Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Résumé

Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l'expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Résumé

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

micro-organismes probiotiques sont des moyens potentiels intrigants de manière efficace et économique la prestation protéines hétérologues dans le tractus gastro-intestinal. Ces organismes sont capables de survivre passage à travers le tractus gastro-intestinal pour l'instant ne coloniser ^1, ce qui permet un dosage contrôlé et en limitant l'exposition au médicament exprimé. En outre, la capacité de construire facilement ces organismes pour produire une protéine hétérologue à grande échelle les rend une alternative économique aux particules de livraison synthétiques. Cependant, le développement d'une telle approche, comme l'a montré récemment l'aide d'une souche auxotrophe de la levure Saccharomyces probiotiques boulardii ^2, nécessite la connaissance des techniques de laboratoire ne sont pas traditionnellement associés au sein d'une étude donnée, allant de la levure et de la biologie moléculaire pour les techniques de manipulation des animaux et des méthodes immunologiques. Ainsi, bien que les procédures individuelles décrites ici ne sont pas en eux-mêmes nouveauxles protocoles de laboratoire, le but de ce manuscrit est de présenter une introduction unifiée pour les techniques nécessaires pour les tests expérimentaux de la levure probiotique en tant que véhicules de délivrance de médicaments à l'appareil gastro-intestinal murin. Fourni est une compilation des protocoles essentiels pour: 1) la génération de souches mutantes auxotrophes de levure qui peut facilement être génétiquement manipulés; 2) la transformation de cultures de levure pour exprimer une protéine hétérologue; 3) l'administration de levure recombinante à l'intestin par gavage; et 4) la récupération de viable levure probiotique recombinant de l'intestin de souris et l'évaluation de leur expression de la protéine hétérologue.

En premier lieu, bien que de nombreuses méthodes de sélection positive et négative existent pour la manipulation des espèces de levures, de sélection négative tel que par l'utilisation de marqueurs auxotrophes augmente à la fois l'efficacité et la facilité avec laquelle la levure peut être transformée et sélectionnée. sélection positive des transformants en utilisant des antibiotiques, en collaborationntrast, augmente considérablement le coût de la manipulation de levure. En outre, la sélection de la levure sur un milieu solide contenant antibiotiques peut permettre d'accroître la croissance de colonies de fond non transformées par rapport à la sélection de la levure auxotrophe sur une chute de synthèse sur milieux solides (observations non publiées). levure auxotrophe est souches qui manquent d'enzymes essentiels pour la synthèse des acides aminés essentiels ou uracile. Cette levure peut se développer que si elle est complétée avec le métabolite manquant ou gène métabolique, permettant ainsi une sélection négative lorsque la levure est plaquée sur chute de synthèse sur les médias qui manque le métabolite essentiel. Beaucoup de Saccharomyces souches couramment utilisées en laboratoire cerevisiae sont en fait déjà mutants auxotrophes ^3. souches de levures probiotiques industrielle, cliniques et, cependant, sont généralement prototrophe avec la capacité de synthétiser tous les éléments nutritifs nécessaires. Pour permettre la manipulation génétique plus efficace de cette levure, gènes auxotrophes peuvent être ciblés de façon sélectivepour générer des souches qui peuvent être sélectionnés sans antibiotiques. Un ciblage spécifique des gènes marqueurs auxotrophes peut être obtenue par disruption génique médiée par PCR reposant sur ​​la recombinaison homologue ou, plus récemment, par le biais CRISPR / cas9 ciblage ^4-6. Alternativement, la mutagenèse UV peut générer rapidement des mutants auxotrophes même dans des souches de levure pour lesquels la transformation avec de multiples plasmides est techniquement difficile ^7. Bien que le ciblage PCR et CRISPR / cas9 ont été décrits en détail ailleurs, présenté dans la première partie de ce manuscrit est un protocole détaillé décrivant une approche de mutagenèse UV pour créer des souches auxotrophes qui permettront de sélection négative plutôt que de sélection antibiotique positif de transformants de levure.

