Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Zusammenfassung

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Zusammenfassung

Metastasierung zu sekundären Standorten wie der Lunge, Leber und Knochen ist ein traumatisches Ereignis mit einer Mortalitätsrate von etwa 90% ^1. Von diesen Standorten ist die Lunge der schwierigste im Körper, zarte Natur und entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung richtige Physiologie mit intravital optische Bildgebung aufgrund seiner geschlossenen Position zu beurteilen. Obwohl klinische Modalitäten (Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Kernspintomographie (MRI) und Computertomographie (CT)) vorzusehen noninvasive Bilder dieser Gewebe fähig sind, fehlt ihnen die Auflösung notwendig, um die frühesten seeding Ereignisse zu visualisieren, mit einem einzigen Pixel bestehend aus fast tausend Zellen. Aktuelle Modelle von metastasierendem Lungenkrebs Seeding Postulat, die Ereignisse kurz nach Ankunft eines Tumorzelle für das Überleben und das anschließende Wachstum deterministisch sind. Das bedeutet , dass in Echtzeit intravital Imaging - Tools mit Einzelzellenauflösung ² erforderlich sind , um die Phänotypen der Aussaat cel zu definierenls und diese Modelle zu testen. Während hochauflösende optische Bildgebung der Lunge hat verschiedene ex vivo Präparaten durchgeführt wurde unter Verwendung sind diese Experimente typischerweise Einzelzeitpunkt Assays und sind anfällig für Artefakte und mögliche falsche Schlüsse aufgrund der dramatisch veränderten Umfeld (Temperatur, Überfluss, Cytokine, usw. ) aus der Entnahme aus dem Brustraum und Kreislaufsystem ³ führt. Neuere Arbeiten haben , dass die Zeit-lapse intravital optische Bildgebung der intakten Lunge gezeigt ist möglich unter Verwendung einer Vakuumabbildungsfenster ^2,4,5 stabilisiert jedoch typische Aufnahmezeiten wurden auf etwa 6 Stunden begrenzt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige intravital Zeitraffer-Bildgebung der Lunge Durchführung eines solchen Fensters über einen Zeitraum von 12 Stunden verwendet wird. Die Zeitraffer-Bildsequenzen dieser Methode unter Verwendung ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Zell-Zell-Interaktionen, Membrandynamik und Gefäßperfusion in der Lunge. Wir weiter dEscribe eine Bildverarbeitungstechnik, die eine beispiellos klare Sicht auf die Lunge microvasculature gibt.

Einleitung

Hochauflösende optische Abbildungsintravital hat zum Verständnis vielen biologischen Prozessen entscheidend erwiesen, so dass Einzelzelle und subzellulären Parameter gemessen und quantifiziert. In der Krebsforschung hat intravital Bildgebung von Tumor- und Stromazellen führte zur Entdeckung vieler Mikroumgebungs Wechselwirkungen ^6-11 , die nur in dem intakten Tier sind.

Entdeckungen über im Zusammenhang mit Mikroumgebungen intravasation und Verbreitung von Tumorzellen bei Brustkrebs einzelne Zelle auflösende optische Bildgebung in vivo unter Verwendung von sogar ^{12 bis 16} neue Marker für die Prognose und das Ansprechen auf eine Behandlung bei Brustkrebs - Patienten geführt. Die besten Imaging-Technologien für die Anzeige tief in intakten inneren lebenswichtigen Organe sind die klinischen Modalitäten (MRT, PET, CT), die eine hervorragende Aussicht auf das gesamte Organ bieten und Pathologien zeigen können, noch bevor sie klinische Symptome hervorrufen. Sie sind nicht in der Lage, however, um die frühesten Stadien der Metastasierung zeigen und die zellulären Mechanismen der Tumorprogression Fahr aufgrund ihres Mangels an Einzelzellauflösung. Durch die Zeit, Lungenmetastasen in dieser Modalitäten sichtbar sind, sind sie gut etabliert und proliferieren. In Anbetracht der Schätzung , dass 90% der disseminierten Tumorzellen , die in die Lunge gelangen entweder nicht ¹⁷ überleben oder bleiben zunächst ruhend ¹⁸ und der Beobachtung , dass sie ankommen viel früher als bisher ¹⁹ erwartet, die Abbildung der frühesten Schritte der Ankunft und das Überleben von entscheidender Bedeutung wird zu das Verständnis des Prozesses des metastasierten Seeding und ein erneutes Auftreten des Tumorwachstums an entfernten Standorten.

