Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

Riepilogo

Presentato qui è una descrizione unificata di tecniche che possono essere utilizzati per sviluppare, trasformare, amministrare e verificare l'espressione della proteina eterologa dei probiotici lievito Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduzione

microrganismi probiotici sono un intrigante potenziali mezzi di fornire in modo efficiente ed economicamente proteine ​​eterologhe al tratto gastrointestinale. Questi organismi sono in grado di sopravvivere passaggio attraverso il tratto gastrointestinale ancora non colonizzare ¹ che, consentendo dosaggio controllato e limitando l'esposizione al farmaco espresso. Inoltre, la possibilità di progettare facilmente questi organismi per produrre proteine ​​eterologhe su larga scala li rende un'alternativa economica alle particelle di consegna sintetici. Tuttavia, lo sviluppo di un tale approccio, come recentemente dimostrato mediante un ceppo auxotrophic di lievito Saccharomyces probiotici boulardii ^2, richiede la conoscenza di tecniche di laboratorio non tradizionalmente combinati all'interno di un dato studio, che vanno dal lievito e biologia molecolare alle tecniche di manipolazione degli animali e metodi immunologici. Così, sebbene le singole procedure descritte nel presente documento non sono di per sé romanzoprotocolli di laboratorio, l'obiettivo di questo manoscritto è di presentare una introduzione unificato per le tecniche necessarie per la prova sperimentale di lievito probiotico come veicoli di consegna della droga al tratto gastrointestinale murino. Fornito è una raccolta di protocolli essenziali per: 1) generazione di ceppi mutanti auxotrofi di lievito che può facilmente essere manipolato geneticamente; 2) la trasformazione di colture di lieviti per esprimere la proteina eterologa; 3) la somministrazione di lievito ricombinante per l'intestino tramite sonda gastrica; e 4) il recupero di vitale lievito probiotico ricombinante dall'intestino murino e la valutazione della loro espressione della proteina eterologa.

In primo luogo, anche se esistono numerosi metodi di selezione positivi e negativi per la manipolazione delle specie di lievito, selezione negativa ad esempio attraverso l'uso di marcatori auxotrofi aumenta l'efficienza e la facilità con cui il lievito può essere trasformata e selezionato. selezione positiva dei trasformanti che utilizzano antibiotici, in collaborazionentrast, aumenta significativamente il costo di manipolazione lievito. Inoltre, la selezione di lievito su supporti solidi antibiotici contenenti può consentire un aumento della crescita di fondo non trasformate colonie relativi alla selezione di lievito auxotrophic su goccia sintetica fuori terreni solidi (osservazioni non pubblicate). lievito auxotrophic è ceppi che mancano di enzimi fondamentali per la sintesi di amminoacidi essenziali o uracile. Tale lievito può crescere solo se integrato con il metabolita mancante o gene metabolica, consentendo in tal modo la selezione negativa quando il lievito è placcato sul calo sintetico fuori media che manca il metabolita essenziale. Molti Saccharomyces cerevisiae comunemente utilizzati ceppi di laboratorio sono infatti già mutanti auxotrofi ^3. Industriale, clinica, e ceppi di lievito probiotici, tuttavia, sono tipicamente prototrofici con la capacità di sintetizzare tutti i nutrienti necessari. Per consentire una più efficace manipolazione genetica di tale lievito, i geni auxotrofi possono essere selettivamente miratigenerare ceppi che possono essere selezionati senza antibiotici. Il targeting specifico di geni marcatori auxotrofi può essere raggiunto attraverso distruzione genica PCR-mediata affidamento su ricombinazione omologa o, più recentemente, attraverso CRISPR / Cas9 mira ^4-6. In alternativa, mutagenesi UV può generare rapidamente mutanti auxotrofi anche in ceppi di lievito per i quali la trasformazione con più plasmidi è tecnicamente difficile ^7. Mentre PCR targeting e CRISPR / Cas9 sono stati descritti ampiamente altrove, presentato nella prima parte di questo manoscritto è un protocollo dettagliato che descrive un approccio mutagenesi UV per creare ceppi auxotrofi che permetteranno di selezione negativa, piuttosto che la selezione antibiotica positivo di trasformanti lievito.

