Трансформация пробиотических дрожжей и их восстановление из желудочно-иммунных тканей После желудочный зонд у мышей

Резюме

Представленные здесь единое описание методов, которые могут быть использованы для разработки, преобразования, администрировать и проверить гетерологичный экспрессию белка пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди.

Аннотация

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Введение

Пробиотические микроорганизмы интригующая потенциальным средством эффективно и экономично доставлять гетерологичных белков в желудочно-кишечном тракте. Эти организмы способны выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт еще не колонизировать это ^один, что позволяет контролируемой дозировки и ограничение воздействия на препарат выражены. Кроме того, способность легко проектировать эти организмы производить гетерологичный белок в больших масштабах оказывает им экономичной альтернативой синтетических частиц доставки. Однако разработка такого подхода, как недавно продемонстрировано с использованием ауксотрофным пробиотических дрожжей сахаромицеты буларди ^2, требует знания лабораторных методов, которые традиционно не объединенных в пределах данного исследования, начиная от дрожжей и молекулярной биологии, к способам обработки животных и иммунологическими методами. Таким образом, хотя отдельные процедуры, описанные здесь, сами по себе не новаялабораторные протоколы, цель этой рукописи является представление единой введение в методы, необходимые для экспериментальной проверки пробиотических дрожжей в качестве средств доставки лекарств к мышиной желудочно-кишечного тракта. При условии, представляет собой подборку основных протоколов: 1) поколения ауксотрофных мутантных штаммов дрожжей, которые могут быть легко генетически измененных; 2) превращение дрожжевых культур, чтобы выразить гетерологичный белок; 3) введение рекомбинантного дрожжей в кишечник через желудочный зонд; и 4) восстановление жизнеспособных пробиотических рекомбинантного дрожжей из мышиного кишечника и оценки их экспрессии гетерологичных белков.

Во-первых, хотя многочисленные положительные и отрицательные методы отбора существуют для манипулирования видов дрожжей, негативный отбор, например, посредством использования ауксотрофных маркеров увеличивает как эффективность и легкость, с которой дрожжи могут быть преобразованы и выбран. Положительный отбор трансформантов с использованием антибиотиков, в сотрудничествеntrast, значительно увеличивает стоимость манипуляции дрожжей. Кроме того, выбор дрожжей на содержащую антибиотик твердых средах может позволить усиленному росту нетрансформированных фоновых колоний относительно отбора ауксотрофной дрожжей на синтетической отсева твердых средах (неопубликованные данные). Ауксотрофная дрожжи штаммы, которые испытывают недостаток ферментов критические для синтеза заменимых аминокислот или урацил. Такое дрожжи могут расти только тогда, когда дополняется пропавшего метаболита или метаболического гена, что позволяет негативный отбор, когда дрожжи высевали на синтетической отсева СМИ, что не хватает существенную метаболита. Многие широко используемые Saccharomyces CEREVISIAE лабораторные штаммы, на самом деле уже ауксотрофные мутанты ^3. Промышленное, клиническая и пробиотические штаммы дрожжей, однако, как правило, прототрофным способностью синтезировать все необходимые питательные вещества. Чтобы обеспечить более эффективное генетических манипуляций такого дрожжей, ауксотрофные гены могут быть избирательно нацеленыгенерировать штаммов, которые могут быть выбраны без антибиотиков. Специфическое нацеливание ауксотрофных маркерных генов может быть достигнуто путем ПЦР-опосредованный разрушения гена, опираясь на гомологичной рекомбинации или совсем недавно через CRISPR / cas9 таргетинга ^{4 - 6.} В качестве альтернативы, УФ мутагенеза может быстро генерировать ауксотрофные мутанты даже в дрожжевых штаммов, для которых преобразование с несколькими плазмид технически сложно ^7. В то время как ПЦР таргетинг и CRISPR / cas9 были подробно описаны в другом месте, представлены в первой части этой рукописи является Подробный протокол описания мутагенеза подход УФ создать ауксотрофные штаммы, которые позволят негативной селекции, а не позитивной селекции антибиотиками дрожжевых трансформантов.