jedoch Durchführung dieser Beobachtungen in der Lunge hat sich als äußerst schwierig erwiesen; die überwiegende Mehrheit der Imaging - Studien haben ex vivo oder Explantation Präparate verwendet ^20-23, die nur einen Blick in die Lunge zu einzelnen Zeitpunkten geben. Während diese Vorbereitungen nützliche Informationen zur Verfügung gestelltenrmation, sie nicht ein vollständiges Verständnis der Wechselwirkungen, Ursache-Wirkungs-Beziehungen und Dynamik ergeben, die zwischen den verschiedenen Komponenten des Mikroumgebung auftreten. Das Fehlen eines richtigen Kreislaufsystems (und damit einhergehenden Ungleichgewicht der Homöostase) und der Trennung vom Rest des Immunsystems des Körpers macht es wünschenswert , die Schlussfolgerungen zu validieren , die diese Präparate in intaktem Gewebe in vivo zu erzeugen.

Viele Gruppen haben intravital Bildgebung der intakten Lunge durchgeführt ^2,4,5,24-33 mit Wearn und Deutsch die Pleura Schicht ²⁴ und Terry entlarven die erste die erste chirurgisch zu sein ein implantierbares Abbildungsfenster ²⁵ zu nutzen.

Hochauflösende Abbildung in der Lunge wird durch die Lunge des konstanten Bewegung und verschiedene Techniken wurden entwickelt, um diese Einschränkung zu überwinden stark behindert. Wagner und Filley ²⁷ studierte die natürliche Bewegung des Hundelungeund entwickelt , um ihre chirurgische Protokoll ihrer implantierten Fenster über einen relativ stationären Bereich zu lokalisieren , während Wagner Vakuum in seinem Fenster chirurgische Vorbereitung verwendet , um das Gewebe ²⁸ zu immobilisieren. ³⁴ Bronchus Klemm, sequentielle Apnoe und Gated Imaging, überabgetasteten Erwerb, Verkleben des Lungenlappens und Vakuum: Seit dieser Zeit wurde eine Vielzahl von Techniken , um die Lunge zu Bild einschließlich verwendet worden. Jeder von ihnen hat seine Vor- und Nachteile und keiner Technik hat sich als überlegen weitere ³⁴ entstanden. Zum Beispiel Bronchus Klemm- und sequenziellen Apnoe verändern die normale Austausch von Gasen in der Lunge und kann Atelektase verursachen. Gated Imaging und überabgetastete Erwerb nicht an diesen Nachteilen leiden, sondern erfordern eine hohe Geschwindigkeit oder spezielle Bildgebungsgeräte nicht allgemein zugänglich. Schließlich beide Verklebung der Lunge und der Vakuumtechnik beide der oben erwähnten Nachteile zu vermeiden, kann aber Scherkraft induzierten Verletzungen aufweisen, wenn Sie darauf, nicht tak isten. In den letzten Jahren hat sich die Vakuumfenster für den Einsatz bei Mäusen mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie ^4,5,33 und hervorragende hochauflösende Bildgebung erreicht wurde ² miniaturisiert und angepasst. Tabelle 1 dieser reichen Geschichte zusammenfasst und unterstreicht die Papiere , die neu beschreiben Fortschritte bei der Verwendung von intravital Bildgebung der Lunge Fenster.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer Multiphotonen- Intravitalmikroskopie zur Bild Metastase in der Live, intakte Lunge mit der höchsten subzellulärer Auflösung möglich. Bilder werden für bis zu 12 h erworben ein Multi Mikroskop mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse und mehrere Photomultiplier-Röhre (PMT) -Detektoren ausgestattet ist. Transgener Mausmodelle werden zusammen mit fluoreszierenden hohem Molekulargewicht Dextran und fluoreszierende Protein transfizierten Tumorzellen zu fluoreszenz Label nativen Makrophagen genutzt (die Gefäße und Tumorzellen zu beschriften respectively). Während diese Wahl von fluoreszenzmarkierten Zellen Visualisierung von Tumorzell-Endothelzellen-Makrophagen-Interaktionen und Dynamik ermöglicht, wird dieses Protokoll für jeden Stamm von fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Maus arbeiten. Nach der Erfassung wird die Restdriftbewegung (falls vorhanden) ein Fidschi - Plugin ^35,36 und benutzerdefinierte Makros Zeit Durchschnitt des Gefäßkanals durch unmarkierten zirkulierenden Blutzellen zu eliminieren Blitzen verursacht unter Verwendung eliminiert.

