Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Resumo

É apresentada aqui uma descrição unificada de técnicas que podem ser utilizadas para desenvolver, transformar, administrar, e testar a expressão da proteína heteróloga dos probióticos levedura Saccharomyces boulardii.

Resumo

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introdução

Os microorganismos probióticos são um meio potencial intrigantes de entrega eficiente e economicamente proteínas heterólogas para o tracto gastrointestinal. Estes organismos são capazes de sobreviver a passagem através do tracto gastrointestinal ainda não colonizam ^o 1, permitindo que a dosagem controlada e limitação da exposição ao fármaco expressa. Além disso, a capacidade para manipular facilmente destes organismos para a produção de proteína heteróloga em grande escala torna uma alternativa económica para entrega partículas sintéticas. No entanto, o desenvolvimento de uma tal abordagem, como foi recentemente demonstrado utilizando uma estirpe auxotr�ica da levedura Saccharomyces probióticas boulardii ^2, requer o conhecimento de técnicas laboratoriais que não são tradicionalmente combinadas dentro de um determinado estudo, variando de levedura e biologia molecular para técnicas de manejo de animais e métodos imunológicos. Assim, embora os procedimentos individuais aqui descritos não são em si novosprotocolos laboratoriais, o objectivo deste manuscrito é apresentar uma introdução unificada para as técnicas necessárias para ensaios experimentais de levedura probiótico como veículos de entrega de fármaco no tracto gastrointestinal de murino. Fornecida é uma compilação de protocolos essenciais para: 1) geração de cepas mutantes auxotróficos de levedura que podem ser facilmente manipulados geneticamente; 2) a transformação de culturas de leveduras para expressar a proteína heteróloga; 3) a administração de levedura recombinante para o intestino através de sonda oral; e 4) recuperação da levedura probiótica recombinante viável a partir do intestino murino e avaliação da sua expressão de proteínas heterólogas.

Em primeiro lugar, apesar de existirem numerosos métodos de selecção positiva e negativa para a manipulação de espécies de levedura, tais como a selecção negativa através do uso de marcadores auxotróficos aumenta tanto a eficiência e a facilidade com que a levedura pode ser transformada e seleccionada. selecção positiva de transformantes utilizando antibióticos, em contrast, aumenta significativamente o custo da manipulação de levedura. Além disso, a selecção de levedura em meio sólido contendo antibióticos pode permitir o aumento do crescimento de colónias não transformadas fundo em relação à selecção de levedura auxotróf ico em queda para fora sintético meios sólidos (observações não publicadas). levedura auxotróficos estirpes é que carecem de enzimas críticas para a síntese de aminoácidos essenciais ou uracilo. Essa levedura pode crescer somente se suplementado com o metabolito falta ou gene metabólica, permitindo assim seleção negativa quando a levedura é banhado em queda sintética fora de mídia que não tem o metabólito essencial. Muitos Saccharomyces comumente utilizadas estirpes laboratoriais cerevisiae são, na verdade já mutantes auxotróficos ^3. Industrial, clínico, estirpes de levedura e probióticas, no entanto, são tipicamente prototrófica com a capacidade de sintetizar todos os nutrientes necessários. Para permitir a manipulação genética mais eficiente de tais leveduras, genes auxotróficas podem ser selectivamentepara gerar estirpes que podem ser seleccionados, sem antibióticos. Direccionamento específico de genes marcadores auxotróf icos pode ser conseguida através de ruptura do gene mediada por PCR confiando na recombinação homóloga, ou, mais recentemente, através de CRISPR / Cas9 segmentação ^4-6. Alternativamente, a mutagénese UV pode gerar rapidamente mutantes auxotróficos mesmo em cepas de leveduras para os quais a transformação com vários plasmídeos é tecnicamente difícil ^7. Enquanto segmentação PCR e CRISPR / Cas9 foram descritos extensivamente em outros lugares, apresentada na primeira parte deste manuscrito é um protocolo detalhado descrevendo uma abordagem de mutagénese UV para criar cepas auxotróficas que permitam seleção negativa, em vez de selecção de antibiótico positivo de transformantes de levedura.