Следующий необходимый шаг в использовании таких ауксотрофных штаммов для пероральной доставки гетерологичного белка является превращение дрожжи с плазмидной ДНК. С первого успешного преобразования поименныйт сферопласты сообщенные для Saccharomyces CEREVISIAE в 1978 ^8, многочисленные модификации были охарактеризованы с целью повышения эффективности и легкости, с которой виды дрожжей могут быть генетически модифицированы. Использование электропорации для успешной трансформации ДНК в S. CEREVISIAE был впервые описан в 1985 году ⁹ и с тех пор улучшилась с помощью добавления 1 M сорбита инкубации к осмотически клеток поддержки ^10. Эффективность Электропорация Кроме того, было показано, что зависит от вида дрожжей и штамм, количество клеток и фазы роста, объем электропорация, напряженности поля, а также конкретные буферы ^11. Литий ацетата (LiOAc) преобразование, впервые описан Ito и др. ^12, является одним из наиболее часто используемых протоколов трансформации, так как не требует специального оборудования. Дополнительные анализы показали, что эффективность дрожжевого трансформации LiOAc значительно возрастает, когда клетки собирают в середине логарифмической фазыроста и тепловому шоку в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) и ДНК при 42 ° С ^12. Инкубация всей неповрежденной дрожжей с ПЭГ имеет важное значение для эффективной трансформации, возможно, за счет повышения прикрепление ДНК к клеточной мембране, а также с помощью других эффектов на мембране ^13. Сама литий также повышает проницаемость интактных клетках ^14. Хотя большинство лабораторных S. Штаммы CEREVISIAE может быть легко преобразована с помощью преобразования LiOAc ^3, другие виды дрожжей могут быть более эффективно трансформированы с использованием альтернативных протоколов. Pichia pastoris, например, наиболее эффективно преобразуется с помощью электропорации, а не трансформации LiOAc ^13. Это имеет решающее значение, поэтому, чтобы испытать множественный методы преобразования и оптимизации инкубации и концентрации реагентов при попытке генетически модифицировать неохарактеризованных штамм дрожжей. Таким образом, эта рукопись описывает как LiOAc трansformation и электропорации также методы трансформации ауксотрофной мутанта и дикого типа S. boulardii. Заинтересованные читатели направлены на недавних обзоров для тщательной описаний эволюции трансформации дрожжей, альтернативных протоколов, и дальнейших обсуждений возможных механизмов действия ^13,15. Трансформация дрожжей с плазмиду, кодирующую легко обнаружить белок является, кроме того, важное значение для нисходящего тестирования в целях обеспечения надлежащего выражения и функцию чужеродного протеина. Myriad различные белки могут быть выбраны в зависимости от конечной цели терапевтического исследования и антителами, доступных для обнаружения белка с помощью иммуноблоттинга, ELISA, и другими методами. Протоколы для этих методов были тщательно описаны в другом месте ^16,17, и может быть использовано для определения уровней гетерологичной продукции белка из трансформированных дрожжей по сравнению со стандартными кривыми. Для целей демонстрации и показатьуспешное производство очень широко используется белка в дрожжевой биологии, эта рукопись представляет преобразование с плазмидой, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), который позволяет для последующего обнаружения с помощью флуоресцентной микроскопии.

Не менее важно, чтобы производство пробиотических микроорганизмов, которые экспрессируют гетерологичный белок является надлежащее управление и обнаружение этих микроорганизмов, обитающих внутри желудочно-кишечного тракта тканей, как описано в части трех и четырех. Администрация рекомбинантного дрожжей через желудочный зонд позволяет для доставки контролируемых количеств дрожжей непосредственно в желудок, из которого мыши C57BL / 6, естественно неспособным рвота ^18. Тем не менее, неправильное обращение животных и через желудочный зонд может привести к повреждению пищевода и перфорации, перфорация желудка, введения трахеи и аспирационной пневмонии ^19,20. Плохая техника и неопытность может, кроме того, повысить изменчивость в мышиных иммунных реакций и экспериментальной RESULTS, которые были отнесены к животным стресса на желудочный зонд ^21,22. Практика в правильной технике может, таким образом, не только ослабить животное дискомфорт, но может также увеличить точность экспериментальных результатов. Эта рукопись описывает и демонстрирует обработку животных и желудочный зонд для введения контролируемых дозах рекомбинантного дрожжей.

Наконец, важно, чтобы подтвердить успешную доставку рекомбинантного дрожжей путем анализа лимфоидных тканей на присутствие дрожжей и гетерологичного белка. Желудочно-кишечного иммунные ткани, которые могут наиболее легко и предсказуемо быть рассмотрены на присутствие дрожжей пейеровы бляшки. Пейеровы бляшки являются вторичными лимфоидных органах вдоль тонкой кишки, которые являются ключевыми сайты слизистой индукции иммунного ответа ^23. Антигены из просвета переносятся transcellularly через микроскладкой (M) клеток в эпителии и высвобождаются в пейеровы бляшки, тем самым подвергая вложитьd антиген представляющих клеток кишечного просвета содержимое. Хотя поглощение частиц через кишечный эпителий также может быть достигнуто путем бокаловидных клеток, эти клетки, как было показано только занимают частиц менее 0,02 мкм в диаметре ^24. Трансэпителиальная дендриты продлен с CD103 ⁺ дендритные клетки (ДК) также занимают небольшие частицы из просвета кишечника ^25; Однако, не существует в настоящее время никаких сообщений, демонстрирующих, что CD103 ⁺ ДК занимают частицы более бактерий. Таким образом, нетронутыми пробиотик дрожжи, среднего размера между 3-6 мкм в диаметре, скорее всего, будет рассмотрен М-клеток и переносили в пейеровы бляшки. Описанный здесь является протоколом для сбора и скрининга пейеровы бляшки для жизнеспособного рекомбинантного дрожжей, хотя эта процедура также может быть легко адаптированы для оценки поглощение пробиотических бактерий.