Während dieses Protokoll auf die Bildgebung Metastasierung konzentriert, sind die Techniken, die für viele andere biologische Prozesse zu beobachten mit hochauflösenden Einzelzell-Bildgebung in der Lunge.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Maus-Modell und Tumorzellen

1. Herstellung von 100 ml von 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin / phosphatgepufferter Salzlösung (BSA / PBS) -Puffer durch Mischen von 0,1 g BSA mit 100 ml PBS.
2. Bereiten fluoreszierend markierten Tumorzellen durch stabile Transfektion.
   HINWEIS: Hier verwenden wir E0771-LG - Zellen, eine hochgradig metastatische Derivat von E0771 Maus - Mamma - Adenokarzinom - Zellen ³⁷ , die von metastatischen Tumoren in der Lunge von C57BL / 6 - Maus entwickelt isoliert wurden intravenös mit elterlicher E0771 ³⁸ - Zellen injiziert.
   1. 24 Stunden vor der Transfektion Platte 1 x 10 ⁵ EO771-LG Zellen auf einer 60 - mm - Gewebekulturschale auf 2 ml antibiotic free 10% FBS (fötales Rinderserum) DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) und bei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubieren.
   2. Zum Zeitpunkt der Transfektion inkubieren 2 ug des fluoreszierenden Proteins Vektor mit 10 & mgr; l Transfektionsreagenz für 30 min, bevor 190 & mgr; l der reduzierten Serummedien hinzugefügt wird.
   3. Wasch EO771-LG Zellen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) einmal und füge vorsichtig das Transfektionsgemisch.
   4. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 6 Stunden.
   5. Waschen der transfizierten Zellen und der Kultur in 2 ml komplettem DMEM (10% FBS, 1 mM Pyruvat, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin) für 2 Tage.
   6. Wash-Zellen mit 2 ml sterilem PBS, 500 & mgr; l von 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation für 2 min bei 37 ° C.
   7. Sammeln Zellsuspension und mischen sich mit mindestens 1 Volumen von komplettem DMEM und Spin-down bei 280 x g.
   8. Resuspendieren der Zellen in 1 ml komplettem DMEM und erweitern Sie die Zellkultur in10 cm Gewebekulturschale.
   9. Starten Sie Selektion von transfizierten Zellen, die durch Zugabe von 700 ug / ml G418 selektiven Antibiotikum bis 8 ml komplettem DMEM und Kultur für eine Woche, Wechsel-Medium alle drei Tage.
3. Reichern die fluoreszierende Population von transfizierten Zellen , die in G418 durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ^39,40 unter Selektion wurden.
   1. Wasche die Zellen mit 5 ml PBS und 1,5 ml von 0,25% Trypsin.
   2. Inkubieren für 2 min bei 37 ° C und mit mindestens einem Volumen von komplettem DMEM mischen.
   3. Sammeln Zellsuspension und des Abschaltens bei 280 xg und resuspendieren Zellen in 1 ml steriler 0,1% (w / v) BSA / PBS-Puffer.
   4. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m-Mesh und stellen Sie die Lautstärke auf 1 ml mit 0,1% BSA / PBS-Puffer für die Sortierung.
   5. FACS-Sortieren der 10% hellste Bevölkerung basierend auf Fluoreszenzspektrum ⁴¹ der FACS - Sorter mit.
   6. Kultur die sortierten Zellen für eine weitere Woche under Auswahl (700 ug / ml G418 in komplettem DMEM).
   7. fluoreszierend markierten Zellen durch Fluss neu wählen Zytometrie durch Schritte 1.3.1 bis 1.3.6 noch einmal zu wiederholen.
   8. Nach einer zweiten Selektionsrunde trypsinize, Filter und resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS, wie beschrieben (Schritte 1.3.1-1.3.4). Einstellen Konzentration auf 2 x 10 ⁶ Zellen / ml für die einzelne Zelle in 96 - Well - Platten Sortieren der FACS - Sorter werden.
   9. Bereiten Sie 3-5 96-Well-Platten mit 100 ul Voll DMEM für die Sammlung. Zur Verbesserung der Überlebenszeit nach dem Sortieren, 100 & mgr; l filtrierten Kulturmedium aus Gerichten , wo die EO771-Zellen LG ⁴² angebaut wurden.
   10. Nach dem Sortieren der Zellen in den Platten mit 96 Vertiefungen, kehren Zellen zur Kultur für 2 Tage (37 ° C, 5% CO _2).
   11. Identifizieren Brunnen mit tragfähigen einzelnen Klone durch Prüfung unter einem inversen Mikroskop mit 5-facher Vergrößerung.
   12. Trypsinize und tragfähige Klone erweitern und Zellen für die Sicherung einzufrieren.
       1. Waschen Sie Brunnen mit graufgrund Klone mit 100 ul sterilem PBS. Werden 50 & mgr; l von 0,25% w / v Trypsin und Inkubation 2 Minuten bei 37 ° C. In 50 ul komplettem DMEM und Transfer zum sterilen V-Boden oder rundem Boden 96-Well-Platte bei 280 g für 5 min auf Spin-Down.
       2. Die Zellen in 100 & mgr; l von 700 & mgr; g / ml G418 vollständigen DMEM und jeder Klon in 12-Well-Platten plattieren. In 400 ul komplettem DMEM mit G418 und Kultur bis zur Konfluenz.
       3. Waschen Vertiefungen mit 500 ul PBS, 100 & mgr; l von 0,25% Trypsin und Inkubation 2 min bei 37 ° C. 100 l komplettem DMEM und Spin-down für 5 Minuten bei 280 x g. Die Zellen in 100 ul komplettem DMEM mit G418 und Platte Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen bis zur Konfluenz.
       4. Sobald konfluent, trypsinize Zellen, Spin-down und resuspendieren in 10% DMSO in FBS Zelle Aktien einzufrieren.
       5. Halten 1/10 der Zellsuspensionen in Kultur indem man sie in 100 mm-Gewebekulturschalen zur Auswertung ihres metastatischen Potential Plattieren.
4. Testen metastatischen Potential ausgewählter Klone.
   1. Trypsinize und resuspendieren Zellen in Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 2,5 x 10 ⁶ Zellen / ml und 200 ul injiziert in C57BL / 6 - Mäusen intravenös über die Schwanzvene.
   2. Nach 2 Wochen Lungengewebe zu sammeln , wie zuvor ²³ beschrieben und Tumorbelastung durch Oberflächenanzahl oder stereo Verfahren ⁴³ zu quantifizieren. Wählen Sie Klone mit hohem metastatischem Potential für intravital Bildgebung.
5. Raise MacBlue (eine myeloische spezifischen Promotor , cyan fluoreszierendes Protein (GFP) Ausdruck (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ¹⁶⁾⁾ Reporter - Mäuse ^44.
   HINWEIS: In der Regel verwendet werden, Mäuse, zwischen 8 und 12 Wochen, aber Mäusen so früh wie 7 und so spät wie 20 Wochen wurden getestet, wie gut zu funktionieren.