O próximo passo necessário para a utilização de tais estirpes auxotróf iças para a administração oral de proteína heteróloga é a transformação de levedura com ADN de plasmídeo. Uma vez que a primeira transformação bem sucedida de yeast esferoplastos relatados para Saccharomyces cerevisiae, em 1978, ^8, numerosas modificações têm sido caracterizados para aumentar a eficiência e a facilidade com que espécies de leveduras pode ser geneticamente modificada. O uso de electroporação para a transformação bem sucedida de ADN em S. cerevisiae foi descrito pela primeira vez em 1985 ⁹ e desde então tem sido melhorada através da adição de incubação de 1 M sorbitol para osmoticamente células de suporte ^10. A electroporação eficiência tem sido demonstrado que, além disso, dependem das espécies de leveduras e estirpe, número de células e fase de crescimento, de volume electroporação, intensidade de campo, e os amortecedores ¹¹ específicas. De etilo (LiOAc) transformação de lítio, originalmente descrita por Ito et al. ^12, encontra-se entre os protocolos de transformação mais vulgarmente utilizados, uma vez que não requer nenhum equipamento especial. Análises adicionais mostraram que a eficiência de transformação de levedura LiOAc aumenta muito quando as células são recolhidas na fase mid-logde crescimento e estão sujeitas a choque térmico na presença de polietileno glicol (PEG) e de ADN a 42 ° C ^12. A incubação de toda a levedura intacta com PEG é essencial para a transformação eficiente, possivelmente através de melhorar a ligação de ADN para a membrana celular, bem como através de outros efeitos sobre ^a membrana 13. Si lítio também aumenta a permeabilidade das células intactas ^14. Embora a maioria laboratório S. cerevisiae pode ser facilmente transformada usando LiOAc transformação ^3, outras espécies de levedura pode ser mais eficientemente transformada utilizando protocolos alternativos. Pichia pastoris, por exemplo, é mais eficientemente transformado através de electroporação, em vez de LiOAc transformação ^13. É importante, por conseguinte, para testar múltiplos métodos de transformação e para otimizar períodos de incubação e concentração de reagentes ao tentar modificar geneticamente uma cepa de levedura descaracterizado. Este manuscrito descreve, assim, tanto LiOAc transformation e eletroporação como técnicas para a transformação do mutante auxotr�ica e tipo selvagem S. boulardii. Os leitores interessados ​​são encaminhados para comentários recentes para descrições completas da evolução da transformação de levedura, protocolos alternativos e novas discussões de possíveis mecanismos de ação ^13,15. Transformação de levedura com o plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, além disso, é essencial para o teste a jusante, a fim de assegurar a expressão e função da proteína heteróloga adequada. proteínas miríade de diferentes podem ser selecionados dependendo do objetivo final do estudo terapêutico e os anticorpos disponíveis para a detecção de proteína por immunoblotting, ELISA, e outras técnicas. Os protocolos para estas técnicas têm sido exaustivamente descritos em outra parte ^16,17, e pode ser utilizado para determinar os níveis de produção de proteína heteróloga a partir de levedura transformada por comparação com curvas padrão. Para fins de demonstração e para mostrarprodução bem sucedida de uma proteína muito vulgarmente utilizados na biologia de levedura, este manuscrito apresenta transformação com o plasmídeo que codifica a proteína verde fluorescente (GFP), o que permite a detecção subsequente utilizando microscopia de fluorescência.

Igualmente importante para a produção de organismos probióticos que expressam a proteína heteróloga é a correcta administração e detecção destes microrganismos em tecidos gastrointestinais, como descrito nas partes três e quatro. A administração de levedura recombinante através de sonda oral permite a entrega de quantidades controladas de levedura directamente no estômago, a partir do qual ratinhos C57BL / 6 são, naturalmente, incapazes de vómitos ^18. No entanto, lidar com os animais imprópria e gavage pode levar a danos de esôfago e perfuração, perfuração gástrica, administração traqueal e pneumonia de aspiração ^19,20. A dificuldade técnica e inexperiência pode ainda aumentar a variabilidade na resposta imune de murino e resu experimentallts, que foram atribuídos ao estresse dos animais mediante sonda oral ^21,22. Prática na técnica apropriada pode, portanto, não apenas atenuar desconforto ao animal, mas também pode aumentar a precisão dos resultados experimentais. Este manuscrito descreve e demonstra manejo dos animais e sonda oral para a administração de doses controladas de levedura recombinante.

Por fim, é vital para confirmar a entrega bem sucedida de levedura recombinante através da análise de tecidos linfóides para a presença de levedura e proteína heteróloga. Os tecidos gastrointestinais imunes que podem ser mais facilmente e previsivelmente examinados para a presença de leveduras são placas de Peyer. Placas de Peyer são órgãos linfóides secundários ao longo do intestino delgado, que são locais-chave da mucosa indução de resposta imune ^23. Antígenos do lúmen são transferidos transcelular através microfold células (M) no epitélio e são libertados para placas de Peyer, expondo assim delimitard células apresentadoras de antígenos para intestinal conteúdo luminal. Embora a captação de partículas através do epitélio intestinal pode também ser conseguida por células caliciformes, estas células têm sido mostrados para só ocupam partículas inferior a 0,02 um de diâmetro ^24. Dendrites transepitelial prorrogado a partir de células dendríticas CD103 ⁺ (DC) também ocupam pequenas partículas do intestinal lumen ^25; No entanto, não existem actualmente relatórios que provam que CD103 ⁺ DCs ocupam as partículas maiores do que as bactérias. Assim, a levedura intacta probiótico, de tamanho médio entre 3-6 um de diâmetro, são mais susceptíveis de serem absorvidos pelas células M e transferidas para placas de Peyer. Aqui descrito é um protocolo para a recolha e rastreio de placas de Peyer de levedura recombinante viável, embora este procedimento pode também ser facilmente adaptada para avaliar a absorção de bactérias probióticas.