Таким образом, оценивая рекомбинантный пробиотик дрожжи для доставки изrapeutic белки в кишечнике требует знания в лабораторных методик, охватывающих молекулярной биологии к обработке животных и иммунологии. Представленные здесь протоколы для 1) генерация и отбор ауксотрофных штаммов дрожжей, которые могут быть легко отрицательно выбран без антибиотиков, 2) альтернативные протоколы для преобразования дрожжи и позволяют экспрессию гетерологичного белка, 3) демонстрации надлежащих методов обработки животных и желудочный зонд для внутрижелудочной доставки рекомбинантного дрожжей и 4) протоколы для коммутационной диссекции Пейера и скрининга жизнеспособного рекомбинантного дрожжей и функциональной гетерологичного белка. В совокупности эти протоколы позволят для генерации и проверки пробиотика штамма дрожжей, способных доставлять гетерологичный терапевтический белок в желудочно-кишечном тракте.

протокол

1. УФ мутагенеза для генерации Ауксотрофные штаммов дрожжей

1. Создать кривые выживаемости определение необходимой дозы УФ-облучения
   1. Подготовьте YPD (дрожжевой экстракт пептон декстроза) носитель и другие реагенты, перечисленные в таблице 1, в соответствии со стандартными процедурами ²⁶ и инокуляции единичных колоний в 5-10 мл YPD средах. Выдержите культур на роликовом барабане при температуре 30 ° CO / N до насыщения, по крайней мере 8 часов.
   2. Определить концентрацию клеток O / N культур с использованием спектрофотометра путем разбавления клеткам 1:10 в воде в пластиковую кювету. Развести клетки в концентрации 10 ⁷ клеток / мл в 20 мл стерильной дистиллированной воды.
   3. Налейте разведенного клетки в стерильный пластиковый чашку Петри и, с крышкой удалены, поместите пластины 14 см ниже ультрафиолетовой лампы.
   4. Expose клетки к последовательному 5000 мкДж и 10000 мкДж дозы УФ-облучения, извлечение 500 мкл клеток после каждого приращения такой, что клеткиотбираются после воздействия 0 мкДж, 5000 мкДж, 10000 мкДж, 15000 мкДж, 20000 мкДж, 25000 мкДж, 30000 мкДж, 40000 мкДж и 50000 мкДж УФ облучения. Передача экстрагируют образцы клеток в стерильную 1,5 мл пробирки и серийно разбавленных в 1:10 шагом в стерильной воде.
   5. Гранул клеток в каждом разведении путем центрифугирования в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют в объеме 100 мкл стерильной подходящей воды для посева дрожжевых клеток. Пипетировать полного объема ресуспендировали клеток на чашки, содержащие YPD твердые носители и использовать стерильные разбрасыватель для равномерного распределения клеток по каждой пластине.
   6. Оберните края пластины в парафильмом, чтобы предотвратить высыхание носителя и накладок в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить фото-реактивации и ремонт УФ-индуцированных мутаций. Выдержите пластины с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней, чтобы для роста жизнеспособных колоний дрожжей (рисунок 1).
   7. Подсчитайте Numbeг колоний, необязательно с помощью пера для разметки подсчитанные колонии, ручные электронные счетчика пера, или счетчика стоять с увеличением. Участок в процентах от общего объема посеянных клеток при каждой дозе мкДж УФ-облучения для построения кривой выживаемости облученных дрожжей (Рис.2).
      Примечание: гаплоидных штаммы дрожжей можно ожидать потребовать более низкие дозы УФ-облучения по отношению к диплоидных штаммов для достижения той же выживание процентов. Штамм дрожжей хватает функциональные ферментов репарации ДНК, такие как Rad1 S. CEREVISIAE мутант, может быть использован в качестве положительного контроля, чтобы указывать на наличие УФ-облучения при очень низких дозах.
   8. Определить дозу УФ мутагенеза, которые будут использоваться для скрининга путем обращения к кривой выживаемости установленном в 1.1.7. Х значение точки вдоль кривой выживаемости, где у равен 50 УФ-облучение дозой, при которой 50% дрожжей выжить. Скрининг мутантов на таком низком выживания процентов может привести кболее высокий выход успешно мутировавших штаммов, в частности, для диплоидных дрожжей. Доза выживание 50% для WT S. boulardii, как показано на рисунке 2, примерно 18 000 мкДж.
      Примечание: Хотя такие высокого дозы УФ-излучения увеличивает риск мутаций в генах для клеточных путей, отличных от ауксотрофной маркерного гена интереса, этот недостаток должен быть сбалансированным с необходимостью приводить к мутациям в обеих копиях гена ауксотрофной маркера. Для гаплоидных штаммов, в которых должны быть мутировавших только один ген копию, скрининг на более высоком выживание процентов, например, на 90%, снижает риск дополнительных мутаций и до сих пор позволяет достаточной поколения ауксотрофных мутантов.
2. УФ мутагенеза и скрининга ауксотрофных штаммов дрожжей
   1. Подготовьте дрожжи, как описано в шагах 1.1.1-1.1.3.
   2. Expose дрожжи в дозе УФ-облучения, соответствующего выживания 50%, как это определено в 1.1.8. Для WT S. boulardii, эта доза ваS определяется как примерно 18 000 мкДж (Рисунок 2).
   3. Сбор 1 мл объемы УФ облучении дрожжей и осадка путем центрифугирования в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. супернатант и ресуспендирования клеток вытяжку в 100 мкл стерильной воды.
      1. Выбор мутантов
         1. При использовании выбор таких как с ura3 ^- ауксотрофные мутанты, пластина облучается дрожжи на среде, содержащей 5-fluoroorotic кислоту (5-FOA) дл отбора клеток, не содержащих функциональным геном URA3 фермент.