L'étape suivante nécessaire à l'utilisation de telles souches auxotrophes pour l'administration orale de la protéine hétérologue est une levure transformation avec de l'ADN plasmidique. Depuis la première transformation réussie de yeast sphéroplastes déclarés pour Saccharomyces cerevisiae en 1978 ^8, de nombreuses modifications ont été caractérisées pour accroître l'efficacité et la facilité avec laquelle les espèces de levure peuvent être génétiquement modifiés. Utilisation d'électroporation pour la transformation réussie de l'ADN dans S. cerevisiae a été décrite la première fois en 1985 et ⁹ a depuis été améliorées par l'addition de 1 M sorbitol incubation à osmotique des cellules de soutien ^10. L'efficacité d'électroporation a été démontré en outre dépendre de l'espèce de levure et de la souche, le nombre de cellules et la phase de croissance, le volume d'électroporation, l'intensité du champ, et des tampons spécifiques ^11. Lithium acétate (LiOAc) transformation, initialement décrite par Ito et al. ^12, est parmi les protocoles de transformation les plus couramment utilisés car il ne nécessite aucun équipement spécial. Des analyses complémentaires ont montré que l'efficacité de transformation de la levure LiOAc augmente considérablement lorsque les cellules sont recueillies dans la phase mid-logde l'évolution et sont un choc thermique en présence de polyéthylène glycol (PEG) et de l'ADN à 42 ° C ^12. Incubation de levure intactes ensemble avec le PEG est essentiel pour la transformation efficace, peut-être par l'amélioration de la fixation de l'ADN sur la membrane cellulaire, ainsi que par d'autres effets sur la membrane ^13. Lithium soi augmente également la perméabilité des cellules intactes ^14. Bien que la plupart laboratoire S. souches cerevisiae peuvent être facilement transformées en utilisant LiOAc transformation ^trois, d'autres espèces de levure peuvent être plus efficacement transformés en utilisant des protocoles alternatifs. Pichia pastoris, par exemple, est le plus efficacement transformé par électroporation plutôt que LiOAc transformation ^13. Il est donc essentiel de tester multiple méthodes de transformation et d'optimiser les périodes d'incubation et les concentrations de réactifs lors de la tentative de modifier génétiquement une souche de levure non caractérisée. Ce manuscrit décrit ainsi à la fois LiOAc transformation et l'électroporation que des techniques pour la transformation de mutant auxotrophe et de type sauvage S. boulardii. Les lecteurs intéressés sont dirigés vers derniers avis sur descriptions approfondies de l'évolution de la transformation de la levure, d'autres protocoles, et d'autres discussions sur les mécanismes d'action possibles ^13,15. Transformation de la levure avec le plasmide codant pour une protéine facilement détectable est en outre essentiel pour les tests en aval, afin d'assurer l'expression et la fonction de la protéine hétérologue appropriée. protéines différentes Myriad peuvent être choisis en fonction de la finalité de l'étude thérapeutique et les anticorps disponibles pour la détection de protéines par immunoblotting, ELISA, et d'autres techniques. Les protocoles pour ces techniques ont été décrites en détail ailleurs ^16,17, et peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux de production de protéine hétérologue de la levure transformée par comparaison avec des courbes d'étalonnage. Pour des fins de démonstration et de montrerproduction réussie d'une protéine très couramment utilisé dans la levure biologie, ce manuscrit présente transformation avec la protéine de plasmide codant pour fluorescente verte (GFP), ce qui permet une détection ultérieure en utilisant la microscopie de fluorescence.

Tout aussi important pour la production d'organismes probiotiques qui expriment la protéine hétérologue est la bonne administration et la détection de ces micro-organismes dans les tissus gastro-intestinaux, comme il est décrit dans les parties trois et quatre. L'administration de levure recombinante par gavage par voie orale permet de réceptionner des quantités contrôlées de levure directement dans l'estomac, à partir duquel souris C57BL / 6 sont naturellement incapables de ¹⁸ vomissements. Cependant, la manipulation des animaux impropre et gavage peuvent entraîner des lésions de l'œsophage et de perforation, perforation gastrique, l'administration de la trachée, et une pneumonie par aspiration ^19,20. Une mauvaise technique et l'inexpérience peuvent en outre augmenter la variabilité dans les réponses immunitaires murines et resu expérimentaleLTS, qui ont été attribués au stress des animaux lors de gavage oral ^21,22. Pratique dans la bonne technique peut donc non seulement atténuer l'inconfort des animaux, mais peut aussi augmenter la précision des résultats expérimentaux. Ce manuscrit décrit et démontre la manipulation des animaux et gavage oral pour l'administration des doses contrôlées de levure recombinante.

Enfin, il est essentiel de confirmer la livraison réussie de levure recombinante en analysant les tissus lymphoïdes de la présence de la levure et de la protéine hétérologue. Les tissus immunitaires gastro-intestinaux qui peuvent plus facilement et de manière prévisible être examinés pour déterminer la présence de la levure sont les plaques de Peyer. Les plaques de Peyer sont des organes lymphoïdes secondaires le long de l'intestin grêle qui sont les principaux sites de muqueuses induction de la réponse immunitaire ^23. Les antigènes de la lumière sont transmis à travers transcellularly microfold (M) des cellules de l'épithélium et sont libérés dans les plaques de Peyer, exposant ainsi enfermerd cellules présentant l'antigène à intestinale au contenu de la lumière. Bien que l'absorption des particules à travers l'épithélium intestinal peut également être réalisée par les cellules caliciformes, ces cellules ont été représentés pour ne prendre que des particules inférieure à 0,02 um de diamètre ^24. Dendrites transépithéliaux étendus à partir de cellules dendritiques CD103 ⁺ (DC) prennent également de petites particules à partir du lumen intestinal ^25; cependant, il n'y a pas de rapports démontrant que CD103 ⁺ DC prennent des particules plus grosses que les bactéries. Ainsi, la levure probiotique intact, de taille moyenne comprise entre 3-6 um de diamètre, sont plus susceptibles d'être absorbé par les cellules M et transféré dans les plaques de Peyer. Décrit ici est un protocole pour la collecte et le dépistage des plaques de Peyer de levure recombinante viable, bien que cette procédure peut également être facilement adapté pour évaluer l'absorption de bactéries probiotiques.