Em resumo, a avaliação de levedura recombinante probiótico para a entrega doproteínas rapeutic para o intestino requer proficiência em técnicas laboratoriais que medem biologia molecular para manejo dos animais e imunologia. Aqui apresentadas são protocolos para 1) a geração e rastreio de estirpes de levedura auxotróf icos que pode ser facilmente seleccionadas negativamente sem antibióticos, 2) protocolos alternativos para transformar a levedura e permitir a expressão da proteína heteróloga, 3) demonstrações de técnicas de manipulação de animais apropriados e gavagem oral para intragástrico entrega de levedura recombinante, e 4) para protocolos de dissecção e placas de Peyer a triagem para levedura recombinante viável e funcional proteína heteróloga. Combinados, estes protocolos permitirá a geração e teste de uma estirpe de levedura capaz de entregar probiótico proteína terapêutica heterólogo para o tracto gastrointestinal.

Protocolo

1. Mutagênese UV para produzir estirpes de levedura auxotróficas

1. Gerar curvas de sobrevivência para determinar doses necessárias de irradiação UV
   1. Prepare de YPD (extracto de levedura de peptona de dextrose) e meios de comunicação de outros reagentes listados na Tabela 1, de acordo com procedimentos padrão e inocular ²⁶ colónias individuais em 5-10 ml de meio YPD. Incubar as culturas num tambor de rolo a 30 ° CO / N à saturação durante pelo menos 8 h.
   2. Determinar a concentração de células de culturas de O / N utilizando um espectrofotómetro de células por diluição 1:10 em água numa cuvete de plástico. Dilui-se as células a uma concentração de 10 ⁷ células / ml em 20 ml de água destilada estéril.
   3. Pour células diluídas para uma placa de Petri de plástico estéril e, com a tampa removida, colocar a placa de 14 cm abaixo de uma lâmpada de UV.
   4. Expor as células de série para 5000 e 10.000 doses μJ μJ de irradiação UV, extraindo a 500 ul de células após cada incremento de tal modo que as célulassão recolhidos após a exposição a 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ e 50.000 μJ de irradiação UV. amostras de células de transferência estéril extraído para tubos de 1,5 ml e diluir em série a 1:10 em incrementos de água estéril.
   5. Sedimentar as células em cada diluição por centrifugação numa microcentrífuga a 16000 xg durante 1 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em um volume de 100 ul de água estéril apropriada para o plaqueamento de células de levedura. Pipetar o volume total de células ressuspensas em placas de YPD contendo meio sólido e utilizar um espalhador estéril para distribuir uniformemente as células em cada placa.
   6. Enrole bordas da placa em Parafilm para evitar a secagem da mídia e placas de cobertura em papel de alumínio para evitar a foto-reactivação e reparação de mutações induzidos por UV. Incubar as placas de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2-4 dias para permitir o crescimento de colónias de levedura viáveis ​​(Figura 1).
   7. Contar o number de colônias, opcionalmente com a ajuda de uma caneta para marcar colónias contadas, uma de mão contador eletrônico caneta, ou um contador de ficar com a ampliação. Lote como uma percentagem do total de células plaqueadas em cada dose μJ de irradiação UV para gerar uma curva de sobrevivência de levedura irradiada (Figura 2).
      NOTA: Haplóide estirpes de levedura pode-se esperar que necessitam de doses mais baixas de radiação UV em relação a estirpes diplóides para atingir a mesma percentagem de sobrevivência. Uma estirpe de levedura sem enzimas de reparação de ADN funcionais, tais como o S. rad1 cerevisiae mutante, pode ser utilizado como um controlo positivo para indicar a presença da irradiação UV a doses muito baixas.
   8. Determinar a dose de mutagénese UV para ser usado para o rastreio, referindo-se a curva de sobrevivência estabelecida em 1.1.7. O valor de x do ponto ao longo da curva de sobrevivência em que y é igual a 50 é a dose de irradiação de UV à qual 50% de levedura sobreviver. Rastreio mutantes neste sobrevivência baixa percentagem pode resultar numaum rendimento mais elevado de estirpes mutantes com sucesso, particularmente para levedura diplóide. A dose de sobrevivência de 50% para o WT S. boulardii, como mostrado na Figura 2, é de aproximadamente 18.000 μJ.
      NOTA: Se bem que tais doses elevadas de UV aumenta o risco de mutações nos genes para fins que não o gene marcador auxotrófico de interesse vias celulares, este inconveniente deverá ser equilibrada relativamente à necessidade de induzir mutações em ambas as cópias do gene marcador auxotrófico. Para as estirpes haplóides em que apenas uma cópia do gene deve ser mutadas, de rastreio a uma sobrevivência mais elevada por cento, tal como a 90%, diminui o risco de mutações adicionais e ainda permite a produção suficiente de mutantes auxotróficos.
2. mutagénese UV e selecção de estirpes de levedura auxotróficos
   1. Prepare de levedura como descrito nos passos itens 1.1.1-1.1.3.
   2. Expor levedura para a dose de irradiação de UV correspondente a sobrevivência de 50%, como determinado em 1.1.8. Para WT S. boulardii, esta dose waé determinada como sendo aproximadamente de 18.000 μJ (Figura 2).
   3. Recolhe volumes de 1 mL de UV e irradiadas levedura pelete por centrifugação numa microcentrífuga a 16000 xg durante 1 min. células sobrenadante e ressuspender aspirado em 100 ml de água estéril.
      1. Selecção de mutantes