            Примечание: Любые дрожжи, содержащий функциональные копии URA3 будет преобразовывать к 5-FOA, чтобы токсин 5-фторурацила, что приводит к гибели клеток и позволяет легко отбора ura3 - колоний, в которых отсутствует функциональным геном URA3 ^27. Аналогичные подходы отбора возможны для Lys2 и LYS5; маркеров и MET2 и MET15 использованием средств массовой информации, содержащие альфа-аминоадипиновая кислоты ^28; TRP1; 5-фторантраниловой кислоты ^29; и метил ртути ^30,31, соответственно.
         2. Внесите 100 мкл ресуспендировали клеток на минимальных средах, содержащих 5-FOA и использовать стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия пластины. Обертка пластин в Parafilm и инкубируют перевернутом при 30 ° С в течение 2-4 дней, чтобы позволить для роста жизнеспособных колоний дрожжей.
         3. Подтвердите URA3 ^- фенотип любой колонии, появляющиеся на 5-FOA пластин повторного посева штрихом на YPD, урацил ^- и 5-FOA пластины (Рисунок 3). Используйте кончик стерильным зубочисткой, чтобы собрать часть одной колонии и аккуратно перетащите ячейки на свежем YPD, урацил ^- и 5-FOA пластин. Опять инкубировать обернутые пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
            Примечание: жизнеспособных колоний появится как поднял, примерно круговые наросты в то время нежизнеспособных клеток появится только в виде непрозрачной мазке без каких-либо поднятых наростов (рисунок 3).
      2. Screening мутантов
         1. Если генерации ауксотрофного мутанта, для которых методы отбора не доступен, подготовить последовательные 1:10 разведения УФ облучении дрожжевых клеток в стерильной воде и пипетки разведения на YPD СМИ, используя стерильный разбрасыватель для равномерного Покройте пластину.
         2. Оберните пластин в парафильмом и инкубировать с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней. Определить, какой разбавление допустимую для роста отдельных колоний, которые можно легко отличить друг от друга, как правило, не более примерно 100 колоний на чашку.
         3. Повторите УФ мутагенеза пробах дрожжей, как описано в 1.2.1-1.2.3 и пластинчатых клеток при этом определенной разбавления. Внесите разведенные дрожжи на YPD СМИ, использовать стерильные разбрасыватель распределить клетки и инкубировать обернутые пластины с ног на голову на 30 ° С в течение 2-4 дней.
         4. Экран для ауксотрофам по реплик на селективной среде, лишенных метаболит интерес. Во-первых, обеспечить стерильную бархатную подушку на тарелке стендеи пластину перевернули с УФ облучении колоний на бархате, отмечая ориентацию пластины.
         5. Далее, инвертировать свежий пластину, в которых отсутствует метаболит интерес на бархата и слегка придавить, чтобы передать клеток из бархата на тарелку. Хранить исходный планшет при 4 ° С. Оберните и инкубировать новый планшет вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
         6. В качестве альтернативы реплик, мутантов экране, повторно полосатость колоний от YPD на селективных средах. Используйте кончик стерильным зубочисткой, чтобы собрать часть одной колонии и аккуратно перетащите ячейки на свежем YPD пластины и пластины, лишенного метаболит интерес. Опять инкубировать обернутые пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-4 дней.
            Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы выбрать отдельные колонии и серию из колонии несколько раз, чтобы подтвердить однородное население верных ауксотрофных клеток.
   4. Далее подтвердить фенотип облученных клеток путем inoculatING отдельных колоний в 5-10 мл как YPD и СМИ, не имеющих соответствующего метаболита (например, в урацил ^{- медиа} для URA3 ^- мутанта). Инкубируйте на роликовом барабане при 30 ° CO / N, чтобы подтвердить рост клеток в YPD сред, но не в отсутствие метаболита.
      Примечание: Хотя модели роста на твердых средах следует четко указать дрожжей ауксотрофного статус, это возможно для некоторых дрожжей терпеть стрессы и образуют небольшие медленно растущей колонии на твердых средах, но еще не потерпит таких же условий в жидких средах (неопубликованные наблюдения). Прививка в жидких культурах должны, таким образом, быть выполнена тщательно подтвердить динамику роста УФ облучении мутантов.
   5. Для длительного хранения подтвержденных ауксотрофных мутантов, подготовить запасы глицерина путем инокуляции клеток в 10 мл YPD и инкубации на валец O / N при 30 ° С. Гранул клетки центрифугированием в течение 3 мин при 2500 XG и аспирации СМИ. Ресуспендируют клеток в 50%стерильно фильтруют глицерин, трансфер в криопробирку и хранить при температуре -80 ° C.
      Примечание: УФ мутагенезу дрожжи потенциально содержат мутации в других, чем в ауксотрофной маркера интерес множества генов. Прежде чем продолжить с использованием проверенных ауксотрофных мутантов, эти штаммы должны быть дополнительно проанализированы с помощью секвенирования генов и оценки стойкости к рН, напряжений желчных кислот и других характеристик, относящихся к пробиотических штаммов, как описано в другом месте ^2. Кроме того, применение ПЦР гомологии или CRISPR / cas9 нацеливания более избирательно мутировать ауксотрофные маркеры должны быть рассмотрены в качестве альтернативы УФ мутагенеза ^{4 - 6.}