2. Multiphotonenionisation Mikroskop Set up und Imaging Vorbereitung

HINWEIS: Während dieses Protokoll kann auf jedem m durchgeführt werdenultiphoton Mikroskop, wobei das System verwendet , um die Daten in diesem Protokoll gezeigt erwerben wurde zuvor ⁴⁵ im Detail beschrieben.

1. Schalten Sie alle Mikroskop und Laserkomponenten einschließlich der Zwei-Photonen-Laser und den Detektoren mindestens eine Stunde vor dem gewünschten Bildgebungszeit.
2. Kurz vor der Operation mit dem Mikroskop die Leistung des Lichteingangssignals zu messen, den Kopf des optischen Leistungsmesser in den Strahlengang kurz vor dem Mikroskop platziert und stellen Sie gelesen, um den Laser-End-Knöpfe Resonatorspiegel, bis die maximale Lichtintensität bei 880 nm auf die optische Leistungsmesser.

3. Vakuumsystem einrichten

1. Kleben Sie das Deckglas in die Abbildungsfenster (Supplemental Abbildung 1) mit Cyanacrylat. Lassen Sie mindestens 4 Stunden für den Kleber vollständig trocknen.
   Hinweis: dieser Schritt auch vor der Zeit durchgeführt werden.
2. Schneiden Sie die 100 ul Pipettenspitze in der ersten Zeile von der kleinen Öffnung und schließen Sie das ungeschnittene Ende der dünnen vacuum Schlauch.
3. Schließen Sie das Vakuumsystem gemäß Abbildung 1 und Abbildung 2 einen Brief.
4. Mit dem Vakuum und dem offenen Ende blockiert, stellen Sie den Vakuumregler für <3 inHg.
   HINWEIS: Endgültige Einstellung des Vakuumniveaus wird durch Beobachtung der Gefäße in vivo durchgeführt werden.
5. Tragen Sie einen dünnen Film aus Petroleumfett auf der Unterseite der Bildplatte aus der Objektivlinse Tauchmedium zu verhindern, dass durch die Bildplatte weggesaugt.
6. Setzen Sie die Druckplatte auf dem Mikroskoptisch.
   HINWEIS: Die benutzerdefinierte Bildplatte (Supplemental Abbildung 3) ist ein Blatt von 1/8 "dicken Aluminium gefräst sowohl in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchgangsloch in der Mitte zur Aufnahme des Abbildungsfenster.
7. Legen Sie die Vakuumfenster in die Bildplatte mit dem Deckglas nach unten.
8. Sterilisieren alle Oberflächen und Instrumente, einschließlich Abbildungsstufe Platte und Imaging-SiegDow mit 70% Ethanol.
9. Schließen Sie das Schnittende der Pipettenspitze in die Vakuumfenster und kleben Sie den Schlauch nach unten auf die Bildplatte.
10. Bringen Sie das Ziel nahe dem Abbildungsfenster und legen einen großen Tropfen von Wasser zwischen dem Ziel und dem Deckglas.
11. Stellen Sie sicher, dass es keine undichten Stellen aus dem Deckglas sind durch die zentrale Öffnung des Vakuumfensters blockiert und sicherstellen, dass der Wassertropfen zwischen dem Objektiv und Deckglas nicht abgesaugt bekommt.
    HINWEIS: Ein alter Stil Computermaus Ball über das Fenster platziert ist nützlich, um die zentrale Öffnung zu blockieren.

4. Chirurgie

1. Bereiten Sie den sterilen OP-Bereich.
   1. Legen Sie alle Instrumente leicht zu erreichen. Sterilisieren alle Oberflächen und Instrumente einschließlich OP-Bereich und chirurgische Instrumente mit 70% Ethanol.
2. Binden Sie einen 3-Zoll-Länge von 2-0 Naht mit dem Katheter, ¼ Zoll über die Buchse mit einem doppelten Knoten.
3. Bereiten Schwanzvenenkatheter folgenden dem veröffentlichten Protokoll von Harney et al. ^46.
4. Verwendung eines Infrarot (IR) Heizlampe, erwärmen das Tier in seinen Käfig für ~ 5 min um den Blutfluss in die Schwanzvene zu erhöhen und in Kathetereinführung zu erleichtern. Es wird empfohlen, das Tier zu halten, um physiologischen Temperaturen während des chirurgischen Eingriffs erwärmt entweder einer Wärmelampe oder eine wärmende Pad.