         1. Se a utilização da selecção, tais como ura3 com ^- mutantes auxotróficos, placa irradiados levedura em meios contendo ácido 5-fluoroor�ico (5-FOA) para seleccionar células que carecem de uma enzima funcional Ura3.
            NOTA: Qualquer levedura contendo cópias funcionais de Ura3 irá converter 5-FOA à toxina 5-fluorouracil, levando à morte celular e permitindo a fácil seleção de ura3 - colónias que não possuem uma Ura3 funcional ^27. Critérios de seleção análogos são possíveis para os LYS2 e Lys5; marcadores e MET2 e MET15 utilizando meios contendo ácido α-aminoad�ico ^28; TRP1; 5-fluoroácido antranílico ^29; e ^30,31 metil-mercúrio, respectivamente.
         2. Pipetar 100 ul de células ressuspensas em meio mínimo contendo 5-FOA e usar um espalhador estéril para revestimento uniformemente a placa. Enrole placas em Parafilm e incubar de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2-4 dias para permitir o crescimento de colónias de levedura viáveis.
         3. Confirmar a URA3 ^- fenótipo de qualquer colónia aparecendo em 5-FOA placas por restreaking em YPD, uracilo ^- e as placas 5-FOA (Figura 3). Use a ponta de um palito estéril para recolher parte de uma única colónia e gentilmente arraste as células do outro lado fresco YPD, uracila ^-, e as placas 5-FOA. Novamente incubar as placas de cabeça para baixo embrulhadas a 30 ° C durante 2-4 dias.
            NOTA: colónias viáveis ​​aparecerá como elevada, cerca de crescimentos circulares, enquanto as células não viáveis ​​aparece apenas como uma mancha opaca, sem qualquer crescimentos elevados (Figura 3).
      2. screening de mutantes
         1. Se a geração de um mutante auxotróf ico para o qual os métodos de selecção não estão disponíveis, preparar série de diluições 1:10 irradiada com UV de células de levedura em água estéril e pipetar as diluições em meios YPD, usando um espalhador estéril para revestimento uniformemente a placa.
         2. Enrole placas em Parafilm e incubar de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2-4 dias. Determinar que a diluição permitido para o crescimento de colónias individuais que podem ser facilmente distinguidos um do outro, geralmente não mais do que cerca de 100 colónias por placa.
         3. mutagénese UV repetida de amostras de levedura tal como descrito em 1.2.1-1.2.3 e a placa de células neste determinado diluição. Pipetar a levedura diluída em meios YPD, utilizar um espalhador estéril para distribuir as células, e incuba-se as placas de cabeça para baixo embrulhadas a 30 ° C durante 2-4 dias.
         4. Tela para auxotróficos por plaqueamento de réplicas em suporte seletiva sem o metabólito de interesse. Em primeiro lugar, garantir uma almofada de veludo estéril em um suporte placae inverter a placa com UV colônias irradiados para o veludo, marcando a orientação placa.
         5. Em seguida, inverter uma placa fresco sem o metabólito de interesse para o veludo e pressione levemente para baixo para transferir células do veludo para a placa. Armazenar a placa original a 4 ° C. Enrole e incubar a placa nova cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2-4 dias.
         6. Como uma alternativa ao plaqueamento de réplicas, mutantes de tela por colónias re-estrias de YPD em meios selectivos. Use a ponta de um palito estéril para recolher parte de uma única colónia e gentilmente arraste as células através de uma placa YPD fresco e uma placa sem o metabólito de interesse. Novamente incubar as placas de cabeça para baixo embrulhadas a 30 ° C durante 2-4 dias.
            NOTA: É preciso ter cuidado para selecionar colônias individuais e raia fora colônias várias vezes para confirmar uma população homogênea de células auxotróficas verdadeiros.
   4. Além disso confirmar o fenótipo de células irradiadas por inoculaçãoing colónias individuais em 5-10 ml de ambos YPD e meios de comunicação que não possua o metabolito adequado (por exemplo, em uracila ^- media para um ura3 ^- mutante). Incubar num tambor de rolos a 30 ° CO / N para confirmar o crescimento de células em meio YPD, mas não na ausência do metabolito.
      NOTA: Embora os padrões de crescimento em meios sólidos devem indicar claramente o status auxotr�ica levedura, é possível que algumas leveduras para tolerar tensões e formam colónias de crescimento lento pequenas em meios sólidos, mas ainda não tolerar as mesmas condições nos meios líquidos (observações não publicadas). Inoculação em culturas líquidas devem, portanto, ser realizados para confirmar completamente os padrões de crescimento de UV irradiada mutantes.
   5. Para armazenamento a longo prazo de mutantes auxotróficos confirmados, preparar stocks de glicerol por inoculação de células em 10 ml de YPD e incubação num tambor de rolos O / N a 30 ° C. células por centrifugação durante 3 min a 2500 xg e aspirado mídia. Ressuspender as células em 50%estéril de glicerol filtrada, transferir para um frasco de congelação, e armazenar a -80 ° C.
      NOTA: UV levedura mutado potencialmente conter mutações em vários outros do que no marcador auxotr�ica de interesse genes. Antes de continuar com a utilização de mutantes auxotróficos verificada, estas estirpes devem ser adicionalmente analisados ​​através de sequenciação do gene e avaliação da resistência ao pH, tensões de ácidos biliares, e outras características relevantes para estirpes probióticas, como descrito noutro local ^2. Além disso, o uso de homologia de PCR CRISPR ou / Cas9 segmentação de mutação mais selectivamente marcadores auxotróf icos deve ser considerada como uma alternativa para mutagénese UV ^4-6.