Трансформация 2. Дрожжи

1. LiOAc Трансформация дрожжей
   1. Привить одиночные колоний дрожжей в 5-10 мл YPD СМИ и инкубировать на валец при 30 ° CO / N.
   2. Чтобы вызвать рост логарифмической фазе и повышение эффективности плазмиды поглощения, деКонцентрация лить клеток с использованием спектрофотометра для измерения разведении 1:10 клеток в стерильной воде в пластиковую кювету. Развести O / N культур до оптической плотности ₆₀₀ из 0.16-0.2 (приблизительно 2 х 10 ⁶ - 2,5 х 10 ⁶ клеток / мл) в 50 мл свежего теплого YPD и инкубировать клетки на орбитальном шейкере платформы не установлен в 200 оборотов в минуту до культуры достигает примерно 1 × 10 ⁷ клеток / мл, обычно около 4 ч.
      Примечание: Эффективность трансформации можно измерить как функцию количества успешно трансформированных образующих дрожжи колонии единиц (КОЕ) на мкг ДНК плазмиды. Увеличение результатов эффективности в более трансформированных колоний на мкг ДНК плазмиды. Субкультивирование дрожжевых клеток и сбор во время роста логарифмической фазе является одним из факторов, который увеличивает эффективность трансформации ^12.
   3. Гранул клетки центрифугированием при 2500 х г в течение 3 мин.
   4. Аспирата супернатант и передачи клеткам в 1,5 мл трубки микроцентрифужных ресуспендирования ПеллET в 1 мл стерильной воды.
   5. Гранул клетки центрифугированием при 16000 х г в течение 1 мин в микроцентрифуге, аспирата супернатант и промыть клетки ресуспендируя в 1 мл ТЕ / LiOAc (Трис ЭДТА LiOAc) буфера.
   6. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в буфере ТЕ / LiOAc до концентрации 2 ^{х 10 9} клеток / мл.
   7. Подготовьте смеси трансформации с каждым из следующих: 50 мкл приготовленной дрожжей в буфере ТЕ / LiOAc, 5 мкл ДНК-носителя (10 мкг / мкл) и 1 мкл ДНК плазмиды (1 мкг). Микрограммов плазмидной ДНК можно титровать как увеличение количества ДНК может или не может привести к увеличению эффективности трансформации ³²
      Примечание: Для мутантного штамма дрожжей хватает одного ауксотрофного маркер, только один плазмиду, кодирующую маркер может быть преобразована в образце. Кроме того, использование плазмиды, кодирующей легко детектируемый белок, такой как GFP, позволит эффективно определения надлежащего сворачивания и экспрессии гетерологичной прotein дрожжевым штаммом последующей трансформацией.
   8. Для каждого препарата, добавить 300 мкл ПЭГ / LiOAc / TE и вихря тщательно. Инкубация интактных клеток с ПЭГ имеет важное значение для эффективной трансформации ^13.
   9. Инкубируйте препаратов при 30 ° С в течение 30 мин при перемешивании путем размещения микроцентрифужных пробирок в стакане размещены на орбитальном шейкере при платформы 200 оборотов в минуту.
   10. Добавить 35 мкл ДМСО для каждой реакции и теплового шока клеток в течение 15 мин в C водяной бане 42 °. Хотя есть противоречивые сообщения о дополнительным преимуществом ДМСО ^33, теплового шока интактных дрожжевых клеток было показано, чтобы значительно повысить эффективность преобразования ^12.
   11. Вымойте клеток путем гранулирования с помощью центрифугирования, как в 2.1.5, аспирационных или пипетки надосадочную и ресуспендирования в 1 мл стерильной воды. Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы разбить осадок клеток.
       Примечание: Очень важно, чтобы тщательно удалить супернатант, так как использование средств массовой информацииd в создании компетентных клеток может ингибировать рост дрожжей и образование колоний.
   12. Повторите клеток гранулирования, как в 2.1.5, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл стерильной воды. Внесите полный объем на выборочной пластины и использовать стерильный разбрасыватель для равномерного покрытия пластины с трансформированных дрожжей.
   13. Обертка края пластин с покрытием в Parafilm чтобы предотвратить высыхание сред и инкубировать перевернутом при 30 ° С в течение 2 дней, чтобы позволить роста трансформированные клетки дрожжей. Успешное, эффективное преобразование и ауксотрофная выбор Saccharomyces CEREVISIAE дает большое количество колоний на подготовке преобразования, хотя выход может быть значительно ниже для других штаммов (рисунок 4).