En résumé, l'évaluation de la levure probiotique recombinant pour la livraison de laprotéines thérapeu- à l'intestin nécessite la maîtrise des techniques de laboratoire couvrant la biologie moléculaire à la manipulation des animaux et de l'immunologie. Présentés ici sont des protocoles pour 1) la génération et la sélection de souches de levure auxotrophes qui peut être facilement sélectionné négativement sans antibiotiques, 2) protocoles alternatifs pour transformer la levure et permettre l'expression de la protéine hétérologue, 3) des démonstrations de techniques de manipulation des animaux appropriés et gavage oral pendant livraison intragastrique de levure recombinante, et 4) des protocoles pour le patch de la dissection de Peyer et le dépistage de la levure recombinant viable et protéine hétérologue fonctionnel. La combinaison de ces protocoles de permettre la production et l'essai d'une souche de levure probiotique capable de délivrer la protéine thérapeutique hétérologue dans le tractus gastro-intestinal.

Protocole

1. mutagenèse UV pour générer auxotrophes souches de levure

1. Générer des courbes de survie pour déterminer les doses nécessaires de l'irradiation UV
   1. Préparer YPD (extrait de levure peptone dextrose) les médias et d'autres réactifs énumérés dans le tableau 1 selon les procédures standard ²⁶ et ensemencer des colonies isolées dans 5-10 ml de YPD médias. Incuber les cultures sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N à la saturation pendant au moins 8 heures.
   2. Déterminer la concentration cellulaire de O / N cultures à l'aide d'un spectrophotomètre en diluant les cellules 01 heures 10 dans l'eau dans une cuvette en matière plastique. Diluer les cellules à une concentration de 10 ⁷ cellules / ml dans 20 ml d'eau distillée stérile.
   3. Verser cellules diluées dans un plat en plastique stérile Petri et, avec le couvercle retiré, placer la plaque 14 cm sous une lampe UV.
   4. Exposer les cellules à série 5000 pJ et 10.000 doses pJ de l'irradiation UV, l'extraction de 500 pi de cellules après chaque incrément de telle sorte que les cellulessont échantillonnés après une exposition à 0 pJ, 5000 pJ, 10.000 pJ, 15.000 pJ, 20.000 pJ, 25.000 pJ, 30.000 pJ, 40.000 pJ, et 50.000 pJ de rayonnement UV. des échantillons de cellules de transfert extrait de stériles tubes de 1,5 ml et diluer en série à 1:10 incréments dans de l'eau stérile.
   5. Un culot de cellules dans chaque dilution par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un volume de 100 pi d'eau stérile appropriée pour le placage des cellules de levure. Pipeter le volume complet de cellules remises en suspension sur des plaques contenant des milieux solides YPD et utiliser un épandeur stérile afin de répartir uniformément les cellules dans chaque plaque.
   6. Enveloppez bords de la plaque de parafilm pour éviter le dessèchement des médias et des plaques de recouvrement dans une feuille d'aluminium pour éviter photo-réactivation et la réparation des mutations induites par les UV. Incuber les plaques à l'envers à 30 ° C pendant 2-4 jours pour permettre la croissance de colonies de levure viables (figure 1).
   7. Comptez le number des colonies, éventuellement avec l'aide d'un stylo pour marquer colonies comptées, un compteur électronique stylo à main, ou un compteur stand avec grossissement. Terrain en pourcentage du nombre total de cellules étalées à chaque dose d'irradiation UV pJ pour générer une courbe de survie de la levure irradiées (figure 2).
      REMARQUE: Les souches de levure haploïdes peuvent être devraient nécessiter des doses plus faibles d'irradiation UV par rapport aux souches diploïdes pour atteindre le même pour cent survie. Une souche de levure dépourvue d'enzymes de réparation d'ADN fonctionnelles, telles que le S. rad1 cerevisiae mutante, peut être utilisé en tant que témoin positif pour indiquer la présence d'une irradiation UV à des doses très faibles.
   8. Déterminer la dose de mutagénèse UV à être utilisé pour le criblage en se référant à la courbe de survie établies en 1.1.7. Le x valeur du point le long de la courbe de survie où y est égal à 50 est la dose d'irradiation UV à laquelle 50% de la levure survivre. Dépistage mutants à ce faible taux de survie pour cent peut entraîner unerendement plus élevé des souches mutées avec succès, en particulier pour la levure diploïde. La dose de survie de 50% pour S. WT boulardii, comme représenté sur la figure 2, est d'environ 18 000 pJ.
      NOTE: Bien que de telles doses de rayons UV augmentent le risque de mutations dans les gènes pour les voies cellulaires autres que le gène marqueur auxotrophe d'intérêt, cet inconvénient doit être mis en balance avec la nécessité d'induire des mutations dans les deux copies du gène marqueur auxotrophe. Pour les souches haploïdes dans lequel une seule copie du gène doit être muté, le dépistage à un pour cent de survie plus élevé, comme à 90%, diminue le risque de mutations supplémentaires et permet encore à la production suffisante de mutants auxotrophes.
2. mutagenèse UV et le dépistage des souches de levure auxotrophes
   1. Préparer la levure comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.3.
   2. Exposer la levure à la dose d'irradiation UV correspondant à 50% de survie, tel que déterminé en 1.1.8. Pour WT S. boulardii, ce wa doses déterminé à environ 18.000 pJ (Figure 2).
   3. Prélever 1 ml volumes d'UV irradiés levure et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 16.000 g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 pi d'eau stérile.
      1. Sélection de mutants
