von UV-Bestrahlung bei sehr niedrigen Dosen anzuzeigen.
   8. Bestimmen Sie die Dosis von UV-Mutagenese für das Screening verwendet werden, indem auf die Überlebenskurve Bezugnahme in 1.1.7 festgelegt. Der x-Wert des Punktes entlang der Überlebenskurve in dem y gleich 50 ist der UV-Bestrahlungsdosis, bei der 50% der Hefe überleben. kann in eine Folge Mutanten auf diesem niedrigen Prozent Überleben Screeninghöhere Ausbeute von Stämmen erfolgreich mutiert, insbesondere für diploide Hefe. Die 50% ige Überlebensdosis für WT S. boulardii, wie in 2 gezeigt ist, beträgt ca. 18.000 & mgr; J.
      Hinweis: Obwohl solch hohen UV-Dosen die Gefahr der Mutationen in Genen für zellulare andere Wege erhöhen als die auxotrophen Markergens von Interesse, muß dieser Nachteil gegen die Notwendigkeit ausgeglichen werden, um Mutationen in beiden Kopien des auxotrophen Markergens zu induzieren. Für haploide Stämme, in denen nur eine Genkopie muss mutiert werden, bei einer höheren prozentuale Überleben Screening, wie bei 90%, verringert das Risiko von zusätzlichen Mutationen und ermöglicht immer noch eine ausreichende Erzeugung von auxotrophen Mutanten.
2. UV-Mutagenese und Screening für auxotrophen Hefestämmen
   1. Bereiten Hefe als 1.1.1-1.1.3 in Schritten beschrieben.
   2. Expose Hefe zu der Dosis von UV-Bestrahlung auf 50% Überlebensrate entspricht, wie in 1.1.8 bestimmt. Für WT S. boulardii, diese Dosis was entschlossen, etwa 18.000 & mgr; J (Abbildung 2) sein.
   3. Sammeln 1 ml Volumina von UV bestrahlt Hefe und Pellet durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 1 min. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellen in 100 ul sterilem Wasser.
      1. Selektion von Mutanten
         1. Bei der Verwendung von Auswahl wie mit ura3 ^- auxotrophe Mutanten, bestrahlt Platte Hefe auf ein Medium, das 5-Fluororotinsäure (5-FOA) für Zellen auszuwählen, um eine funktionelle Ura3 Enzym fehlt.
            HINWEIS: Alle Hefe funktionsfähige Kopien von Ura3 enthält konvertiert 5-FOA zu dem Toxin 5-Fluorouracil, die zum Zelltod führen und erlaubt eine einfache Auswahl von ura3 - Kolonien, die eine funktionelle Ura3 ²⁷ fehlen. Analog Auswahl Ansätze sind möglich für die LYS2- und Lys5; TRP1 und MET2 und MET15 Marker-Medium, das α-aminoadipinsäure mit ^28; 5-FluorAnthranilsäure ^29; und Methylquecksilber ^30,31 auf.
         2. Pipette, um die 100 ul resuspendierten Zellen auf Minimalmedium, das 5-FOA und eine sterile Treuer gleichmäßig zu beschichten die Platte. Wickeln Platten in Parafilm und inkubieren der Oberseite nach unten bei 30 ° C für 2-4 Tage für das Wachstum der lebensfähigen Hefekolonien zu ermöglichen.
         3. Bestätigen Sie die ura3 ^- Phänotyp jeder Kolonie auf 5-FOA-Platten erscheinen, durch erneutes Ausstreichen auf YPD, Uracil ^- und 5-FOA-Platten (Abbildung 3). Verwenden Sie die Spitze einer sterilen Zahnstocher Teil einer einzigen Kolonie zu sammeln und ziehen Sie die Zellen vorsichtig über frisches YPD, Uracil ^- und 5-FOA-Platten. kopfüber bei 30 ° C für 2-4 Tage wieder eingewickelt Platten inkubiert.
            HINWEIS: Lebensfähige Kolonien werden als erhabene erscheinen, etwa kreisförmige Wucherungen während nicht lebensfähigen Zellen nur als undurchsichtig Abstrich ohne angehoben Wucherungen (Abbildung 3) angezeigt.