Il successivo passo necessario l'uso di tali ceppi auxotrofi consegna orale di proteine ​​eterologhe è il lievito trasformazione con DNA plasmidico. Dal momento che la prima trasformazione di successo di voti a favoret sferoplasti riportati per Saccharomyces cerevisiae nel 1978 ^8, numerose modifiche sono stati caratterizzati per aumentare l'efficienza e la facilità con cui le specie di lievito possono essere geneticamente modificate. Uso di elettroporazione per la trasformazione di successo di DNA in S. cerevisiae è stato descritto nel 1985 ⁹ e da allora è stato migliorato tramite l'aggiunta di incubazione 1 M sorbitolo al osmoticamente cellule di supporto ^10. Efficienza elettroporazione è stato inoltre dimostrato che in relazione alla specie di lievito e ceppo, numero di cellulare e fase di crescita, di volume elettroporazione, intensità di campo, e tamponi specifici ^11. Litio acetato (LiOAc) trasformazione, originariamente descritto da Ito et al. ^12, è tra i protocolli di trasformazione più comunemente utilizzati in quanto non richiede particolari attrezzature. Ulteriori analisi hanno dimostrato che l'efficienza di LiOAc lievito trasformazione aumenta notevolmente quando le cellule vengono raccolte a metà log fasedi crescita e sono calore scosso in presenza di polietilenglicole (PEG) e DNA a 42 ° C ^12. L'incubazione di intero lievito intatto con PEG è essenziale per la trasformazione efficiente, eventualmente migliorando attacco del DNA alla membrana cellulare, nonché tramite altri effetti sulla membrana ^13. Litio si aumenta la permeabilità delle cellule intatte ^14. Sebbene la maggior parte di laboratorio S. cerevisiae può essere facilmente trasformato utilizzando LiOAc trasformazione ^3, altre specie di lievito possono essere trasformati più efficiente utilizzando protocolli alternativi. Pichia pastoris, per esempio, è più efficiente trasformato tramite elettroporazione anziché LiOAc trasformazione ^13. È fondamentale, quindi, per testare multipla metodi di trasformazione e di ottimizzare tempi di incubazione e concentrazioni dei reagenti quando si tenta di modificare geneticamente un ceppo di lievito non caratterizzato. Questo manoscritto descrive così sia LiOAc transformation ed elettroporazione come tecniche per la trasformazione di mutante auxotrophic e wild type S. boulardii. I lettori interessati sono diretti alle recensioni recenti per la descrizione approfondita dell'evoluzione di lievito trasformazione, protocolli alternativi, e ulteriori discussioni di possibili meccanismi di azione ^13,15. Trasformazione di lievito con plasmide codificante una proteina facilmente rilevabile è inoltre essenziale per test a valle per garantire un'adeguata espressione e la funzione della proteina eterologa. Myriad proteine ​​diverse possono essere selezionati a seconda dello scopo finale dello studio terapeutico e gli anticorpi disponibili per il rilevamento di proteine ​​di immunoblotting, ELISA, e altre tecniche. Protocolli per queste tecniche sono state accuratamente descritto altrove ^16,17, e possono essere utilizzati per determinare i livelli di produzione di proteine ​​eterologhe dal lievito trasformato in confronto a curve standard. Ai fini della dimostrazione e per mostrareproduzione di successo di una proteina molto comunemente usato in biologia lievito, questo manoscritto presenta trasformazione con proteine ​​plasmide codificante fluorescente verde (GFP), che consente la successiva rivelazione utilizzando microscopia a fluorescenza.

Altrettanto importante per la produzione di organismi probiotici che esprimono la proteina eterologa è la corretta gestione e rilevazione di questi microrganismi all'interno dei tessuti gastrointestinali, come descritto nelle parti tre e quattro. La somministrazione di lievito ricombinante tramite gavage orale consente di erogazione di quantità controllate di lievito direttamente nello stomaco, da cui C57BL / 6 topi sono naturalmente incapaci di vomito ^18. Tuttavia, la manipolazione degli animali improprio e sonda gastrica può portare a danni esofagea e perforazione, perforazione gastrica, somministrazione tracheale, e polmonite da aspirazione ^19,20. scarsa tecnica e l'inesperienza può, inoltre, aumentare la variabilità nella risposta immunitaria murini e resu sperimentaleLTS, che sono stati attribuiti allo stress degli animali sulla sonda gastrica ^21,22. Pratica nella tecnica adeguata può attenuare quindi non solo disagio animale, ma può anche aumentare la precisione dei risultati sperimentali. Questo manoscritto descrive e dimostra la movimentazione degli animali e sonda gastrica per la somministrazione di dosi controllate di lievito ricombinante.

Infine, è fondamentale per confermare il successo di consegna di lievito ricombinante analizzando tessuti linfoidi per la presenza di lievito e proteine ​​eterologhe. I tessuti immunitarie gastrointestinali che possono più facilmente e prevedibilmente essere esaminata per la presenza di lievito sono patch di Peyer. Placche di Peyer sono organi linfoidi secondari lungo l'intestino tenue che sono i siti principali della mucosa induzione risposta immunitaria ^23. Gli antigeni dal lume vengono trasferiti attraverso transcellularly microfold cellule (M) nell'epitelio e vengono rilasciati nel patch di Peyer, quindi esponendo racchiudered cellule presentanti l'antigene di intestinali contenuto luminale. Sebbene l'assorbimento di particelle attraverso l'epitelio intestinale può essere ottenuto anche con cellule caliciformi, queste cellule hanno dimostrato di prendere soltanto particelle inferiore a 0,02 micron di diametro ^24. Dendriti transepiteliale estesi da cellule dendritiche CD103 ⁺ (DC) anche richiedere fino piccole particelle dalla intestinale lume ^25; tuttavia, attualmente non esistono rapporti che dimostrano che CD103 ⁺ DC occupano particelle più grandi di batteri. Così, intatto lievito probiotico, di dimensione media tra 3-6 micron di diametro, hanno più probabilità di essere ripreso da cellule M e trasferito alle patch di Peyer. Qui descritto è un protocollo per la raccolta e lo screening delle placche di Peyer di vitale lievito ricombinante, anche se questa procedura può anche essere facilmente adattato per valutare l'assorbimento di batteri probiotici.