Transformação 2. Levedura

1. LiOAc transformação de leveduras
   1. Inocular colónias de levedura individuais em 5-10 ml de meio YPD e incubar num tambor de rolos a 30 ° CO / N.
   2. Para induzir o crescimento de fase log e aumentar a eficiência da captação de plasmídeo, deTermine concentração de células usando um espectrofotómetro para medir uma diluição 1:10 de células em água estéril numa cuvete de plástico. O / a diluídas culturas N para um OD ₆₀₀ de 0,16-0,2 (aproximadamente 2 x 10 ⁶ - 2,5 x 10 ⁶ culas / ml) em 50 ml de meio YPD fresco quente e incubar as células num agitador de plataforma orbital a 200 rpm até a cultura chegue a cerca de 1 x 10 ⁷ células / ml, normalmente cerca de 4 horas.
      NOTA: A eficiência de transformação pode ser medido como uma função do número de unidades formadoras de colónias de levedura transformadas com sucesso (CFU) por ug de ADN de plasmídeo. O aumento da eficiência resulta em colónias mais transformadas por ug de DNA do plasmídeo. Subcultura células de levedura e de coleta durante a fase de crescimento log é um fator que aumenta a eficiência de transformação ^12.
   3. Peletizar as células por centrifugação a 2500 xg durante 3 min.
   4. Aspirar o sobrenadante e transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por ressuspensão do Pellet em 1 ml de água estéril.
   5. as células por centrifugação a 16.000 xg durante 1 minuto numa microcentrifuga, aspirar o sobrenadante e lava-se as células por ressuspensão em 1 ml de TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) tampão.
   6. Repetir células de centrifugação e ressuspender em tampão TE / LiOAc a uma concentração de 2 x 10 ⁹ culas / ml.
   7. Preparar misturas de transformação com cada um dos seguintes: 50 ul de levedura preparado em tampão TE / LiOAc, 5 ul de ADN de transporte (10 ug / uL), e 1 uL de ADN de plasmídeo (1 ug). Microgramas de ADN de plasmídeo pode ser titulado como quantidades crescentes de ADN pode ou não levar ao aumento da eficiência de transformação ³²
      NOTA: Para uma estirpe de levedura mutante a que falta um marcador auxotrófico, apenas um plasmídeo que codifica o marcador pode ser transformado por amostra. Além disso, a utilização de um plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, tal como GFP, vai permitir a determinação eficaz de dobragem correcta e expressão heteróloga de PRotein por a estirpe de levedura para a transformação subsequente.
   8. Para cada preparação, adicione 300 ml de PEG / LiOAc / TE e vortex completamente. A incubação de células intactas com PEG é essencial para a transformação eficiente ^13.
   9. Incubar as preparações a 30 ° C durante 30 min com agitação, colocando tubos de microcentrífuga num copo colocado sobre um agitador de plataforma orbital a 200 rpm.
   10. Adicionar 35 ul de DMSO a cada reacção e de choque de calor células durante 15 min num banho de água a 42 ° C. Embora existam relatórios de conflito o benefício adicional de DMSO ^33, de choque térmico das células de levedura intactas, foi mostrada para aumentar significativamente a eficiência de transformação ^12.
   11. Lave as células por centrifugação através de granulação como em 2.1.5, aspirando ou pipetagem fora o sobrenadante, e ressuspensão em 1 ml de água estéril. Pipeta suavemente para cima e para baixo para quebrar o pellet celular.
       NOTA: É fundamental para remover completamente o sobrenadante porque o uso de mídiad na geração de células competentes podem inibir o crescimento de leveduras e a formação de colónias.
   12. peletização celular Repita como em 2.1.5, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 mL de água estéril. Pipetar o volume total em um prato seletivo e usar um espalhador estéril para uniformemente cobrir a placa com levedura transformada.
   13. Enrole bordas de placas revestidas em Parafilm para evitar a secagem dos meios de comunicação e incubar de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2 dias para permitir o crescimento de células de levedura transformadas. Bem sucedida, a transformação eficaz e selecção auxotrófico de Saccharomyces cerevisiae, produz um elevado número de colónias por preparação de transformação, embora o rendimento pode ser muito menor para outras estirpes (Figura 4).