         1. Si l'on utilise par exemple avec sélection ura3 ^- mutants auxotrophes, la plaque irradiée levure sur un milieu contenant de l'acide 5-fluoroorotique (5-FOA) pour sélectionner les cellules dépourvues de l'enzyme URA3 fonctionnel.
            Remarque: Tous les levures contenant des copies fonctionnelles de Ura3 convertit 5-FOA à la toxine 5-fluoro-uracile, ce qui conduit à la mort cellulaire et permettant une sélection aisée des ura3 - colonies qui ne possèdent pas de ²⁷ URA3 fonctionnel. Approches de sélection analogues sont possibles pour les LYS2 et LYS5; marqueurs et MET2 et MET15 utilisant des supports contenant α-aminoadipique ^28; TRP1; 5-fluoroacide anthranilique ^29; et ^30,31 de mercure de méthyle, respectivement.
         2. Introduire à la pipette 100 ul de cellules remises en suspension sur un milieu minimal contenant du 5-FOA et utiliser un épandeur stérile uniformément manteau de la plaque. Envelopper les plaques dans du Parafilm et incuber à l'envers à 30 ° C pendant 2-4 jours pour permettre la croissance de colonies de levure viables.
         3. Confirmer la ura3 ^- phénotype d'une colonie apparaissant sur ​​5-FOA plaques par restreaking sur YPD, uracile ^- et des plaques 5-FOA (Figure 3). Utilisez la pointe d'un cure-dent stérile pour recueillir une partie d'une seule colonie et faites glisser doucement les cellules à travers frais YPD, uracile ^-, et plaques 5-FOA. incuber à nouveau plaques enveloppé la tête en bas à 30 ° C pendant 2-4 jours.
            NOTE: Les colonies viables apparaissent comme soulevé, environ croissances circulaires alors que les cellules non viables apparaissent seulement comme un frottis opaque sans excroissances soulevées (figure 3).
      2. Screening de mutants
         1. Si la génération d'un mutant auxotrophe pour lesquels les méthodes de sélection ne sont pas disponibles, préparer série des dilutions 1:10 de UV irradiés cellules de levure dans l'eau stérile et la pipette les dilutions sur un milieu YPD, avec une spatule stérile pour bien enrober la plaque.
         2. Envelopper les plaques dans Parafilm et incuber à l'envers à 30 ° C pendant 2-4 jours. Déterminer qui dilution permis une croissance des colonies individuelles qui peuvent facilement être distinguée de l'autre, généralement pas plus de environ 100 colonies par plaque.
         3. Répétez mutagenèse UV d'échantillons de levure comme décrit dans 1.2.1-1.2.3 et plaque cellules à cette dilution déterminé. Pipeter la levure diluée sur des milieux YPD, utiliser un épandeur stérile pour distribuer les cellules, et incuber les plaques enveloppé la tête en bas à 30 ° C pendant 2-4 jours.
         4. Écran pour auxotrophes par des répliques sur support sélective dépourvues du métabolite d'intérêt. Tout d'abord, obtenir un tampon de velours stérile sur un support de plaqueet inverser la plaque avec UV colonies irradiées sur le velours, le marquage de l'orientation de la plaque.
         5. Ensuite, inverser une plaque fraîche manque le métabolite d'intérêt sur le velours et appuyez légèrement pour transférer les cellules du velours à la plaque. Stocker la plaque originale à 4 ° C. Envelopper et incuber la nouvelle plaque à l'envers à 30 ° C pendant 2-4 jours.
         6. En tant qu'alternative à des répliques, des mutants de l'écran par des colonies de re-stries sur YPD milieux sélectifs. Utilisez la pointe d'un cure-dent stérile pour recueillir une partie d'une seule colonie et doucement glisser les cellules à travers une plaque YPD frais et une plaque manque le métabolite d'intérêt. incuber à nouveau plaques enveloppé la tête en bas à 30 ° C pendant 2-4 jours.
            NOTE: Il faut prendre soin de sélectionner des colonies isolées et série sur colonies à plusieurs reprises pour confirmer une population homogène de véritables cellules auxotrophes.
   4. confirmer davantage le phénotype des cellules irradiées par inoculattion des colonies isolées dans 5-10 ml à la fois de YPD et des milieux dépourvus métabolite approprié (par exemple, en uracile ^- médias pour une ura3 ^- mutant). Incuber sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N pour confirmer la croissance des cellules dans un milieu YPD, mais pas en l'absence du métabolite.
      NOTE: Bien que les modèles de croissance sur milieu solide devraient indiquer clairement la levure état auxotrophe, il est possible pour de la levure à tolérer les contraintes et forment de petites colonies à croissance lente sur milieux solides, mais encore ne tolérera pas les mêmes conditions dans les milieux liquides (observations non publiées). Inoculation dans des cultures liquides doit donc être effectuée pour confirmer que les modes de fond mutants UV irradiés de croissance.
   5. Pour le stockage à long terme des mutants auxotrophes confirmés, de préparer des stocks de glycérol par les cellules d'ensemencement dans 10 ml YPD et incubation sur un rouleau tambour O / N à 30 ° C. cellules de pellets par centrifugation pendant 3 min à 2500 xg et aspirer médias. Resuspendre les cellules dans 50%glycérol filtrée stérile, transférer dans un tube cryogénique, et conserver à -80 ° C.
      NOTE: UV levure mutagénisé contient potentiellement des mutations dans plusieurs gènes autres que dans le marqueur auxotrophe d'intérêt. Avant de poursuivre l'utilisation de mutants auxotrophes vérifiées, ces souches devraient être analysés en outre par séquençage de gènes et évaluation de la résistance au pH, les contraintes de l'acide biliaire, et d'autres caractéristiques pertinentes de souches probiotiques, comme décrit par ailleurs ^deux. En outre, l'utilisation d'homologie de PCR ou CRISPR / cas9 visant à muter de manière plus sélective marqueurs auxotrophes devrait être considéré comme une alternative à la mutagenèse UV ^4-6.