In sintesi, la valutazione ricombinante lievito probiotico per la consegna delproteine ​​rapeutic per l'intestino richiede padronanza di tecniche di laboratorio che misurano biologia molecolare alla movimentazione degli animali e immunologia. protocolli qui presentati sono per 1) la generazione e la proiezione di ceppi di lievito auxotrofi che può essere facilmente negativamente selezionato senza antibiotici, 2) protocolli alternativi per trasformare il lievito e consentono l'espressione di proteine ​​eterologhe, 3) dimostrazioni di corrette tecniche di manipolazione degli animali e sonda gastrica per consegna intragastrica di lievito ricombinante, e 4) protocolli per la dissezione di patch di Peyer e lo screening di vitale lievito ricombinante e proteina eterologa funzionale. Insieme, questi protocolli consentiranno la generazione e la verifica di un ceppo di lievito probiotico in grado di erogare proteina terapeutica eterologa al tratto gastrointestinale.

Protocollo

1. mutagenesi UV per generare auxotrophic ceppi di lievito

1. Generare curve di sopravvivenza per determinare dosi necessarie di irradiazione UV
   1. Preparare YPD (estratto di lievito peptone destrosio) i media e altri reagenti elencati nella tabella 1 secondo le procedure standard ²⁶ e inoculare singole colonie in 5-10 ml di YPD media. Incubare culture su un tamburo a rulli a 30 ° CO / N alla saturazione per almeno 8 ore.
   2. Determinare la concentrazione cellulare di O / N coltura usando uno spettrofotometro diluendo cellule 1:10 in acqua in una cuvetta di plastica. Diluire le cellule ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml in 20 ml di acqua distillata sterile.
   3. Versare cellule diluite in una sterile di plastica Petri e, con il coperchio rimosso, posizionare la piastra di 14 cm sotto una lampada UV.
   4. Esporre le cellule a serie 5000 μJ e 10.000 μJ dosi di irradiazione UV, estrazione 500 ml di cellule dopo ogni incremento tale che le cellulevengono campionati dopo l'esposizione a 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, e 50.000 μJ di irradiazione UV. Trasferimento estratto campioni di cellule di sterilizzato provette da 1,5 ml e in serie diluire al 1:10 incrementi in acqua sterile.
   5. Agglomerare cellule in ciascuna diluizione mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 16.000 xg per 1 min. Aspirare il surnatante e risospendere in un volume di 100 ml di sterile adeguato acqua per la placcatura cellule di lievito. Pipettare il volume pieno di cellule risospese su piastre contenenti YPD mezzi solidi e utilizzare una spatola sterile per distribuire uniformemente le cellule su ogni piatto.
   6. Avvolgere bordi della piastra in Parafilm per evitare l'essiccazione dei media e piastre di copertura in foglio di alluminio per evitare che foto-riattivazione e riparazione di mutazioni indotte dai raggi UV. Incubare le piastre a testa in giù a 30 ° C per 2-4 giorni per consentire la crescita di colonie di lievito vitali (Figura 1).
   7. Contare il number di colonie, eventualmente con l'aiuto di una penna per delimitare colonie contate, una penna contatore elettronico portatile o un contatore stand con ingrandimento. Plot come percentuale di cellule totali placcato per ciascuna dose μJ di irradiazione UV per generare una curva di sopravvivenza per il lievito irradiato (Figura 2).
      NOTA: Haploid ceppi di lievito si può aspettare che richiedono dosi inferiori di irradiazione UV rispetto a ceppi diploidi per raggiungere lo stesso di sopravvivenza per cento. Un ceppo di lievito priva enzimi di riparazione del DNA funzionali, come il rad1 S. cerevisiae mutante, può essere utilizzato come controllo positivo per indicare la presenza di irradiazione UV a dosi molto basse.
   8. Determinare la dose di mutagenesi UV da utilizzare per lo screening facendo riferimento alla curva di sopravvivenza stabilita in 1.1.7. Il valore x del punto lungo la curva di sopravvivenza dove y è uguale a 50 è la dose di irradiazione UV alla quale il 50% di lievito sopravvivere. Screening mutanti in questa sopravvivenza bassa percentuale può comportare unamaggiore resa dei ceppi mutati con successo, in particolare per il lievito diploide. La dose di sopravvivenza del 50% per WT S. boulardii, come mostrato in figura 2, è di circa 18.000 μJ.
      NOTA: Anche se tali dosi alta UV aumentano il rischio di mutazioni nei geni per le vie cellulari diversi dal gene marcatore auxotrophic di interesse, questo inconveniente deve essere bilanciato con la necessità di indurre mutazioni in entrambe le copie del gene marcatore auxotrophic. Per i ceppi aploidi, in cui una sola copia del gene deve essere mutato, di screening ad una sopravvivenza per cento più alto, come ad esempio al 90%, diminuisce il rischio di ulteriori mutazioni e consente ancora una sufficiente generazione di mutanti auxotrofi.
2. mutagenesi UV e lo screening per i ceppi di lievito auxotrofi
   1. Preparare il lievito come descritto ai punti 1.1.1-1.1.3.
   2. Esporre lievito per la dose di irradiazione UV corrispondente al 50% di sopravvivenza, come determinato in 1.1.8. Per WT S. boulardii, questa dose was determinato in circa 18.000 μJ (Figura 2).
   3. Raccogliere 1 ml volumi di UV irradiati lievito e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga a 16.000 xg per 1 min. surnatante e risospendere le cellule Aspirare in 100 ml di acqua sterile.
      1. Selezione di mutanti