5. Anesthetize das Tier mit 5% Isofluran und stellen Sie sicher, dass es keine Antwort auf eine Zehe Prise ist.
6. Anwenden ophthalmische Salbe zu den Augen des Tieres.
7. Anwenden Enthaarungslotion für 10-30 sec Haar von der linken Seite des Tieres zu entfernen; von der Mittellinie der Brust zu ¼ von hinten und von der Achselhöhle unter dem Brustkorb nur.
8. Reinigen Sie das überschüssige Lotion und sterilisieren ausgesetzt Haut mit 70% Alkohol.
9. Bringen Sie eine sterile Spritze gefüllt mit PBS zum Schwanzvenenkatheter und einfügen und Band an Ort und Stelle nach dem veröffentlichten Protokoll von Harney et al. ^46. Sicherstellen, dass das Band sicher an der Nadel anhaftet und sich nicht frei in den Spalt zwischen dem Schwanz und dem Band.
10. Intubate die Maus entweder nach dem veröffentlichten Protokoll von Das et al. ⁴⁷ oder von DuPage et al. ⁴⁸
11. Schalten Sie den Ventilator und legen Sie es 135 Atemzüge pro Minute und 200 & mgr; l von Isofluran-Sauerstoff-Mischung zu liefern.
12. Schließen Sie den Trachealkatheter an das Beatmungsgerät.
13. Bewegen Sie die Maus auf den OP-Bereich. Größte Vorsicht walten lassen nicht den Katheter zu entfernen.
14. Binden Sie die 2-0 Naht um die Schnauze der Maus unter der Frontzähne.
15. Kleben Sie den Katheter in die Schnauze.
16. Band das linke Vorderbein mit dem Katheter es aus dem Operationsfeld zu halten.
17. Senken Sie die Isofluran-Narkose auf eine Erhaltungsniveau von 2,5% und überprüfen gibt es keine Antwort auf eine Zehe Prise.
18. Mit den scharfen Schere, entfernen 1 cm ² der Haut über der linken Brustwand.
19. Aufzug ter Brustfettpolster und ätzen mit offen liegenden Blutgefäße mit dem Kauter Stift.
20. Resezieren die Fettpolster, indem sie mit den scharfen Schere schneiden.
21. Entfernen Sie die Muskelschicht auf den Brustkorb nach unten, indem sie mit den scharfen Schere schneiden. Achten Sie darauf, nicht die axillaris Lauf an der Basis des forelimb zu schneiden.
22. Verwenden einer Pinzette zu greifen und heben Sie die ^6. Rippe. Mit den scharfen in einem flachen Winkel gehalten Schere (~ 5 °) schneiden die Rippe in der Nähe des Randes der Öffnung in der Haut. Nehmen Sie nicht extrem vorsichtig die freiliegende Lungengewebe zu berühren.
23. Widen die Öffnung in der Brustwand durch Entfernen vier aufeinander folgenden Rippen die gesamte Lungenlappen zu belichten.
    Hinweis: Halten Sie die Öffnung mindestens 5 mm vom Brustbein entfernt, das Herz zu vermeiden.
24. Vorsichtig die Maus heben durch den Schwanz und Trachealkatheter greifen und die Maus in die Mikroskop-Abbildungs ​​Bühne bewegen.
25. Mit dem Vakuum ab, füllen Sie die Kammer des Vakuumfensters mit PBS.
26. Kehren Sie die Maus und die Position der exponierteLunge über das Vakuum-Abbildungsfenster.
27. Drehen Sie langsam auf das Vakuum auf etwa 3-5 Zoll Quecksilber den Kugelhahn mit.
28. Legen Sie einen Haltegeschirr aus Seidenpapier in der Mitte gefaltet zweimal über die Brust der Maus und Band auf die Tischplatte als 2 in einen Brief gezeigt.
29. Clip der Oberschenkelsensor des Pulsoximeter auf den Oberschenkel des Tieres und die Software starten.
30. Legen Sie die Klimakammer auf der Bühne und schalten Sie die Hitze mit der Maus auf einer physiologischen Temperatur zu halten.
31. Reduzieren Sie die Ebene von Isofluran auf 1-1,5% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten.