   14. placas de levedura loja para a curto prazo (geralmente 1-3 semanas) de cabeça para baixo e cobriu a 4 ° C. Preparar stocks de glicerol de leveduras transformadas, tal como descrito em 1.2.5 para armazenamento a longo prazo.
       NOTA: Mais estudos testes transformado CFU são necessários para determinar a estabilidade do plasmídeo e avaliar a expressão adequada de proteínas heterólogas. Descrições completas de estabilidade do plasmídeo ^34, a utilização de imunotransferência para detectar proteínas desnaturadas recuperados a partir de amostras de células ^17, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para detectar dobrado adequadamente três proteínas dimensional ^16, e o uso de GFP em estudos de levedura ³⁵ estão disponíveis em outras posições. A Figura 6 mostra uma imagem representativa da expressão de GFP sucesso em S. transformado cerevisiae em relação às células não transformadas. Utilização de uma proteína tal fluorescente é um meio para determinar de forma eficiente a produção de proteína heteróloga bem sucedida.
2. A electroporação de levedura
   1. Inocular colónias de levedura individuais em 5-10 ml de meio YPD e incubar num tambor de rolos a 30 ° CO / N.
   2. Determinar a concentração de células utilizando um espectrofotómetro para medir uma diluição 1:10 de células em água estéril. diculturas alaúde O / N em 100 ml frescos mídia YPD quentes para um OD ₆₀₀ equivalente a aproximadamente 0,3. Incubar subculturas em 30 ° C num conjunto agitador orbital de plataforma a 200 rpm até atingir uma _DO600 de aproximadamente 1,6, usualmente 4-5 horas. Cada subcultura 100 ml irá gerar células condicionado suficiente para duas reacções de transformação.
   3. Peletizar as células por centrifugação a 2500 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e lava-se as células por ressuspensão em 50 ml de gelado de água estéril gelada. Repetir a lavagem por células peletização, aspirar o sobrenadante e ressuspensão em 50 ml de água gelada estéril frio fresco.
   4. Agregar as células novamente e ressuspender em 50 ml de gelo frio tampão de electroporação (1 M de sorbitol, CaCl ₂ 1 mM).
   5. Repita rotação como em 2.2.3, sobrenadante aspirado, e as células ressuspender em 20 ml M LiOAc / DTT 0,1 mM 10. Incubar suspensão de células num tambor de rolos a 30 ° C durante 30 min. A pré-incubação das células em LiOAc e DTT sinergicamente aumenta aa eficiência da electroporação ^36.
   6. Agregar as células como em 2.2.3, remover o sobrenadante e lavar por ressuspensão em 50 mL de gelo frio de tampão de electroporação. Repetir células de centrifugação e ressuspender em tampão de electroporação arrefecido em gelo até um volume final de 1 ml.
   7. Prepare no gelo: condicionado células de levedura, cuvetes de electroporação estéreis, e DNA plasmídeo. Imediatamente após a ressuspensão final das células condicionado em 1 ml de tampão de electroporação, combinar 400 ul de células de levedura condicionado com cerca de 1 ug de ADN de plasmídeo e adicionar a um gelado de 0,2 um electroporação cuvete. A utilização de quantidades aumentadas de ADN pode aumentar ligeiramente a eficácia de transformação ^11. Incubar reacção em gelo durante 5 min, em seguida, electroporate com o conjunto electroporator a 2,5 kV e 25 mF.
      NOTA: Como descrito em 2.1.7, uma estirpe de levedura mutante a que falta um marcador auxotrófico podem ser transformadas com o plasmídeo que codifica apenas um marcador mutado por amostra. Além disso, usandoum plasmídeo que codifica uma proteína facilmente detectável, tal como GFP permite a determinação eficiente de dobragem correcta e expressão da proteína heteróloga para subsequente transformação.
   8. Transferência de células electroporadas em 8 ml de uma mistura 1: 1 de meio YPD: 1 M de sorbitol e permitir que as células a incubar num tambor de rolos a 30 ° C durante 60 min.
   9. células de pellets como em 2.2.3 e ressuspender em 100 mL de 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Placa o volume total para meios selectivos contendo 1 M de sorbitol, embrulhar bordas das placas em Parafilm e incubar as placas de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2-5 dias para permitir o crescimento de células de levedura transformadas.
      NOTA: É crítico para teste de levedura transformadas para avaliar a expressão adequada da proteína heteróloga, tal como descrito em 2.1.14 e 2.2.7.