   14. Хранить дрожжи пластины для краткосрочной перспективе (как правило 1-3 недели) в перевернутом положении и закрытого при 4 ° С. Подготовьте запасы глицерина трансформированных дрожжей, как описано в 1.2.5 для длительного хранения.
       Примечание: Дальнейшие исследования тестирование превращается CFU необходимы для определения стабильности плазмид и оценивать надлежащий экспрессию гетерологичного белка. Тщательные описания стабильности плазмиды ^34, использование иммуноблоттинга для обнаружения денатурированные белки восстановленные из образцов клеток ^17, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для обнаружения правильно уложенный трехмерные белки ^{16 и} использование GFP в дрожжевых исследований ³⁵ доступны в другом месте. Рисунок 6 показан репрезентативный образ успешного выражения GFP в трансформированном S. CEREVISIAE относительно нетрансформированных клеток. Использование такого флуоресцентного белка является одним из способов эффективного определения успешного производства гетерологичный белок.
2. Электропорация дрожжей
   1. Привить одиночные колоний дрожжей в 5-10 мл YPD СМИ и инкубировать на валец при 30 ° CO / N.
   2. Определить концентрацию клеток с использованием спектрофотометра для измерения разведении 1:10 клеток в стерильной воде. дилютня O / N культуры в 100 мл свежих теплые YPD СМИ к OD ₆₀₀ эквивалент приблизительно 0,3. Инкубируйте субкультуры при 30 ° С на орбитальном наборе платформа шейкера до 200 оборотов в минуту до достижения внешний диаметр ₆₀₀ примерно 1,6, обычно 4-5 ч. Каждые 100 мл субкультура будет генерировать достаточно условные ячейки для двух реакций трансформации.
   3. Гранул клетки центрифугированием при 2500 х г в течение 3 мин. Аспирируйте супернатант и промыть клетки путем ресуспендирования в 50 мл охлажденного на льду стерильного воды. Повторите стирать гранулирования клетки, аспирации супернатант, и ресуспендирования в свежей 50 мл ледяной стерильной водой.
   4. Гранул клетки снова и ресуспендируют в 50 мл охлажденного льдом буфера (электропорации 1 М сорбит, 1 мМ CaCl _2).
   5. Повторите спин, как в 2.2.3, аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл 0,1 М LiOAc / 10 мМ DTT. Инкубируйте клеточной суспензии на роликовом барабане при 30 ° С в течение 30 мин. Преинкубация клеток в LiOAc и DTT синергически повышаетЭффективность электропорации ^36.
   6. Гранул клетки как в 2.2.3, удалить супернатант, и мыть путем ресуспендирования в 50 мл ледяной буфера холодной электропорации. Повторите центрифугирования и ресуспендирования клеток в ледяной буфера холодной электропорации до конечного объема 1 мл.
   7. Подготовьте на льду: кондиционером дрожжевых клеток, стерильные электропорации кюветы и плазмидной ДНК. Сразу же после окончательного взмучивания условных клеток в буфере электропорации 1 мл, сочетать 400 мкл условные дрожжевых клеток примерно 1 мкг плазмидной ДНК и добавить к охлажденному льдом 0,2 мкм электропорации кюветы. Использование повышенных количеств ДНК может незначительно повысить эффективность преобразования ^11. Инкубируйте реакции на льду в течение 5 мин, затем электропорации с множеством электропораторе 2,5 кВ и 25 мкФ.
      Примечание: Как описано в 2.1.7, мутант штамма дрожжей хватает одного ауксотрофного маркер может быть трансформирован только один плазмиду, кодирующую мутированный маркер на отсчет. Кроме того, с помощьюплазмида, которая кодирует детектируемый белок легко такие как GFP позволяет эффективно определения надлежащего сворачивания и экспрессии гетерологичного белка последующей трансформацией.
   8. Передача электропорации клетки в 8 мл смеси 1: 1 YPD: 1 М сорбит, и позволяют клеткам инкубировать на роликовом барабане при 30 ° С в течение 60 мин.
   9. Гранул клетки как в 2.2.3 и ресуспендируют в 100 мкл 1: 1 YPD: 1 М сорбит. Пластинчатый полный объем на селективных средах, содержащих 1 М сорбит, обернуть края пластин в Parafilm, и инкубировать пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2-5 дней, чтобы позволить роста трансформированные клетки дрожжей.
      Примечание: Очень важно, чтобы тест-трансформированных дрожжей оценить надлежащую экспрессию гетерологичного белка, как описано в 2.1.14 и 2.2.7.