5. Intra Imaging

1. Bringen Sie die 25 x 0,95 numerische Apertur (NA) Objektivlinse in der Nähe des Deckglases und fügen Sie zwischen ihnen ein großer Tropfen Wasser.
2. Mit Epifluoreszenz-Modus zu sehen, FITC Kanal und bringen das Lungengewebe in den Fokus.
3. Wenn nicht vor der Operation durchgeführt, inject Tumorzellen durch die Schwanzvene Katheter.
   1. Trennen Sie die PBS Spritze aus der Schwanzvene Katheter.
   2. Legen Sie eine sterile Spritze , die mit 100 & mgr; l der Tumorzellsuspension (2 x 10 ⁷ Zellen / ml in PBS Maximum).
      Hinweis: Dieser Schritt kann im Voraus erfolgen Krebszelle Ankunft in der Lunge zu verschiedenen Zeitpunkten zu studieren.
   3. Verbinden Sie die Spritze mit Tumorzellen auf die Schwanzvene Katheter.
   4. die Tumorzellen in die Schwanzvene langsam injizieren.
   5. Trennen Sie die Spritze mit den Tumorzellen aus der Schwanzvene Katheter.
   6. Schließen Sie das PBS Spritze an den Schwanzvenenkatheter.
      HINWEIS: Identifizieren der Positionen aller der Tumorzellen vor dem Einspritzen des Dextran als es schwierig wird, die Tumorzellen aus dem Dextran-Signal über das Okular nach der Injektion zu unterscheiden.
4. Finde Tumorzellen Bild
   1. Für einzelne Tumorzellen Bildgebung, alle Tumorzellen zu finden und ihre Standorte mit th aufnehmene Mehr Panel der Software.
      1. Suchen Sie alle Sichtfelder Bild durch die Tumorzellen im Mikroskop Okular zu beobachten.
      2. In der Software-Schalter, mit dem Multipanel, indem Sie auf die Multi-Point-Button klicken und speichern die Position der Zelle auf der Position hinzu Schaltfläche anklicken.
   2. Für Mosaik-Bildgebung, suchen Sie den Ursprung des Mosaiks und stellen Sie die Abbildungskoordinaten
      1. Lokalisieren einer Position in der linken oberen Ecke der Struktur erfasst werden.
      2. Null die x-, y- und z-Koordinaten der Bühne durch die Taste "Zero" auf der Bühne Controller drücken.
      3. Legen Sie das entsprechende Liste der Mosaik-Koordinaten auf, indem Sie auf die Schaltfläche "Laden" klicken und die Liste auswählen.
         HINWEIS: Ein Beispiel Liste für eine 2 x 2-Mosaik mit einer 20% igen Überlappung eines 500 um Sichtfeld wäre: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400,400).
5. Entfernen Sie die Spritze with PBS in den Venenkatheter Schwanz und ersetzen mit der Spritze das Dextran enthält.
6. Langsam injizieren über die Schwanzvene Katheter durch Injektion von 50 & mgr; l steriler PBS die Leitung zu spülen, anschließend in PBS in der Maus zu 100 ul 20 mg / ml 155 kDa Rhodamin-Dextran gelöst werden. Führen Sie keine Blasen in der Leitung. Bei Bedarf injizieren Dextran mindestens eine Stunde nach der Injektion von Krebszellen, so dass das Gesamtvolumen auf der Maus verabreicht nicht überschreitet 4 ml / kg / h.
7. Richten Sie Abbildungsparameter.
   1. Schalten Sie das Mikroskop auf Multimodus.
   2. Stellen Sie den Zoom auf einen Faktor von 2X, indem Sie auf die Taktsignale Schaltfläche klicken und den Zoomfaktor Feld zu aktualisieren.
   3. Stellen Sie die Laserleistung auf ~ 10% (~ 10-15 mW bei der Probe) von den Detektoren und Laser-Taste klicken und den Tsunami Power Slider bis 10 eingestellt werden.
8. Bild jeder Lage, das Vorhandensein von Tumorzellen zu verifizieren und die Strömung und die Integrität des Vascu visualisierenlature.