3. sonda oral de ratos com levedura transformada

1. Efectuar todos os procedimentos de cuidados de animais e manuseio de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Laboratório Umanimais produtores e Institutional Animal Care and Use a aprovação do Comité.
2. Prepare culturas S / N de levedura por inoculação de colónias simples de levedura auxotróf ico transformado em 5-10 ml de meio selectivo. Incubar culturas O / N durante pelo menos 8 h num tambor de rolos a 30 ° C até ficar saturada.
   NOTA: A utilização de proteínas de teste plasmídeo de codificação, tais como GFP irá permitir a facilidade de teste a expressão da proteína em levedura tratadas por gavage, como descrito em 4.7.
3. Para indução máxima da expressão da proteína e para induzir a fase de crescimento logarítmico, preparar a partir de subculturas O / N culturas por diluição para uma DO ₆₀₀ de aproximadamente 0,16-0,2 equivalente em 50 ml de meio apropriado tal como descrito em 2.1.2.
4. Determinar a concentração de células subcultivadas como em 1.1.2 e ajustar para 10 ⁹ células / ml. Prepare uma dose de 100 mL para cada rato, com algumas centenas de volume ul extra por grupo para melhorar a precisão e facilidade de carregamento de amostras.
5. células de pelotas por centrifugação a 2.500 xg por3 min ou em uma microcentrífuga a 16000 xg durante 1 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células por adição de um volume igual de água estéril e suavemente pipetando para cima e para baixo.
6. Fixar uma agulha de calibre gavage apropriado (22 G para 15-20 g ratos) em uma amostra de seringa e levedura de carga 1 ml estéril, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas e definir êmbolo para um incremento de 100 mL. Carregar uma seringa adicional com água esterilizada para ratos de controle de administração forçada e verificar a presença de qualquer levedura contaminante.
7. Pegar o mouse para ser tratadas por gavage usando a mão não-dominante, com o dedo indicador eo polegar firmemente agarrar a pele ao redor do pescoço (Figura 6A). Tuck a cauda sob o dedo pequeno para impedir o movimento da parte inferior do corpo. Certifique-se que a aderência é seguro e proíbe o mouse se mova sua cabeça, a fim de evitar danos aos tecidos internos durante gavage.
   NOTA: Estimar o quão longe a agulha gavage deve ser inserido segurando a agulha contra o rato de tal forma quea lâmpada é mesmo com o processo xifóide do esterno. Inserindo este comprimento da agulha irá tipicamente permitir a lâmpada agulha de gavagem a entrar no estômago.
8. Usando a mão dominante, suavemente inserir a agulha de gavagem no esófago de rato por dobrar a agulha ao longo do telhado da boca e da parte posterior da garganta, mantendo-se ligeiramente à esquerda do centro. Espere até que o rato de engolir a lâmpada da agulha e permitir que a agulha ao descer ligeiramente mais para o ponto estimado em 3.7 (Figura 6B). Se qualquer resistência é sentida durante a inserção da agulha sonda gástrica ou se o mouse em qualquer momento, começa a ofegar, remover suavemente a agulha e novamente tentar encontrar o esôfago.
9. Após o ratinho ter engolido a lâmpada da agulha de gavagem, suavemente o êmbolo da seringa para administrar 100 ul (10 ⁸ CFU) de levedura directamente no estômago do rato.
   NOTA: Embora os ratos são incapazes de vomitar qualquer da solução tratadas por gavage após a administração ^18,19 , é possível para o refluxo para ocorrer durante gavagem ^21,37. A inserção adequada da agulha de gavagem, assim como ajustando o volume e a viscosidade da solução, podem contribuir para limitar o refluxo e assegurar uma dosagem exacta.
10. Remova cuidadosamente a agulha gavage do estômago do rato e do esôfago e retornar o mouse para a gaiola. Verificar que o rato está a respirar e movendo-se normalmente após administração por sonda para assegurar que a agulha de gavagem foi correctamente inserida em todo o processo e que nenhuma solução foi aspirada.