         1. Se si utilizza la selezione come ad esempio con URA3 ^- mutanti auxotrofi, piatto irradiato lievito su un supporto contenente acido 5-fluoroorotic (5-FOA) per selezionare per le cellule prive di un enzima URA3 funzionale.
            NOTA: Qualsiasi lievito contenente copie funzionali di URA3 convertirà 5-FOA alla tossina 5-fluorouracile, che porta alla morte cellulare e consentendo una facile selezione di URA3 - colonie che mancano di un URA3 funzionale ^27. Approcci di selezione analoghe sono possibili per le LYS2 e LYS5, marcatori e met2 e MET15 utilizzo dei supporti contenenti acido ^α-amino-28; TRP1; 5-fluoroL'acido antranilico ^29; e ^30,31 metil mercurio, rispettivamente.
         2. Pipettare 100 ml di cellule risospese su terreno minimo contenente 5-FOA e utilizzare una spatola sterile per uniformemente cappotto alla piastra. Wrap piastre in Parafilm e incubare capovolta a 30 ° C per 2-4 giorni per consentire la crescita di colonie di lievito vitali.
         3. Confermare il URA3 ^- fenotipo di qualsiasi colonia appaiono sul 5-FOA piastre da restreaking sul YPD, uracile ^- e le piastre 5-FOA (Figura 3). Utilizzare la punta di uno stuzzicadenti sterile per raccogliere parte di una singola colonia e trascinare delicatamente le cellule in tutto fresco YPD, uracile ^-, e le piastre 5-FOA. Ancora incubare le piastre avvolte capovolta a 30 ° C per 2-4 giorni.
            NOTA: colonie vitali appariranno come sollevato, circa crescite circolari mentre le cellule non vitali appaiono solo come uno striscio opaca senza escrescenze sollevata (figura 3).
      2. Screening di mutanti
         1. Se la generazione di un mutante auxotrophic per i quali i metodi di selezione non sono disponibili, preparati seriali 1:10 diluizioni di UV irradiati cellule di lievito in acqua sterile e pipetta le diluizioni su supporti YPD, utilizzando una spatola sterile per uniformemente cappotto alla piastra.
         2. Avvolgere le piastre in Parafilm e incubare a testa in giù a 30 ° C per 2-4 giorni. Determinare quale diluizione permesso per la crescita di colonie singole che possono essere facilmente distinti l'uno dall'altro, di solito non più di circa 100 colonie per piastra.
         3. Ripetere mutagenesi UV di campioni di lievito come descritto in 1.2.1-1.2.3 e piastra cellule in questo determinato diluizione. Pipettare il lievito diluito su supporto YPD, utilizzare una spatola sterile per distribuire le cellule e incubare le piastre avvolte capovolta a 30 ° C per 2-4 giorni.
         4. Schermo per auxotrofi di placcatura replica su supporto selettivi privi del metabolita di interesse. In primo luogo, garantire un tampone sterile di velluto su un basamento del piattoe capovolgere la piastra con le colonie irradiati UV sul velluto, che segna l'orientamento piatto.
         5. Successivamente, invertire una piastra fresca manca il metabolita di interesse sul velluto e spingere leggermente per trasferire le cellule dal velluto alla piastra. Conservare il piatto originale a 4 ° C. Avvolgere e incubare la nuova piastra capovolta a 30 ° C per 2-4 giorni.
         6. In alternativa alla placcatura replica, mutanti schermo da colonie ri-striature da YPD su terreni selettivi. Utilizzare la punta di uno stuzzicadenti sterile per raccogliere parte di una singola colonia e delicatamente trascinare le cellule attraverso una piastra YPD fresca e una piastra priva metabolita di interesse. Ancora incubare le piastre avvolte capovolta a 30 ° C per 2-4 giorni.
            NOTA: Si deve prestare attenzione per selezionare singole colonie e striscia fuori colonie più volte per confermare una popolazione omogenea di vere cellule auxotrofi.
   4. Ulteriore conferma il fenotipo delle cellule irradiate da inoculating singole colonie in 5-10 ml di entrambi YPD e supporti privi del metabolita appropriata (ad esempio, in uracile ^- mezzi di URA3 ^- mutante). Incubare su un tamburo a rulli a 30 ° CO / N per confermare crescita delle cellule in YPD ma non in assenza del metabolita.
      NOTA: Anche se i modelli di crescita su terreni solidi devono indicare chiaramente lievito stato auxotrophic, è possibile che alcuni di lievito di tollerare sollecitazioni e formano piccole colonie crescita lenta su supporti solidi, ma ancora non tollera le stesse condizioni in mezzi liquidi (osservazioni non pubblicate). Inoculazione in colture liquide dovrebbe quindi essere effettuata per confermare accuratamente modelli di crescita di UV irradiati mutanti.
   5. Per la conservazione a lungo termine di mutanti auxotrofi confermati, preparare scorte di glicerolo da parte delle cellule inoculazione in 10 ml YPD e incubazione su un tamburo O rullo / N a 30 ° C. Cellule pellet per centrifugazione per 3 min a 2.500 supporti XG e aspirare. Risospendere le cellule in 50%sterili glicerolo filtrato, il trasferimento a un esageratamente, e conservare a -80 ° C.
      NOTA: UV lievito mutagenizzato potenzialmente contengono mutazioni in geni multipli diversi nel marcatore auxotrophic di interesse. Prima di continuare con l'uso di mutanti auxotrofi verificate, questi ceppi dovrebbero essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento del gene e valutazione della resistenza al pH, sollecitazioni acidi biliari, e altre caratteristiche rilevanti ai ceppi probiotici, come descritto altrove ^2. Inoltre, l'uso di omologia pcr o CRISPR / Cas9 targeting mutare più selettivo marcatori auxotrofi dovrebbe essere considerata come alternativa alla mutagenesi UV ^{4 - 6.}