      2. screening von Mutanten
         1. Wenn eine auxotrophe Mutante zu erzeugen, für die Auswahlmethoden nicht verfügbar sind, verwenden Serien 01.10 Verdünnungen von UV Hefezellen in sterilem Wasser bestrahlt und die Verdünnungen auf YPD-Medium pipettieren, eine sterile Treuer mit der Platte gleichmäßig zu beschichten.
         2. Wickeln Sie Platten in Parafilm und Inkubation kopfüber bei 30 ° C für 2-4 Tage. Bestimmen Verdünnungs die für das Wachstum einzelner Kolonien erlaubt, die leicht voneinander unterschieden werden können, in der Regel nicht mehr als etwa 100 Kolonien pro Platte.
         3. Wiederholen UV-Mutagenese von Hefe Proben wie in 1.2.1-1.2.3 und Platte Zellen in diesem bestimmten Verdünnung beschrieben. Pipettieren der verdünnten Hefe auf YPD-Medien, eine sterile Treuer um die Zellen zu verteilen, und Inkubation gewickelt Platten kopfüber bei 30 ° C für 2-4 Tage.
         4. Bildschirm Auxotrophen durch Replika-Plattierung auf selektiven Medien, die Metaboliten von Interesse fehlt. Zunächst sichern eine sterile Samt-Pad auf einem Plattenhalterund drehen Sie die Platte mit UV-Licht bestrahlt Kolonien auf den Samt, Kennzeichnung der Plattenorientierung.
         5. Als nächstes invertieren eine frische Platte des Metaboliten von Interesse auf den Samt und leicht nach unten drücken zu übertragen Zellen aus der Samt an der Platte fehlt. Bewahren Sie die Originalplatte bei 4 ° C. Wickeln und Inkubation der neuen Platte den Kopf bei 30 ° C für 2-4 Tage.
         6. Als Alternative zu replica plating, Bildschirm Mutanten durch erneutes Streifen Kolonien aus YPD auf Selektivmedien. Verwenden Sie die Spitze einer sterilen Zahnstocher Teil einer einzigen Kolonie zu sammeln und die Zellen vorsichtig in ein frisches YPD-Platte und einer Platte ziehen Sie das Stoffwechselprodukt von Interesse fehlt. kopfüber bei 30 ° C für 2-4 Tage wieder eingewickelt Platten inkubiert.
            HINWEIS: Es muss Einzelkolonien und Streifen aus Kolonien mehrmals zu wählen ergriffen werden eine homogene Population von treuen auxotrophen Zellen zu bestätigen.
   4. Ferner bestätigen den Phänotyp von bestrahlten Zellen durch inoculating Einzelkolonien in 5-10 ml YPD beiden Medien und den entsprechenden Metaboliten fehlt (zB in Uracil ^- Medien für eine ura3 ^- Mutante). Inkubieren auf einem Rolltrommel bei 30 ° CO / N Wachstum von Zellen in YPD Medium zu bestätigen, aber nicht in der Abwesenheit des Metaboliten.
      Hinweis: Obwohl Wachstumsmuster auf festen Medien deutlich Hefe auxotrophen Status anzeigen sollte, ist es möglich, für einige Hefe Belastungen zu tolerieren und kleine, langsam wachsende Kolonien auf festen Medien bilden aber noch nicht die gleichen Bedingungen in flüssigen Medien (unveröffentlichte Beobachtungen) tolerieren. Inokulation in Flüssigkulturen sollten daher gründlich durchgeführt werden, um Wachstumsmuster von UV-Licht bestrahlt Mutanten bestätigen.
   5. Für die langfristige Lagerung von bestätigt auxotrophe Mutanten, Glycerin Aktien durch Impfen Zellen in 10 ml YPD und Inkubation auf einer Rolltrommel O / N bei 30 ° C vor. Pellet Zellen durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 2500 xg und absaugen Medien. Die Zellen in 50%steril filtriert Glycerin, Transfer in ein Kryoröhrchen, und bei -80 ° C.