2. Yeast Transformation

1. Transformation de la levure LiOAc
   1. Inoculer des colonies isolées de levure dans 5-10 ml de milieu YPD et incuber sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N.
   2. Pour induire la croissance en phase logarithmique et accroître l'efficacité du plasmide absorption, dela concentration de cellules Termine en utilisant un spectrophotomètre pour mesurer une dilution 1:10 de cellules dans de l'eau stérile dans une cuve plastique. Diluer O / N cultures à une DO ₆₀₀ de 0,16 au 0,2 (environ 2 x 10 ⁶ - 2,5 x 10 ⁶ cellules / ml) dans 50 ml de YPD frais chaud et incuber les cellules sur une plate-forme agitation réglé à 200 tours par minute jusqu'à ce que la culture atteigne environ 1 x 10 ⁷ cellules / ml, habituellement d'environ 4 heures.
      NOTE: L'efficacité de transformation peut être mesurée en fonction du nombre d'unités de levure transformées avec succès formant colonie (UFC) par pg d'ADN plasmidique. Augmentation des résultats d'efficacité dans les colonies plus transformées par ug d'ADN plasmidique. Repiquage des cellules de levure et de la collecte pendant la croissance en phase logarithmique est un facteur qui augmente l'efficacité de transformation ^12.
   3. Pellet les cellules par centrifugation à 2500 g pendant 3 min.
   4. Aspirer le surnageant et de transfert des cellules à un tube de 1,5 ml en remettant en suspension le pêleet dans 1 ml d'eau stérile.
   5. Pellet cellules par centrifugation à 16 000 xg pendant 1 minute dans une microcentrifugeuse, Aspirer le surnageant et laver les cellules par remise en suspension dans 1 ml de TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) tampon.
   6. Répéter les cellules de centrifugation et remettre en suspension dans un tampon TE / LiOAc à une concentration de 2 x 10 ⁹ cellules / ml.
   7. Préparer des mélanges de transformation à chacune des suivantes: 50 pi de levure préparée dans du tampon TE / LiOAc, 5 pi d'ADN de support (10 ug / ul) et 1 ul d'ADN plasmidique (1 ug). Microgrammes d'ADN plasmidique peut être augmentée en augmentant quantités d'ADN peuvent ou non conduire à une plus grande efficacité de transformation ³²
      NOTE: Pour une souche de levure mutante manque un marqueur auxotrophe, un seul plasmide codant pour le marqueur peut être transformé par échantillon. En outre, l'utilisation d'un plasmide codant pour une protéine facilement détectable, comme la GFP, permettra de déterminer l'efficacité de pliage et l'expression de pr hétérologue appropriéeotein par la souche de levure pour la transformation ultérieure.
   8. Pour chaque préparation, ajouter 300 pi de PEG / LiOAc / TE et le vortex à fond. L'incubation des cellules intactes avec PEG est essentiel pour une transformation efficace ^13.
   9. Incuber des préparations à 30 ° C pendant 30 min sous agitation en plaçant des tubes de microcentrifugation dans un bêcher placé sur une plate-forme secoueuse orbitale à 200 tours par minute.
   10. Ajouter 35 ul de DMSO à chaque cellule de réaction et choc thermique pendant 15 minutes dans un bain-marie à 42 °. Bien qu'il existe des rapports contradictoires de l'avantage supplémentaire de DMSO ^33, a été montré choc thermique des cellules de levure intactes d'augmenter considérablement l'efficacité de transformation ^12.
   11. Laver les cellules par granulation par centrifugation comme dans 2.1.5, aspirer ou pipetage le surnageant et remise en suspension dans 1 ml d'eau stérile. pipette doucement monter et descendre pour briser le culot cellulaire.
       NOTE: Il est essentiel d'enlever complètement le surnageant parce que l'utilisation des médiasd pour générer des cellules compétentes peut inhiber la croissance de la levure et la formation de colonies.
   12. granulation cellulaire Répéter comme en 2.1.5, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 pi d'eau stérile. Pipeter le volume complet sur une plaque sélective et utiliser un épandeur stérile uniformément de recouvrir la plaque avec de la levure transformée.
   13. Envelopper les bords de plaques revêtues de Parafilm afin d'éviter le séchage des supports et incuber à l'envers à 30 ° C pendant 2 jours pour permettre la croissance des cellules de levure transformées. Succès, une transformation efficace et la sélection auxotrophe de Saccharomyces cerevisiae donne un grand nombre de colonies par la préparation de la transformation, bien que le rendement peut être beaucoup plus faible pour d'autres souches (figure 4).