2. Lievito Trasformazione

1. LiOAc Trasformazione di lievito
   1. Seminare singole colonie di lievito in 5-10 ml di supporti YPD e incubare su un tamburo a rulli a 30 ° CO / N.
   2. Per indurre la crescita fase di log e aumentare l'efficienza di assorbimento plasmide, deconcentrazione cellulare Termine utilizzando uno spettrofotometro per misurare una diluizione 1:10 di cellule in acqua sterile in una cuvetta di plastica. Diluire O / N culture ad un OD ₆₀₀ di 0,16-0,2 (circa 2 x 10 ⁶ - 2,5 x 10 ⁶ cellule / ml) in 50 ml di YPD caldo fresco e incubare cellule su un orbitale shaker piattaforma impostato a 200 rpm fino cultura raggiunge circa 1 x 10 ⁷ cellule / ml, di solito circa 4 ore.
      NOTA: l'efficienza di trasformazione può essere misurata in funzione del numero di unità formanti colonia di lievito trasformate con successo (CFU) per mg di DNA plasmidico. Aumento risultati di efficienza in colonie più trasformati per mg di DNA plasmidico. Trapianto cellule di lievito e la raccolta durante la fase esponenziale di crescita è un fattore che aumenta l'efficienza di trasformazione ^12.
   3. Agglomerare cellule per centrifugazione a 2.500 xg per 3 min.
   4. Aspirare le cellule e porli in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga da risospendere il Pellet in 1 ml di acqua sterile.
   5. Cellule pellet per centrifugazione a 16.000 xg per 1 minuto in una microcentrifuga, aspirare il surnatante e lavare le cellule dalla risospensione in 1 ml TE / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) tampone.
   6. Ripetere cellule centrifugazione e risospendere in tampone TE / LiOAc ad una concentrazione di 2 x 10 ⁹ cellule / ml.
   7. Preparare miscele trasformazione con ciascuno dei seguenti: 50 ml di lievito preparato in tampone TE / LiOAc, 5 ml di DNA vettore (10 mg / mL) e 1 ml di DNA plasmidico (1 mg). Microgrammi di plasmide DNA può essere aumentata come quantità crescenti di DNA può o non può portare a una maggiore efficienza di trasformazione ³²
      NOTA: Per un ceppo di lievito mutante manca un marcatore auxotrophic, solo un plasmide codificante il marcatore può essere trasformato per campione. Inoltre, l'uso di un plasmide codificante una proteina facilmente rilevabile, come la GFP, consentirà efficace determinazione corretta piegatura e espressione di pr eterologaotein dal ceppo di lievito successivamente alla trasformazione.
   8. Per ogni preparazione, aggiungere 300 ml di PEG / LiOAc / TE e vortex accuratamente. L'incubazione delle cellule intatte con PEG è essenziale per la trasformazione efficiente ^13.
   9. Incubare preparazioni a 30 ° C per 30 minuti con agitazione ponendo tubi microcentrifuga in un becher posto su un agitatore piattaforma orbitale a 200 rpm.
   10. Aggiungere 35 ml di DMSO a ciascun cuvette di reazione e shock termico per 15 minuti in un bagno d'acqua C 42 °. Anche se ci sono notizie contrastanti del vantaggio di DMSO ^33, shock termico delle cellule di lievito intatte ha dimostrato di aumentare notevolmente l'efficienza di trasformazione ^12.
   11. Lavare le cellule da pellet tramite centrifugazione come in 2.1.5, aspirando o pipettando il surnatante, e risospendere in 1 ml di acqua sterile. Delicatamente pipetta su e giù per rompere il pellet.
       NOTA: E 'fondamentale per rimuovere completamente il surnatante perché l'uso dei mediad nel generare cellule competenti in grado di inibire la crescita del lievito e la formazione di colonie.
   12. pellet cellulare Ripetere come in 2.1.5, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule in 100 ml di acqua sterile. Pipettare il tutto volume su un piatto selettivo e utilizzare una spatola sterile per ricoprire uniformemente il piatto con il lievito trasformato.
   13. Avvolgere bordi di lastre rivestite in Parafilm contro l'essiccamento della media e incubare capovolta a 30 ° C per 2 giorni per consentire la crescita di cellule di lievito trasformate. Successful, trasformazione efficiente e selezione auxotrophic di Saccharomyces cerevisiae produce un elevato numero di colonie per la preparazione trasformazione, anche se il rendimento può essere molto inferiore per altri ceppi (Figura 4).