      HINWEIS: UV mutagenisierten Hefe möglicherweise Mutationen in mehreren Genen außer in dem auxotrophen Marker von Interesse enthalten. Vor dem Fortfahren mit der Verwendung von auxotrophen Mutanten verifiziert, sollten diese Stämme weiter durch Gen-Sequenzierung und Bewertung der Beständigkeit relevant probiotischen Stämme auf pH, Gallensäure Spannungen und andere Eigenschaften untersucht werden, wie an anderer Stelle ² beschrieben. Zusätzlich Targeting Verwendung von PCR oder Homologie CRISPR / Cas9 mehr selektiv an auxotrophe Marker mutieren sollte als Alternative zur UV-Mutagenese ⁴ betrachtet werden ^{- 6.}

2. Hefe-Transformation

1. LiOAc Transformation von Hefe
   1. Inoculate einzelnen Hefekolonien in 5-10 ml YPD-Medium und Inkubation auf einer Rolltrommel bei 30 ° CO / N.
   2. Um logarithmischen Wachstumsphase induzieren und Effizienz des Plasmid-Aufnahme zu erhöhen, determine Zellkonzentration mit einem Spektralphotometer eine 1:10 Verdünnung der Zellen in sterilem Wasser in einem Plastik Küvetten zu messen. Verdünnte O / N Kulturen bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,16-0,2 (ca. 2 x 10 ^{6 bis 2,5} x ^{10 6 Zellen} / ml) in 50 ml frisches YPD warmen und inkubieren Zellen auf einem Orbitalschüttler Plattform auf 200 rpm eingestellt, bis die Kultur erreicht ca. 1 x ^{10 7 Zellen} / ml, in der Regel ca. 4 Stunden.
      HINWEIS: Die Transformationseffizienz als Funktion der Anzahl der erfolgreich transformierten Hefe koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ug Plasmid DNA gemessen werden. Höhere Effizienz führt zu mehr transformierte Kolonien pro ug Plasmid-DNA. Hefezellen und Sammlung während der logarithmischen Wachstumsphase Subkultur ist ein Faktor, der Transformationseffizienz ¹² erhöht.
   3. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 2.500 × g für 3 min.
   4. Den Überstand aspirieren und Übertragungszellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch die Pell Resuspendierenet in 1 ml sterilem Wasser.
   5. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 1 min in einer Mikrozentrifuge absaugen Überstand und wäscht die Zellen durch Resuspension in 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) Puffer.
   6. Wiederholen der Zentrifugation und Resuspendieren Zellen in TE / LiOAc Puffer auf eine Konzentration von 2 x ^{10 9 Zellen} / ml.
   7. Bereiten Transformation Mischungen mit jedem der folgenden: 50 ul der vorbereiteten Hefe in TE / LiOAc Puffer, 5 ul Träger-DNA (10 ug / ul) und 1 ul Plasmid-DNA (1 ug). Mikrogramm Plasmid-DNA kann als zunehmende Mengen an DNA titriert werden kann oder auch ^{32 bis} erhöhte Transformationseffizienz nicht dazu führen,
      HINWEIS: Für eine mutierten Hefestamm eine auxotrophe Marker fehlt, nur ein Plasmid, das die Marker kodieren, können pro Probe umgewandelt werden. Weiterhin wird die Verwendung eines Plasmids ein leicht nachweisbares Protein, wie etwa GFP codiert, wird für eine effiziente Bestimmung der korrekten Faltung und Expression heterologer pr ermöglichendurch den Hefestamm Anschluss an Transformation otein.
   8. Zu jedem Präparat, fügen 300 ul PEG / LiOAc / TE und Vortex gründlich. Inkubation der intakten Zellen mit PEG ist wesentlich für eine effiziente Transformation ^13.
   9. Inkubieren Zubereitungen bei 30 ° C für 30 min unter Rühren durch Mikrozentrifugenröhrchen in ein Becherglas gegeben, auf einem Orbitalschüttler bei 200 Plattform rpm platzieren.
   10. In 35 ul DMSO zu jeder Reaktion und Hitzeschock-Zellen für 15 Minuten in einem 42 ° C Wasserbad. Obwohl es DMSO widersprüchliche Berichte von dem zusätzlichen Vorteil, ^33, Hefezellen intakt Schock Wärme sind wurde ¹² gezeigten Transformationseffizienz erheblich steigern.