3. желудочный зонд мышей с трансформированных дрожжей

1. Выполните все процедуры по уходу за животными и обработки в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных Animals и институциональная Уход за животными и утверждение Используйте комитета.
2. Подготовьте O / N дрожжевых культур путем посева отдельных колоний трансформированных ауксотрофной дрожжей в 5-10 мл селективной среде. Инкубируйте культур O / N в течение по крайней мере 8 ч на вальцовой барабане при температуре 30 ° С до тех пор, пока насыщенный.
   Примечание: Использование плазмиды, кодирующей тестовых белков, таких как GFP позволит для простоты тестирования экспрессии белка в дрожжах через желудочный зонд, как описано в 4.7.
3. Для максимальной индукции экспрессии белка и, чтобы вызвать рост логарифмической фазе, готовят субкультуры от O / N культуры путем разбавления до OD _600, эквивалентному примерно 0.16-0.2 в 50 мл соответствующих средах, как описано в 2.1.2.
4. Определить концентрацию пересевают клетки, как в 1.1.2 и отрегулировать до 10 ⁹ клеток / мл. Подготовьте дозу 100 мкл для каждой мыши, с несколькими сотнями мкл дополнительного объема в группе для повышения точности и легкости загрузки образца.
5. Гранул клетки центрифугированием при 2500 мкг в течение3 мин или в микроцентрифуге при 16000 х г в течение 1 мин. Аспирировать супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления равного объема стерилизованной воды и осторожно пипеткой вверх и вниз.
6. Зафиксируем соответствующий датчик через зонд иглу (22 г на 15-20 г мышей) на 1 мл стерильный шприц и нагрузки дрожжей образца, будучи уверенным, чтобы устранить любые пузыри и установить поршень к приращению 100 мкл. Загрузите дополнительный шприц стерильной водой до контрольных мышей через желудочный зонд и проверить на наличие любого загрязняющего дрожжей.
7. Возьмите мышь, чтобы быть введенным зондом с использованием не доминантной рукой, с указательным и большим пальцем плотно захватывая кожу вокруг шеи (6А). Tuck хвост под мизинцем, чтобы предотвратить перемещение нижней части тела. Убедитесь, что рукоятка находится в безопасности, и запрещает мышь двигаться голову, чтобы предотвратить повреждение внутренних тканей во зонд.
   Примечание: Расчетный насколько через желудочный зонд игла должна быть вставлена, удерживая иглу против мыши такого, чтолуковица даже с мечевидного отростка грудины. Вставка эту длину иглы, как правило, позволяют через желудочный зонд иглы шарика, чтобы войти в живот.
8. Использование доминирующую руку, аккуратно вставьте через зонд иглу в пищевод мыши по наклонив иглу вдоль нёба и задней части горла, слегка держась левой стороны от центра. Подождите мышь проглотить лампочку иглы и позволяют игла спускаться чуть дальше к точке оценивается в 3,7 (фиг.6В). Если какой-либо ощущается сопротивление во время введения через зонд иглы или если мышь в любое время начинает задыхаться, аккуратно удалить иглу и снова попытаться найти пищевод.
9. После того, как мышь проглотил луковицу через зонд иглы, осторожно нажмите на поршень шприца для введения 100 мкл (10 ⁸ КОЕ) дрожжей непосредственно в желудок мыши.
   Примечание: Хотя мыши неспособны к рвоте любого из через желудочный зонд раствора после введения ^18,19 , это возможно для рефлюкс произойти во зонд ^21,37. Правильное вставление зондового иглы, а также регулировка громкости и вязкость раствора, может помочь ограничить рефлюкс и обеспечить точное дозирование.
10. Осторожно снимите через зонд иглу из желудка мыши и пищевода и вернуть мышь в клетке. Проверка того, что мышь дышит и движется нормально после введения через зонд для того, чтобы через желудочный зонд игла вставлена ​​в течение всей процедуры и что ни одно решение не отсасывали.