   14. plaques de levure de magasin pour le court terme (généralement 1-3 semaines) à l'envers et couvert à 4 ° C. Préparer des stocks de glycerol de levure transformée, comme décrit dans 1.2.5 pour le stockage à long terme.
       NOTE: D'autres études tests transformé CFU sont nécessaires pour déterminer la stabilité du plasmide et évaluer bonne expression de la protéine hétérologue. Descriptions approfondies sur la stabilité du plasmide ^34, l'utilisation d'un immunotransfert pour la détection des protéines dénaturées récupérés à partir d'échantillons de cellules ^17, une enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) pour détecter correctement replié trois protéines dimensions ^{16 et} l'utilisation de la GFP dans des études de levure ³⁵ sont disponibles ailleurs. Figure la figure 6 montre une image représentative de l'expression de GFP réussi à transformé S. cerevisiae par rapport aux cellules non transformées. L'utilisation d'une telle protéine fluorescente est une moyen de détermination de succès de manière efficace la production de protéines hétérologues.
2. L'électroporation de levure
   1. Inoculer des colonies isolées de levure dans 5-10 ml de milieu YPD et incuber sur un rouleau tambour à 30 ° CO / N.
   2. Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un spectrophotomètre pour mesurer une dilution 1:10 de cellules dans de l'eau stérile. diluth O / N cultures dans 100 ml de médias YPD chaudes fraîches à une DO ₆₀₀ équivalent d'environ 0,3. Incuber sous-cultures à 30 ° C sur une plate-forme Shaker Set orbitale à 200 tours par minute jusqu'à atteindre _{une DO600} d'environ 1,6, habituellement 4-5 heures. Chaque sous-culture de 100 ml générera cellules conditionnées assez pour deux réactions de transformation.
   3. Pellet les cellules par centrifugation à 2500 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et laver les cellules par remise en suspension dans 50 ml de glace de l'eau stérile froide. Répétez le lavage par granulation cellules, aspirer le surnageant et remise en suspension dans 50 ml de glace de l'eau stérile fraîche et froide.
   4. Un culot cellulaire et remettre en suspension de nouveau dans 50 ml de tampon d'électroporation de la glace froide (sorbitol 1 M, _CaCl2 1 mM).
   5. Répétez spin au point 2.2.3, aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 20 ml 0,1 M LiOAc / 10 mM de DTT. Incuber la suspension de cellules sur un rouleau tambour à 30 ° C pendant 30 min. La pré-incubation de cellules dans LiOAc et TNT augmente de façon synergétique lal'efficacité de l'électroporation ^36.
   6. Pellet les cellules comme dans 2.2.3, retirer le surnageant et laver par remise en suspension dans 50 ml de glace tampon d'électroporation froid. Répéter les cellules de centrifugation et remettre en suspension dans un tampon d'électroporation glacée jusqu'à un volume final de 1 ml.
   7. Préparer sur la glace: conditionné des cellules de levure, des cuvettes d'électroporation stérile, et l'ADN plasmidique. Immédiatement après la remise en suspension finale de cellules conditionnées dans un tampon d'électroporation de 1 ml, mélanger 400 pi de cellules de levure conditionnées à environ 1 pg d'ADN plasmidique et l'ajouter à un bain de glace froid 0,2 um cuvette d'électroporation. L'utilisation de l'augmentation des quantités d'ADN peut augmenter légèrement efficacité de transformation ^11. Incuber la réaction sur de la glace pendant 5 min, puis l'électroporation avec l'ensemble de electroporator à 2,5 kV et 25 pF.
      Remarque: Comme décrit dans 2.1.7, une souche de levure mutante manque un marqueur auxotrophe peut être transformée avec un seul plasmide codant pour le marqueur mutée par échantillon. Aussi, en utilisantun plasmide qui code pour une protéine facilement détectable tel GFP permet de déterminer l'efficacité de pliage et d'expression de la protéine hétérologue à la suite de la transformation appropriée.
   8. Le transfert des cellules à une électroporation dans 8 ml d'un mélange 1: 1 de YPD: 1 M de sorbitol et laisser incuber les cellules à tambour sur un rouleau à 30 ° C pendant 60 min.
   9. cellules à granules comme dans 2.2.3 et remettre en suspension dans 100 pi de 1: 1 YPD: 1 M sorbitol. Plaque du plein volume sur des milieux sélectifs contenant 1 M de sorbitol, envelopper les bords de plaques de Parafilm et incuber les plaques à l'envers à 30 ° C pendant 2-5 jours pour permettre la croissance des cellules de levure transformées.
      NOTE: Il est essentiel de tester levure transformée pour évaluer bonne expression de la protéine hétérologue, tel que décrit dans 2.1.14 et 2.2.7.