   11. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation über wie in 2.1.5 Pelletieren, Absaugen oder den Überstand Abpipettieren und Resuspendieren in 1 ml sterilem Wasser. Pipette vorsichtig nach oben und unten das Zellpellet zu zerbrechen.
       HINWEIS: Es ist wichtig, gründlich zu den Überstand, weil der Mediennutzung entfernend bei der Erzeugung von kompetenten Zellen können das Wachstum der Hefe und Koloniebildung hemmen.
   12. Wiederholen Zelle Pelletierung wie in 2.1.5, den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in 100 ul sterilem Wasser. Pipette das gesamte Volumen auf eine selektive Platte und eine sterile Treuer gleichmäßig zu beschichten die Platte mit transformierten Hefe.
   13. Wickeln Kanten des beschichteten Platten in Parafilm zu verhindern Trocknung von Medien und inkubieren der Oberseite nach unten bei 30 ° C für 2 Tage für das Wachstum von transformierten Hefezellen zu ermöglichen. Erfolgreiche und effiziente Transformation und auxotrophe Auswahl von Saccharomyces cerevisiae ergibt sich eine hohe Anzahl von Kolonien pro Transformationsansatz, obwohl Ausbeute viel niedriger für andere Stämme sein kann (Abbildung 4).
   14. Store Hefe Platten für kurzfristig (im Allgemeinen 1-3 Wochen) den Kopf gestellt und bei 4 ° C überzogen. Bereiten Glycerin-Stamm transformierter Hefe wie in 1.2.5 für die Langzeitlagerung beschrieben.
       HINWEIS: Weitere Studien Testen umgewandelt CFU sind notwendig Plasmid Stabilität und bewerten richtige Expression von heterologen Proteins zu bestimmen. Gründliche Beschreibung der Plasmidstabilität ^34, Verwendung von Immunoblotting denaturierte Proteine ​​aus Zellproben ^17, enzyme linked immunosorbent assay wiederhergestellt zu erkennen (ELISA) richtig ^{drei 16} dimensional Proteine ​​gefaltet zu erfassen, und die Verwendung von GFP in Hefe Studien ³⁵ an anderer Stelle zur Verfügung stehen. Figure 6 zeigt ein repräsentatives Bild der erfolgreichen GFP-Expression in transformierten S. cerevisiae in Bezug auf nicht-transformierten Zellen. Die Verwendung eines solchen fluoreszierenden Proteins ist ein Mittel zur effizienten erfolgreiche heterologe Proteinproduktion zu bestimmen.
2. Elektroporation von Hefe
   1. Inoculate einzelnen Hefekolonien in 5-10 ml YPD-Medium und Inkubation auf einer Rolltrommel bei 30 ° CO / N.
   2. Bestimmen Zellkonzentration mit einem Spektralphotometer eine 1:10 Verdünnung der Zellen in sterilem Wasser zu messen. diLaute O / N Kulturen in 100 ml frisches YPD warme Medium auf eine OD ₆₀₀ von etwa 0,3 Äquivalent. Inkubieren Subkulturen bei 30 ° C auf einem Orbital Plattform Schüttler bis 200 Umdrehungen pro Minute, bis eine OD ₆₀₀ von ca. 1,6 erreichte, in der Regel 4-5 Stunden. Jede 100 ml Subkultur genug Anlage Zellen für zwei Umwandlungsreaktionen erzeugen.
   3. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 2.500 × g für 3 min. Saugen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen durch in 50 ml eiskaltem sterilem Wasser resuspendiert. Wiederholen Sie die Wäsche von Zellen Pelletieren, Absaugen Überstand und Resuspendieren in frischem 50 ml eiskaltem sterilem Wasser.
   4. Pellet die Zellen wieder und resuspendieren in 50 ml eiskaltem Elektroporation Puffer (1 M Sorbitol, 1 mM CaCl _2).
   5. Wiederholen Spin wie in 2.2.3, absaugen Überstand und resuspendieren Zellen in 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Inkubieren Zellsuspension auf einer Rolltrommel bei 30 ° C für 30 min. Präinkubation von Zellen in LiOAc und DTT erhöht synergistisch dieEffizienz der Elektroporation ^36.