   HINWEIS: Die Schiffe sollten mit fließenden Erythrozyten vollständig durchbluteten erscheinen und fluoreszierenden Dextran sollte innerhalb der Gefäße ohne Leckage zu den Extravasalraum enthalten sein. Etwa 10 bis 20 Tumorzellen innerhalb der freien Öffnung des Vakuumfensters erwartet werden.
9. Stellen Sie die Starttiefe von jeder Stelle abgebildet werden.
   1. Für jeden Standort einstellen durch Drehen des Fokusknopf auf der Bühne Controller Bild die obere Scheibe der Tumorzelle die z-Position.
   2. Positionieren Sie die Zelle in der Mitte des Sichtfeldes.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mehr, klicken Sie auf die Position des Sichtfeldes um es zu markieren und die Add-Klick für die Schaltfläche Löschen gefolgt der Zelle gespeicherten Position in der Mehr Liste zu ersetzen.
   4. Visuell beobachten, in jeder Position, die relative Helligkeit der Tumorzelle.
10. Speichern Sie die neuen Positionen von jeder der Zellen, die durch in der Multipoint-Panel ein auf die Schaltfläche Speichern klickend einen Dateinamen angeben.
11. Für die Bildgebung von einzelnen Tumorzellen, Pick drei Zellen von etwa äquivalente Helligkeit und löschen Sie alle anderen Orte aus der Mehr Liste von in der Liste auf ihrer Position klicken und dann auf die Schaltfläche Löschen klicken.
12. Klicken Sie auf die Detektoren und Laser - Taste und verschieben Sie die Regler für die PMT - Verstärkung der grünen und roten Kanäle ⁴⁵ , so dass die Signale unterhalb der Sättigung sind.
13. Stellen Sie den Regler für den blauen Kanal ⁴⁵ , so dass Makrophagen Cyan erscheinen.
    HINWEIS: Jede zweite harmonische Signal nur in den blauen Kanal erscheinen und kann zuvor ⁴⁵ beschrieben , indem Sie die Kanal Subtraktionsverfahren aus den Cyan Makrophagen getrennt werden.
14. Stellen Sie den Z-Stapel Starttiefe auf 0 & mgr; m und die Endtiefe bis 24 & mgr; m von der Z-Stufe an der Stelle zu bewegen und auf die Start- und End-Tasten sind.
    Hinweis: Zellen innerhalb dieser Tiefe wird mit dem besten Signal sichtbar gemacht werden, umRauschen und Auflösung.
15. Stellen Sie die z Schrittweite bis 3 um.
16. Stellen Sie die Bildparameter folgende Parameter vorher ^45,49 beschrieben.
    1. Für die Bildgebung von einzelnen Tumorzellen, klicken Sie auf die Taktsignale Taste und dann 4 eingeben V in den Zoomfaktor Feld (entspricht einem Zoomfaktor von 1,5x), geben Sie 3 in den Rahmen Durchschnitte Feld ein und klicken Sie auf Time-Lapse-Taste und 10 eingeben in den Zeitraffer-Feld.
       HINWEIS: Diese Einstellungen werden erwerben 1 Frame alle 3 Sek.
    2. Für Mosaik-Bildgebung, klicken Sie auf die Timing-Signale Taste und einen Zoomfaktor von 1,5 V (entspricht einem Zoomfaktor von 4X) einzugeben, geben Sie 3 in der Anzahl der Rahmenmittelwerte und klicken Sie auf die Time-Lapse-Taste und geben Sie 10 in die zeit- verfallen Zeitverzögerung Feld.
       HINWEIS: Diese Einstellungen werden erwerben 1 Frame alle 3 Sek.
17. Aktivieren Sie die Mehr, Z-Stapel und t-Lapse Imaging Modi, indem Sie auf ihre Schaltflächen klicken.
18. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um Bilder aufzunehmen.
    NICHTE: Lungengewebe ist sehr empfindlich und anfällig für Photoschäden. Wenn nach dem Zeitpunkt der Blutfluss Reihenaufnahmen in dem abgebildeten Bereich hält, der Laser sehr wahrscheinlich zu hoch ist und nachfolgende Abbildung anderer Felder müssen mit geringerer Leistung erfolgen.
19. Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten.