   14. Piastre negozio di lievito per il breve termine (generalmente 1-3 settimane) a testa in giù e coperto a 4 ° C. Preparare le scorte glicerolo di lievito trasformato come descritto in 1.2.5 per la conservazione a lungo termine.
       NOTA: Ulteriori studi test trasformato CFU sono necessari per determinare la stabilità del plasmide e valutare la corretta espressione della proteina eterologa. Descrizioni approfondite di stabilità plasmide ^34, uso di immunoblotting per rilevare le proteine ​​denaturate recuperati dai campioni di cellule ^17, enzima Saggio di immunoassorbimento (ELISA) per rilevare correttamente piegato tre proteine ​​tridimensionali ^16, e l'uso di GFP in studi di lievito ^{35 sono} disponibili altrove. Figura 6 mostra un'immagine rappresentativa di espressione GFP successo nel trasformata S. cerevisiae rispetto alle cellule non trasformate. Uso di una proteina simile fluorescente è un mezzo di determinazione efficiente produzione di proteine ​​eterologhe successo.
2. Elettroporazione di lievito
   1. Seminare singole colonie di lievito in 5-10 ml di supporti YPD e incubare su un tamburo a rulli a 30 ° CO / N.
   2. Calcolare la concentrazione cellulare usando uno spettrofotometro per misurare una diluizione 1:10 di cellule in acqua sterile. diliuto O / N culture in 100 ml freschi caldi dei media YPD a un OD ₆₀₀ equivalente di circa 0,3. Incubare subcolture a 30 ° C su una piattaforma orbitale shaker insieme a 200 rpm fino a raggiungere un _diametro esterno 600 di circa 1,6, di solito 4-5 hr. Ogni sottocultura 100 ml genererà cellule sufficienti condizionata per due reazioni di trasformazione.
   3. Agglomerare cellule per centrifugazione a 2.500 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e lavare le cellule dalla risospensione in 50 ml di ghiaccio d'acqua sterile fredda. Ripetere il lavaggio con pellet cellule, aspirare il surnatante, e risospendere in 50 ml di ghiaccio di acqua sterile fresca fredda.
   4. Agglomerare nuovamente le cellule e risospendere in 50 ml di ghiaccio tampone elettroporazione fredda (1 M sorbitolo, 1 mM CaCl _2).
   5. Ripetere rotazione come in 2.2.3, aspirare il surnatante, e risospendere le cellule in 20 ml di 0,1 M LiOAc / 10 mM DTT. Incubare sospensione cellulare su un tamburo a rulli a 30 ° C per 30 min. La preincubazione delle cellule in LiOAc e DTT aumenta sinergicamente laefficienza di elettroporazione ^36.
   6. Agglomerare le cellule come in 2.2.3, rimuovere il surnatante e lavare da risospensione in 50 ml di ghiaccio tampone elettroporazione freddo. Ripetere cellule centrifugazione e risospendere in ghiaccio tampone elettroporazione freddo ad un volume finale di 1 ml.
   7. Preparare il ghiaccio: condizionata cellule di lievito, cuvette di elettroporazione sterili, e il DNA plasmide. Subito dopo la risospensione finale delle cellule condizionata in tampone elettroporazione 1 ml, unire 400 ml cellule di lievito condizionata con circa 1 mg di DNA plasmidico e aggiungere a un freddo ghiaccio 0,2 micron elettroporazione provetta. L'utilizzo di una maggiore quantità di DNA può leggermente aumentare l'efficienza di trasformazione ^11. Incubare reazione in ghiaccio per 5 minuti, poi l'elettroporazione con il set electroporator a 2,5 kV e 25 uF.
      NOTA: Come descritto in 2.1.7, un ceppo di lievito mutante manca un marcatore auxotrophic può essere trasformata con un solo plasmide codificante il marcatore mutato per campione. Inoltre, utilizzandoun plasmide che codifica una proteina facilmente rilevabile come GFP permette efficiente determinazione corretta piegatura e l'espressione della proteina eterologa successivamente alla trasformazione.
   8. Trasferimento elettroporate cellule in 8 ml di una miscela 1: 1 di YPD: 1 M sorbitolo e permettere alle cellule di incubare su un tamburo a rulli a 30 ° C per 60 min.
   9. Cellule pellet come in 2.2.3 e risospendere in 100 microlitri 1: 1 YPD: 1 M sorbitolo. Piatto pieno volume su terreni selettivi contenenti 1 M sorbitolo, avvolgere bordi di lastre in Parafilm e incubare le piastre a testa in giù a 30 ° C per 2-5 giorni per consentire la crescita di cellule di lievito trasformate.
      NOTA: E 'fondamentale per testare il lievito trasformato per valutare la corretta espressione della proteina eterologa, come descritto in 2.1.14 e 2.2.7.