3. gavage oral de souris avec levure transformée

1. Effectuer toutes les procédures de soin et la manipulation des animaux selon le Guide pour les soins et l'utilisation en laboratoire Uneimals et institutionnel des soins aux animaux et à l'approbation utilisation Comité.
2. Préparer cultures O / N levure en inoculant des colonies isolées de levure auxotrophe transformé en 5-10 ml de milieu sélectif. Incuber cultures O / N pendant au moins 8 heures sur un rouleau tambour à 30 ° C jusqu'à saturation.
   NOTE: L'utilisation de protéines d'essai de codage plasmidique telles que GFP permettra de faciliter l'essai de l'expression des protéines dans la levure gavage, comme décrit dans 4.7.
3. Pour l'induction maximale de l'expression des protéines et pour induire la croissance en phase logarithmique, préparer des sous-cultures de la O / N cultures par dilution à une DO ₆₀₀ équivalent d'environ de 0,16 à 0,2 dans 50 ml de support approprié tel que décrit au paragraphe 2.1.2.
4. Déterminer la concentration de cellules repiquées comme dans 1.1.2 et ajuster à 10 ⁹ cellules / ml. Préparer une dose de 100 pi pour chaque souris, avec quelques centaines de volumes ul supplémentaire par groupe pour améliorer la précision et la facilité de chargement de l'échantillon.
5. cellules pellets par centrifugation à 2500 g pendant3 min ou dans une microcentrifugeuse à 16 000 g pendant 1 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en ajoutant un volume égal d'eau stérile et doucement pipetage de haut en bas.
6. Fixer une aiguille de gavage de calibre approprié (22 G pour 15-20 g souris) sur une seringue et de la levure de charge échantillon de 1 ml stérile, en étant sûr d'éliminer les bulles et mettre plongeur à une augmentation de 100 pi. Chargez une seringue supplémentaire avec de l'eau stérile pour les souris témoins de gavage et de vérifier la présence d'une levure de contamination.
7. Ramassez la souris pour être gavées avec la main non-dominante, avec index et le pouce saisissant fermement la peau autour du cou (figure 6A). Rentrez la queue sous le petit doigt pour empêcher le mouvement du bas du corps. Assurez-vous que la poignée est sécurisé et interdit la souris de se déplacer sa tête pour éviter d'endommager les tissus internes au cours de gavage.
   NOTE: estimer la distance de l'aiguille de gavage doit être insérée en maintenant l'aiguille contre la souris de telle sorte quel'ampoule est encore dans le processus xiphoïde du sternum. Insertion cette longueur de l'aiguille permet généralement l'ampoule de l'aiguille de gavage pour entrer dans l'estomac.
8. Utilisation de la main dominante, insérer délicatement l'aiguille de gavage dans l'œsophage de la souris en inclinant l'aiguille le long du toit de la bouche et à l'arrière de la gorge, en gardant légèrement à gauche du centre. Attendez que la souris pour avaler l'ampoule de l'aiguille et permettre à l'aiguille de descendre un peu plus loin au point estimé dans 3.7 (figure 6B). Si aucune résistance se fait sentir lors de l'insertion de l'aiguille de gavage ou si la souris à n'importe quel moment commence à haleter, retirez délicatement l'aiguille et essayer de trouver l'œsophage à nouveau.
9. Après la souris a avalé l'ampoule de l'aiguille de gavage, appuyez doucement sur ​​le piston de la seringue pour administrer 100 pi (10 ⁸ UFC) de levure directement dans l'estomac de la souris.
   NOTE: Bien que les souris sont incapables de vomir tout de la solution après l'administration par gavage ^18,19 , il est possible pour le reflux de se produire au cours de gavage ^21,37. insertion correcte de l'aiguille de gavage, ainsi que le réglage du volume et de la viscosité de la solution, peut aider à limiter le reflux et garantir un dosage précis.
10. Retirez délicatement l'aiguille de gavage de l'estomac de la souris et de l'oesophage et de retourner la souris vers la cage. Vérifiez que la souris est la respiration et se déplaçant normalement après gavage à veiller à ce que l'aiguille de gavage a été insérée correctement tout au long de la procédure et qu'aucune solution a été aspiré.