4. Colheita de Patches de Murino Peyer e isolamento de colônias de leveduras viáveis

1. No momento apropriado ponto de pós gavage, tipicamente 4 horas, os ratos sacrifício usando IACUC aprovado métodos. Verifique se há falta de resposta após uma pitada dedo do pé, e usar uma medida secundária, como deslocamento cervical a sacrificar o mouse. Os pontos de tempo adicionais também podem ser testados, como numerosos estudos têm mostrado que a eficiência e o tempo de atétomar através do epitélio é dependente ^38,39 partículas.
2. Coloque o mouse com o abdômen totalmente exposta e esterilizar a área abdominal por pulverização com etanol 70%. Faça uma incisão transversal através do pêlo e da pele com uma tesoura, tomando cuidado para não danificar os tecidos internos. erguer manualmente a incisão abrir ainda mais para expor o peritônio, o revestimento seroso fina que cobre os órgãos abdominais. Levante cuidadosamente o peritônio e fazer uma incisão transversal para expor os intestinos.
3. Cuidadosamente utilize uma pinça sem corte para provocar o intestino delgado longe das artérias mesentérica, gordura e outros tecidos. Expor o intestino delgado a partir do estômago, no quadrante superior esquerdo do abdómen do rato, para o ceco, o grande bolso de tecido intestinal no início do intestino grosso.
4. Isolar placas de Peyer, procurando por 1-3 mm remendos circulares aproximadamente de tecido opaco ao longo do intestino delgado (Figura 7). Usando scis dissecação curvossores, cortar a cúpula do remendo do Peyer, deixando margens para garantir que nenhum da lâmina circundante é coletado.
   NOTA: A maioria dos ratos têm entre 4-8 placas de Peyer facilmente visíveis. Realizando o processo em uma área com iluminação superior directa vai aumentar a facilidade com que as placas de Peyer pode ser visualizado.
5. Colete dissecados placas de Peyer em completa de Iscove modificado media (IMDM) de Dulbecco.
   NOTA: É crítico para utilizar uma técnica estéril e incluem antibióticos nos meios de recolha, a fim de evitar a contaminação bacteriana gastrointestinal de placas de levedura.
6. manchas estirpe de Peyer através de um filtro de células 40 um para eliminar meios de cobrança. placas de Peyer Lavar com IMDM completo fresco ao longo de um tubo de 50 ml e usar um êmbolo de uma seringa de 1 ml para quebrar-se suavemente nas placas de Peyer. Pellet células tensas por centrifugação a 1.800 rpm durante 7 min. sobrenadante e ressuspender as células do aspirado emum volume final de aproximadamente 100 ul.
7. Aplicar células tensas em mídia levedura seletivo e usar um difusor de placa para distribuir uniformemente as células. Enrole bordas da placa em Parafilm e incubar as placas de cabeça para baixo, a 30 ° C durante 2 dias para permitir o crescimento de qualquer levedura viáveis ​​recuperado a partir de emplastros de Peyer do murino.
   NOTA: Mais estudos após a recuperação da levedura de placas de Peyer 'são necessários para confirmar que as cepas são capazes de entregar proteínas heterólogas correctamente dobrado para estes tecidos imunes. Tal como descrito em 2.1.14, tais métodos podem incluir immunoblotting, ELISA, ou microscopia de fluorescência para detectar proteínas fluorescentes, tais como GFP ^2,40.

Resultados

A geração de uma curva de sobrevivência após a irradiação UV requer plaqueamento das células de levedura diluídas de tal modo que as unidades formadoras de colónias (CFU) distintos são capazes de formar. Cada amostra de 500 ul recolhido como descrito acima contém cerca de 5 X 10 ⁶ células; no entanto, maior do que 100 colónias por placa são difíceis de distinguir com precisão. Plaqueamento amostra não diluída em série, bem como diluições 1:10 de células i...

Discussão

Juntos, os protocolos aqui descrever os passos essenciais necessários para o desenvolvimento e teste de estirpes probióticas de levedura auxotróficos para a entrega de proteína terapêutica heterólogo para o intestino. Esta manipulação e teste de levedura probiótica recombinante requer técnicas e recursos com os quais qualquer laboratório indivíduo não pode actualmente ser familiar. Assim, apesar de numerosos estudos anteriores descreveram os protocolos acima para várias cepas de leveduras e do rato, esses ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053