3. sonda gastrica dei topi con lievito Trasformata

1. Eseguire tutte le procedure di cura degli animali e di gestione secondo la guida per la cura e l'uso di laboratorio Animals e animali istituzionale cura e l'approvazione del Comitato uso.
2. Preparare culture O / N lievito inoculando singole colonie di lievito auxotrophic trasformato in 5-10 ml di terreni selettivi. Incubare culture O / N per almeno 8 ore su un tamburo a rulli a 30 ° C fino a saturazione.
   NOTA: l'uso di proteine ​​di prova codifica plasmide come GFP permetterà per facilità di test espressione proteica in lievito gavaged, come descritto in 4.7.
3. Per l'induzione massima di espressione della proteina e di indurre la crescita fase di log, preparare sottoculture dal O / N culture diluendo ad un _OD 600 equivalente di circa ,16-,2 in 50 ml di mezzi di comunicazione idonei, come descritto in 2.1.2.
4. Determinare la concentrazione di cellule subcoltura come in 1.1.2 e regolare a 10 ⁹ cellule / ml. Preparare una dose da 100 ml per ogni mouse, con poche centinaia di volume ml in più al gruppo per migliorare la precisione e la facilità di caricamento dei campioni.
5. Cellule pellet per centrifugazione a 2.500 xg per3 min o in una microcentrifuga a 16.000 xg per 1 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo un volume uguale di acqua sterile e delicatamente pipettando su e giù.
6. Fissa un ago calibro gavage appropriata (22 G per 15-20 g topi) su un campione di siringa e carico di lievito 1 ml sterili, avendo cura di eliminare eventuali bolle e impostare stantuffo per un incremento di 100 ml. Caricare una siringa supplementare con acqua sterile per topi di controllo sonda gastrica e verificare la presenza di eventuali lievito contaminante.
7. Sollevare il mouse per essere gavaged con la mano non dominante, con il dito indice e il pollice saldamente afferrare la pelle intorno al collo (figura 6A). Tuck la coda sotto il piccolo dito per impedire il movimento della parte inferiore del corpo. Assicurarsi che il grip è sicuro e vieta il mouse da muovendo la testa al fine di evitare danni ai tessuti interni durante sonda gastrica.
   NOTA: valutare la distanza deve essere inserito l'ago sonda gastrica tenendo l'ago contro il mouse in modo tale cheil bulbo è anche con il processo xifoideo dello sterno. Inserendo questa lunghezza dell'ago in genere permetterà il bulbo gavage ago entra nello stomaco.
8. Utilizzando la mano dominante, inserire delicatamente l'ago sonda gastrica nell'esofago del mouse inclinando l'ago lungo il tetto della bocca e posteriore della gola, mantenendo leggermente a sinistra del centro. Attendere il mouse per inghiottire bulbo dell'ago e permettere che l'ago scende leggermente al punto stimato in 3,7 (Figura 6B). Se uno si avverte resistenza durante l'inserimento dell'ago sonda gastrica o se il mouse in qualsiasi momento inizia a boccheggiare, rimuovere delicatamente l'ago e ancora una volta cercare di trovare l'esofago.
9. Dopo che il mouse ha inghiottito il bulbo dell'ago gavage, premere delicatamente lo stantuffo della siringa per somministrare 100 ml ⁽¹⁰ 8 CFU) di lievito direttamente nello stomaco del mouse.
   NOTA: Anche se i topi sono in grado di vomitare qualsiasi soluzione gavaged dopo la somministrazione ^18,19 , è possibile per il reflusso può insorgere durante gavage ^21,37. La corretta inserimento dell'ago gavage, nonché la regolazione del volume e la viscosità della soluzione, può aiutare a limitare riflusso e garantire un dosaggio accurato.
10. Rimuovere con attenzione l'ago sonda gastrica dallo stomaco e l'esofago del mouse e restituire il mouse per la gabbia. Verificare che il mouse sta respirando e muoversi normalmente dopo sonda gastrica per garantire che l'ago sonda gastrica è stato inserito correttamente tutta la procedura e che nessuna soluzione è stata aspirata.