6. Euthanasie

1. Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%.
2. Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen.
3. Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten.

7. Bildanalyse

1. Für Einzelzell-Imaging Experimente:
   1. Laden Sie Bilder in Fidschi und formatieren Sie sie als Hyperstack.
   2. Für jede z-Scheibe in der Hyperstack, die Zeitraffer-Film spielen und auf Reste von xy Bewegung suchen. Wenn Rest xy Bewegung gefunden wird, gilt das Plugin STACKREG ³⁶ auf den Stapel aufgerufendie Bewegung zu beseitigen.
2. Für Mosaik-Bildgebung Experimente:
3. Laden Sie Bilder in Fidschi und nähen sie zusammen durch die Mosaic Stitching-Makro (Supplemental-Code-Datei Mosaic Stitching) zu öffnen und die Eingabe von Informationen über die Bilder wie das Verzeichnis, die Datei Basisnamen, die Anzahl der Felder x und y im Mosaik und die Anzahl von Scheiben und Zeitpunkten.
   HINWEIS: Aufgrund der wie Java interpretiert Verzeichnisse, Ordnernamen müssen zwei Schrägstriche als Unterordner Separatoren haben. Aufgrund von Einschränkungen in der Einbau-Plugin Pairwise Stitching, Namen Basisdatei müssen alle Striche nicht enthalten.
4. Um eine klare Sicht auf die Grenzen des Gefäßsystems zu erhalten, im Durchschnitt zusammen alle Zeitpunkte für den Blutkanal in einem einzigen Bild und dann dieses Bild replizieren als Hintergrund für jedes Bild des Films der anderen Kanäle.
   HINWEIS: Diese einfach gemacht wird, indem das Makro Blut Averaging Führen läuft (Supplemental-Code-Datei Blut Averaging Perform).

Ergebnisse

Um die Art der Ergebnisse zeigen , die mit diesem Verfahren erreicht werden kann, injizierten wir E0771-LG Tumor mit dem fluoreszierenden Protein Clover in die Schwanzvene von Mäusen MacBlue ⁴⁴ markierten Zellen zu Zeitpunkten vor der Operation variiert. Nach der Operation wurde 155 kD Rhodamin markiertes Dextran IV injiziert das Gefäßsystem und Zeitraffer-Bildgebung zu markieren durchgeführt wurde.

Wenn Mäuse ...

Diskussion

Hohe Auflösung in vivo optische Bildgebung mit fluoreszenzmarkierten funktionellen Tags kombiniert, wie Proteine und Antikörper hat sich unser Verständnis der metastatischen Kaskade dramatisch zugenommen. Es wurde eine direkte Visualisierung und Quantifizierung der Einzelzelle und subzellulären Parameter in Tumorzellen, Wirtszellen und ihrer Mikroumgebung aktiviert. Diese Abbildungs innerhalb des Primärtumors hat dazu geführt, beispielsweise zu der Entdeckung von diskreten Mikroumgebungen , die unterstüt...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter	Kent Scientific		Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A