4. Récolte de plaques de Peyer murines et isolement de colonies de levure viables

1. Au moment opportun point de post gavage, typiquement de 4 heures, les souris de sacrifice utilisant IACUC approuvé méthodes. Vérifiez manque de réactivité après une pincée de pointe, et d'utiliser une mesure secondaire tels que la dislocation cervicale à sacrifier la souris. points dans le temps peuvent également être testés, que de nombreuses études ont montré que l'efficacité et le calendrier de placeprendre à travers l'épithélium dépend ^38,39 particules.
2. Poser la souris avec l'abdomen entièrement exposé et stériliser la région abdominale par pulvérisation avec 70% EtOH. Faire une incision transversale à travers la fourrure et la peau avec des ciseaux, en faisant attention de ne pas endommager les tissus internes. fouiller manuellement l'incision ouvrir davantage à exposer le péritoine, la doublure séreuse mince recouvrant les organes abdominaux. Soulevez doucement le péritoine et de faire une incision transversale pour exposer les intestins.
3. Soigneusement utiliser le forceps émoussé pour taquiner l'intestin grêle à l'écart des artères mésentériques, de graisse et d'autres tissus. Exposer l'intestin grêle, de l'estomac, dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen de la souris, le caecum, la grande poche de tissu intestinal au début du gros intestin.
4. Isoler les plaques de Peyer par la recherche de 1-3 mm de patchs plus ou moins circulaires de tissu opaque le long de l'intestin grêle (figure 7). Utilisation de SIC de dissection courbescapteurs, couper le dôme de la plaque de Peyer, laissant des marges pour assurer qu'aucun de la lamina propria environnante est recueilli.
   REMARQUE: La plupart des souris ont entre 4-8 plaques de Peyer facilement visibles. Exécution de la procédure dans une zone avec un éclairage zénithal directe va augmenter la facilité avec laquelle les plaques de Peyer peuvent être visualisées.
5. Recueillir disséqué les plaques de Peyer dans modifiée médias (la IMDM) Dulbecco complet d'Iscove.
   NOTE: Il est essentiel d'utiliser une technique stérile et inclure des antibiotiques dans les médias de collecte afin de prévenir la contamination bactérienne gastro-intestinal de plaques de levure.
6. les plaques de Peyer souche à travers un tamis cellulaire de 40 um pour éliminer les supports de collecte. les plaques de Peyer lavage avec IMDM complet frais sur un tube de 50 ml et utiliser un piston d'une seringue de 1 ml de casser doucement les plaques de Peyer. Pellet cellules tendues par centrifugation à 1800 tours par minute pendant 7 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dansun volume final d'environ 100 ul.
7. Appliquer cellules tendues sur des supports de levure sélectives et utiliser un épandeur de plaque afin de répartir uniformément les cellules. Envelopper les bords de la plaque de Parafilm et on incube les plaques à l'envers à 30 ° C pendant 2 jours pour permettre la croissance d'une levure viables récupérées à partir des plaques de Peyer murin.
   NOTE: D'autres études après la guérison de la levure à partir de plaques de Peyer 'sont nécessaires pour confirmer que les souches sont capables de fournir protéine hétérologue correctement plié à ces tissus immunitaires. Comme décrit dans le 01.02.14, ces procédés peuvent comprendre un immunotransfert, ELISA, ou par microscopie à fluorescence pour détecter des protéines fluorescentes telles que la GFP ^2,40.

Résultats

Génération d'une courbe de survie après irradiation UV nécessite placage des cellules de levure dilués de telle sorte que les unités formant colonie (UFC) distinctes sont capables de former. Chaque échantillon de 500 ul recueillies comme décrit ci-dessus contient environ 5 x 10 ⁶ cellules; Toutefois, plus de 100 colonies par plaque sont difficiles à distinguer avec précision. Placage échantillon non dilué ainsi que série des dilutions 1:10 de cellules irradié...

Discussion

Ensemble, les protocoles ici décrivent les étapes essentielles nécessaires pour le développement et les tests de souches de levures probiotiques auxotrophes pour la livraison de la protéine thérapeutique hétérologue à l'intestin. Cette manipulation et l'expérimentation de levure probiotique recombinant nécessite des techniques et des ressources avec lesquelles tout laboratoire individu peut ne pas être actuellement familier. Ainsi, bien que de nombreuses études précédentes ont décrit les protocol...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053