   6. Pellet die Zellen wie in 2.2.3, entfernen Überstand und wäscht mit 50 ml eiskaltem Elektroporation Puffer resuspendiert. Wiederholen der Zentrifugation und Resuspendieren Zellen in eiskaltem Elektroporationspuffer auf ein Endvolumen von 1 ml.
   7. Bereiten Sie sich auf Eis: Anlage Hefezellen, steril Elektroporationsküvetten und Plasmid-DNA. Unmittelbar nach der endgültigen Aufwirbelung von konditionierten Zellen in 1 ml Elektroporation Puffer, kombinieren 400 ul Anlage Hefezellen mit etwa 1 ug Plasmid-DNA, und fügen Sie zu einer eiskalten 0,2 um Elektroporationsküvette. Verwendung von erhöhten Mengen an DNA kann leicht Transformationseffizienz ¹¹ erhöhen. Inkubieren Reaktion auf Eis für 5 Minuten, dann mit -Elektroporator Satz auf 2,5 kV und 25 uF Elektroporation.
      HINWEIS: Wie in 2.1.7 beschrieben, eine mutierte Hefestamm eine auxotrophe Marker fehlen kann nur mit einem Plasmid, das die mutierte Marker pro Probe umgewandelt werden. Auch die Verwendung vonein Plasmid, das ein leicht nachweisbares Protein wie GFP ermöglicht eine effiziente Bestimmung der korrekten Faltung und Expression von heterologen Protein im Anschluß an Transformation kodiert.
   8. 1-Mischung von YPD:: Transfer-Zellen in 8 ml einer 1 elektroporiert 1 M Sorbit und erlauben Zellen bei 30 ° C für 60 min auf einer Walzentrommel inkubiert.
   9. Pellet-Zellen wie in 2.2.3 und resuspendieren in 100 ul 1: 1 YPD: 1 M Sorbit. Platte die volle Lautstärke auf selektiven Medien, die 1 M Sorbit, wickeln Kanten von Platten in Parafilm und inkubieren Platten Kopf bei 30 ° C für 2-5 Tage für das Wachstum von transformierten Hefezellen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, zu Test transformierten Hefe korrekte Expression von heterologen Protein zu bewerten, wie in 2.1.14 und 2.2.7 beschrieben.

3. orale Gabe von Mäusen mit transformierten Hefe

1. Führen Sie alle Tierpflege und Behandlungsprozeduren nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labor Einimals und Institutional Animal Care und Use Committee Genehmigung.
2. Bereiten O / N Hefekulturen durch einzelne Kolonien von transformierten auxotrophen Hefe in 5-10 ml selektiven Medien Impfen. Inkubieren Kulturen O / N bei 30 ° C auf einer Rolltrommel mindestens 8 Stunden für bis zur Sättigung.
   HINWEIS: Die Verwendung von Plasmid-Codierung Test Proteine ​​wie GFP zur Erleichterung der Proteinexpression Prüfung in eine Sonde Hefe ermöglichen wird, wie in 4.7 beschrieben.
3. Für maximale Induktion der Proteinexpression und der logarithmischen Wachstumsphase zu induzieren, bereiten Subkulturen vom O / N Kulturen bis zu einer OD ₆₀₀ von etwa 0,16 bis 0,2 Äquivalent in 50 ml von geeigneten Medien verdünnt wird, wie in 2.1.2 beschrieben.
4. Bestimmen der Konzentration der Zellen subkultiviert, wie in 1.1.2 und passen ^{bis 10 9} Zellen / ml. Bereiten Sie eine 100 ul Dosis für jede Maus, mit ein paar hundert ul hoher Volumengruppe zur Verbesserung der Genauigkeit und der Probenbeladung erleichtern.
5. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 2.500 xg für3 min oder in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 × g für 1 min. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellen durch ein gleiches Volumen an sterilem Wasser hinzufügen und vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten.