4. Raccolta di patch di Peyer murini e isolamento di colonie di lievito vitali

1. Al momento opportuno punto di post sonda gastrica, tipicamente 4 ore, i topi sacrificio utilizzando IACUC approvati metodi. Controllare per mancanza di reattività a seguito di un pizzico dito del piede, e utilizzare una misura secondaria come dislocazione cervicale a sacrificare il mouse. I luoghi di tempo possono essere testate anche, come numerosi studi hanno dimostrato che l'efficienza e la tempistica di un massimoprendere attraverso l'epitelio è particella dipende ^38,39.
2. Posare il mouse con l'addome completamente esposto e sterilizzare la zona addominale spruzzando con il 70% EtOH. Effettuare una incisione trasversale attraverso la pelliccia e la pelle con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni. leva manualmente l'incisione aprire ulteriormente per esporre il peritoneo, il sottile rivestimento sierosa che copre gli organi addominali. Sollevare delicatamente il peritoneo e fare una incisione trasversale per esporre l'intestino.
3. usare con cautela forcipe smussato per prendere in giro il piccolo intestino lontano dalle arterie mesenteriche, grassi e altri tessuti. Esporre tenue dallo stomaco, nel quadrante superiore sinistro dell'addome mouse, al cieco, la grande tasca di tessuto intestinale all'inizio dell'intestino crasso.
4. Isolare patch di Peyer cercando per 1-3 mm patch approssimativamente circolare di tessuto opaco lungo l'intestino tenue (Figura 7). Utilizzando SIC dissezione curvesori, tagliare via la cupola del cerotto del Peyer, lasciando i margini per garantire che nessuno dei circostante lamina propria viene raccolto.
   NOTA: La maggior parte dei topi hanno tra 4-8 patch facilmente visibili di Peyer. L'esecuzione del procedimento in una zona con illuminazione ambientale diretta aumenterà la facilità con cui possono essere visualizzati placche di Peyer.
5. Raccogliere sezionato placche di Peyer in completa di Iscove modificato i media (IMDM) Dulbecco.
   NOTA: È fondamentale utilizzare una tecnica sterile e comprendono antibiotici nei mezzi di raccolta al fine di prevenire la contaminazione batterica gastrointestinale di piastre di lievito.
6. patch di Peyer Strain attraverso un colino cella di 40 micron per eliminare collezione media. placche di Peyer Lavare con IMDM fresca completo su un tubo da 50 ml e utilizzare un pistone da una siringa da 1 ml di rompere delicatamente patch di Peyer. Agglomerare cellule tese per centrifugazione a 1.800 rpm per 7 min. surnatante e risospendere le cellule in Aspirareun volume finale di circa 100 microlitri.
7. Applicare le cellule tese su terreni selettivi lievito e utilizzare un diffusore piatto per distribuire uniformemente le cellule. Wrap bordi piastra in Parafilm e incubare le piastre a testa in giù a 30 ° C per 2 giorni per consentire la crescita di qualsiasi lieviti vitali recuperato dal patch murino di Peyer.
   NOTA: Ulteriori studi dopo il recupero di lievito da patch Peyer 'sono necessari per confermare che i ceppi sono in grado di fornire proteine ​​eterologhe correttamente ripiegata a questi tessuti del sistema immunitario. Come descritto in 2.1.14, tali metodi possono includere immunoblotting, ELISA, o microscopia a fluorescenza per rilevare proteine ​​fluorescenti come la GFP ^2,40.

Risultati

Generazione di una curva di sopravvivenza dopo irradiazione UV richiede la placcatura di cellule di lievito diluito in modo tale che le unità distinte formanti colonie (CFU) sono in grado di formare. Ogni campione 500 microlitri raccolto come sopra descritto contiene circa 5 x 10 ^{6 cellule;} Tuttavia, più di 100 colonie per piastra sono difficili da distinguere accuratamente. Placcatura campione diluito e seriali 1:10 diluizioni di cellule irradiate garantisce così che CFU p...

Discussione

Insieme, i protocolli qui descrivono le fasi essenziali necessarie per lo sviluppo e la sperimentazione di ceppi di lievito probiotici auxotrofi per la consegna della proteina terapeutica eterologa per l'intestino. Questa manipolazione e la sperimentazione di ricombinante lievito probiotico richiede tecniche e le risorse con cui ogni singolo laboratorio non può attualmente essere a conoscenza. Quindi, anche se numerosi studi precedenti hanno descritto i protocolli di cui sopra per più di lievito e mouse ceppi, que...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053