4. Урожай Патчи мышиных бляшках и Выделение жизнеспособных колоний дрожжей

1. В соответствующее время точка сообщению зонд, как правило, 4 часа, жертва мышей с использованием IACUC одобрен методы. Проверьте отсутствие отзывчивости следующей ОО крайнем случае, и использовать вторичную меру, такие как смещения шейных позвонков пожертвовать мышь. Среди прочих время также могут быть проверены, так как многочисленные исследования показали, что эффективность и сроки допринять по эпителия зависит ^38,39 частиц.
2. Положите мышь с живота полностью открытой и стерилизовать области живота опрыскиванием 70% этанола. Сделать поперечный разрез через меха и кожи с помощью ножниц, соблюдая осторожность, чтобы не повредить внутренние ткани. Вручную вырвать разрез открыть дополнительно подвергать брюшины, тонкая серозная прокладку, охватывающую органы брюшной полости. Аккуратно поднимите брюшину и сделать поперечную разрез подвергать кишечник.
3. Осторожно использовать тупые щипцов, чтобы дразнить тонкую кишку от брыжейки артерий, жира и других тканей. Защиту тонкую кишку из желудка, в верхнем левом квадранте живота мыши, чтобы слепой кишки, большой карман кишечной ткани в начале толстой кишки.
4. Изолировать пейеровы бляшки, глядя на 1-3 мм примерно круговые пятнами непрозрачной ткани вдоль тонкой кишки (рис 7). Использование изогнутых рассечение SCISсоры, срезать купол патч бляшки, оставляя поля для того, чтобы ни один из окружающего собственной пластинке не собирается.
   Примечание: Большинство мышей имеют между 4-8 легко видимых пейеровы бляшки. Выполнение процедуры в районе с прямым верхним освещением увеличит легкость, с которой пейеровы бляшки могут быть визуализированы.
5. Собрать расчлененный пейеровых бляшек в полном Айскоува в модифицированной медиа (IMDM) Дульбекко.
   Примечание: Очень важно, чтобы использовать стерильную технику и включают антибиотики в сборе информации в целях предотвращения желудочно бактериального заражения дрожжей пластин.
6. патчи штамма бляшки через ячейки фильтра 40 мкм для устранения сбора информации. патчи мыть бляшки с свежей полной IMDM более 50 мл пробирку и использовать поршень из шприца емкостью 1 мл, чтобы аккуратно разбить пейеровы бляшки. Гранул натянутые клетки центрифугированием при 1800 оборотов в минуту в течение 7 мин. супернатант и ресуспендирования клеток вытяжку вконечный объем приблизительно 100 мкл.
7. Применить напряженные клеток на селективных средах дрожжей и использовать пластины разбрасыватель для равномерного распределения клеток. Обертка края пластины в Parafilm и инкубировать пластины вверх дном при 30 ° С в течение 2 дней, чтобы позволить для роста любого жизнеспособного дрожжей, извлеченного из пластырей мышиного Пейера.
   Примечание: Дальнейшие исследования после восстановления дрожжей из пейеровых бляшек 'необходимы, чтобы подтвердить, что штаммы способны доставить правильно уложенного чужеродного протеина в этих иммунных тканей. Как описано в 2.1.14, такие методы могут включать иммуноблоттинга, ИФА, или флуоресцентной микроскопии для обнаружения флуоресцентные белки, такие как GFP ^2,40.

Результаты

Генерация кривой выживаемости следующей УФ-облучения требует металлизацию разбавленных дрожжевых клеток таким образом, что различные колониеобразующих единиц (КОЕ) способны образовывать. Каждый образец 500 мкл собирали, как описано выше, содержит около 5 ^{х 10 6} кл...

Обсуждение

Вместе протоколы в данном документе описываются основные шаги, необходимые для разработки и тестирования ауксотрофных пробиотических штаммов дрожжей для доставки гетерологичной терапевтического белка в кишечнике. Эта манипуляция и тестирование рекомбинантного пробиотика дрожжей ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053