6. Bestimmt eine angemessene Messer Sondennadel (22 G 15-20 g Mäusen) auf eine 1 ml sterile Spritze und Last Hefeprobe, sicher zu sein, keine Blasen und stellen Kolben zu einer 100 & mgr; l Schritt zu beseitigen. Legen Sie eine weitere Spritze mit sterilem Wasser auf eine Magensonde Kontrollmäusen und überprüfen Sie die Anwesenheit jedes Gefährdungs ​​Hefe.
7. Pick-up die Maus werden zwangsernährt der nicht-dominanten Hand verwenden, mit Zeigefinger und Daumen fest Greifen der Haut um den Hals (6A). Verstauen Sie den Schwanz unter den kleinen Fingerbewegung des Unterkörpers zu verhindern. Achten Sie darauf, dass der Griff sicher ist und verbietet die Maus bewegt den Kopf, um Schäden an inneren Gewebe während der Schlundsonde zu verhindern.
   HINWEIS: Schätzen Sie, wie weit die Sondennadel durch Halten der Nadel gegen die Maus so eingesetzt werden, dassDie Lampe ist auch mit dem Schwertfortsatz des Brustbeins. Diese Länge der Nadel einlegen können typischerweise die Sondennadel Glühbirne den Magen zu gelangen.
8. Mit Hilfe der dominanten Hand, legen Sie vorsichtig die Sondennadel in die Maus Speiseröhre durch die Nadel entlang dem Dach des Mundes und Rückseite der Kehle Angeln, halten ein wenig nach links von der Mitte. Warten Sie auf die Maus, um den Kolben der Nadel zu schlucken und damit die Nadel etwas weiter bis zu dem Punkt zu steigen schätzungsweise 3,7 (6B). Wenn Sie einen Widerstand beim Einführen der Magensonde Nadel oder wenn die Maus jederzeit beginnt zu keuchen, entfernen Sie die Nadel und erneut versuchen zu finden, die Speiseröhre zu spüren ist.
9. Nachdem die Maus, um den Kolben der Magensonde Nadel geschluckt hat, drücken Sie sanft den Spritzenkolben 100 ul ^{(10 8} CFU) von Hefe direkt in der Maus Magen zu verabreichen.
   Hinweis: Obwohl Mäuse sind nicht in der Lage nach der Verabreichung ^18,19 jede der Sonde ernährt Lösung zu erbrechen ist es möglich, für Reflux bei Magensonde ^21,37 auftreten. Die richtige Einsetzen der Sondennadel, sowie das Volumen und die Viskosität der Lösung eingestellt wird, kann helfen, Reflux zu begrenzen und eine genaue Dosierung gewährleistet.
10. die Magensonde Nadel aus der Maus Magen und Speiseröhre und gibt die Maus in den Käfig vorsichtig entfernen. Prüfen, ob die Maus atmet und Bewegen der Regel nach der Schlundsonde, um sicherzustellen, dass die Sondennadel korrekt während des gesamten Verfahrens eingesetzt wurde und daß keine Lösung abgesaugt wurde.

4. Ernte von murinen Peyer-Plaques und Isolation von lebenden Hefekolonien

1. Zum geeigneten Zeitpunkt Post eine Magensonde, in der Regel 4 Stunden, Opfer Mäuse IACUC mit anerkannten Methoden. Prüfen Sie, ob Mangel an Reaktionsfähigkeit nach einer Zehe Prise, und verwenden Sie eine sekundäre Maßnahme wie Genickbruch der Maus zu opfern. Zusätzliche Zeitpunkten auch getestet werden, wie zahlreiche Studien, dass die Effizienz und den Zeitpunkt gezeigt haben, von bisüber das Epithel nehmen ist Partikel ^38,39 abhängig.
2. Legen Sie die Maus mit der vollständig ausgesetzt Bauch und sterilisieren den Bauchbereich durch mit 70% EtOH Spritzen. Machen Sie einen Querschnitt durch das Fell und die Haut mit einer Schere, wobei darauf geachtet, keine innere Gewebe zu beschädigen. Manuelles hebeln das Bauchfell, die dünne seröse Auskleidung der Einschnitt öffnen weitere Abdeckung der Bauchorgane freizulegen. Vorsichtig das Bauchfell heben und einen Querschnitt machen den Darm freizulegen.
3. Verwendung sorgfältig stumpfen Pinzette in den Dünndarm entfernt von den mesenterischen Arterien, Fett und anderen Geweben zu necken. Aussetzen des Dünndarms vom Magen, im oberen linken Quadranten des Abdomens Maus, um den Blinddarm, die große Tasche von Darmgewebe zu Beginn des Dickdarms.
4. Isolieren Sie die Peyer-Plaques durch die Suche nach 1-3 mm grob kreisförmigen Flecken von undurchsichtigen Gewebe entlang des Dünndarms (Abbildung 7). Mit gebogenen Dissektion scissoren, schneiden Sie die Kuppel des Patchs Peyer entfernt, Ränder verlassen propria, um sicherzustellen, dass keiner der umliegenden Lamina gesammelt wird.
   Hinweis: Die meisten Mäuse haben zwischen 4-8 gut sichtbar Peyer-Plaques. Die Durchführung des Verfahrens in einem Bereich mit direktem Deckenbeleuchtung wird die Leichtigkeit erhöhen, mit der Peyer-Plaques sichtbar gemacht werden kann.
5. Collect Peyer-Plaques in völliger Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) seziert.
   Hinweis: Es ist wichtig, sterile Technik und umfassen Antibiotika in der Sammlung Medien zu verwenden, um Magen-Darm-Bakterienkontamination von Hefe-Platten zu verhindern.
6. Der Stamm Peyer-Plaques durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb Mappen Medien zu beseitigen. Wash Peyer-Plaques mit frischem Komplett IMDM über einen 50-ml-Tube und einen Kolben aus einer 1-ml-Spritze verwenden, um sanft die Peyer-Plaques aufbrechen. Pellet angespannt Zellen durch Zentrifugation bei 1800 rpm für 7 min. Überstand wird abgesaugt und resuspendieren Zellen inein Endvolumen von etwa 100 & mgr; l.
7. Übernehmen angespannt Zellen auf selektive Hefemedien und eine Platte Treuer verwenden, um gleichmäßig Zellen verteilen. Wickeln Plattenkanten in Parafilm und Inkubation Platten kopfüber bei 30 ° C für 2 Tage für das Wachstum von jeder lebensfähigen Hefe aus der Maus-Peyer-Plaques zurückgewonnen werden kann.
   HINWEIS: Weitere Untersuchungen nach der Wiederherstellung der Hefe von Peyer Patches sind notwendig, um zu bestätigen, dass die Stämme richtig gefalteten heterologen Proteins zu dieser Immun Gewebe liefern können. Wie in 2.1.14 beschrieben, solche Verfahren kann Immunoblotting, ELISA oder Fluoreszenz-Mikroskopie auf fluoreszierende Proteine ​​wie GFP erkennen ^2,40 umfassen.

Ergebnisse

Erzeugung einer Überlebenskurve nach der UV-Bestrahlung erfordert Plattieren verdünnt Hefezellen so dass verschiedene koloniebildenden Einheiten (CFU) zu bilden vermögen. Jede 500 & mgr; l Probe entnommen, wie oben beschrieben, enthält etwa 5 x ^{10 6 Zellen;} jedoch größer als 100 Kolonien pro Platte sind schwierig, genau zu unterscheiden. Plattieren unverdünnten Probe sowie seriellen Verdünnungen von 1.10 bestrahlten Zellen gewährleistet somit, dass CFU kann an jed...

Diskussion

Zusammen beschreiben die Protokolle hier die wesentlichen Schritte, die für die Entwicklung und Erprobung von auxotrophen probiotische Hefe-Stämme für die Lieferung von heterologen therapeutischen Proteins in den Darm. Diese Manipulation und Prüfung von rekombinanten probiotischen Hefe erfordert Techniken und Mittel, mit denen jeder einzelnen Labor derzeit nicht vertraut sind. Obwohl also zahlreiche frühere Studien, die über Protokolle für mehrere Hefe und Maus-Stämme beschrieben haben, haben diese Methoden nich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053