De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Resumo

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Resumo

Metástases para locais secundários, tais como o pulmão, fígado e ossos é um evento traumático com uma taxa de mortalidade de cerca de 90% ^1. Desses sites, o pulmão é o mais difícil de avaliar utilizando imageamento óptico intravital devido à sua posição fechada dentro do corpo, delicada natureza eo papel vital na manutenção da fisiologia adequada. Enquanto modalidades clínicas (tomografia por emissão de positrões (PET), ressonância magnética (MRI) e tomografia computadorizada (CT)) são capazes de fornecer imagens não invasivas deste tecido, falta-lhes a resolução necessária para visualizar os primeiros eventos de semeadura, com um único pixel consistindo em quase mil células. Os modelos atuais de metastático de pulmão semeadura postulado de que eventos apenas após a chegada de uma célula de tumor são determinística para a sobrevivência e crescimento subseqüente. Isto significa que as ferramentas de imagem em tempo real intravital com resolução de célula única ² são necessários para definir os fenótipos da CEL semeadurals e testar esses modelos. Embora imagens ópticas de alta resolução do pulmão tem sido realizada utilizando várias preparações ex vivo, estas experiências são tipicamente ensaios ponto de tempo único e são susceptíveis a possíveis artefactos e conclusões erradas devido ao ambiente dramaticamente alterada (temperatura, profusão, citoquinas, etc. ) resultante da remoção da cavidade torácica e sistema circulatório ^3. Um trabalho recente demonstrou que a imagiologia óptica intravital lapso de tempo do pulmão intacto é possível usar um vácuo estabilizado janela de imagem ^2,4,5 No entanto, os tempos típicos de imagiologia têm sido limitada a cerca de 6 horas. Descrevemos aqui um protocolo para a realização de imagens intravital com lapso de tempo a longo prazo do pulmão utilizando uma tal janela ao longo de um período de 12 h. As sequências de imagens de lapso de tempo obtidos utilizando este método permitir a visualização e quantificação de interações célula-célula, a dinâmica da membrana e perfusão vascular no pulmão. Nós ainda mais dEscribe uma técnica de processamento de imagem que dá uma visão sem precedentes clara da microcirculação pulmonar.

Introdução

Imagens de Alta Resolução óptica intravital tem provado ser essencial para a compreensão de diversos processos biológicos, o que permite de uma única célula e os parâmetros de sub-celular a ser medido e quantificado. Em Cancer Research, imagens intravital de células tumorais e do estroma conduziu à descoberta de diversos interacções microambiente ^6-11 que estão presentes apenas no animal intacto.

Descobertas sobre microambientes associados com intravasation e disseminação de células tumorais no cancro da mama usando imagens de resolução óptica de uma única célula in vivo levou inclusive a novos marcadores de prognóstico e resposta ao tratamento em pacientes com câncer de mama ^12-16. As melhores tecnologias de imagem disponível para visualização no fundo de órgãos vitais internos intactos são as modalidades clínicas (MRI, PET, CT), que oferecem excelentes vistas sobre o órgão inteiro e pode revelar patologias mesmo antes de produzir sintomas clínicos. Eles são incapazes, however, para revelar as primeiras fases de metástase e os mecanismos celulares de condução progressão do tumor devido à sua falta de resolução de uma única célula. No momento em que as metástases pulmonares são visíveis nessas modalidades, eles estão bem estabelecidos e em proliferação. Dada a estimativa de que 90% das células disseminadas tumorais que chegam ao pulmão ou não sobrevivem ¹⁷ ou inicialmente permanecer dormente ^18, e a observação de que chegam muito mais cedo do que anteriormente esperado ^19, imaginando os primeiros passos de chegada e sobrevivência torna-se crucial para compreendendo o processo de sementeira metastática e recorrência do crescimento tumoral em locais distantes.

A execução dessas observações no pulmão tem se mostrado extremamente difícil no entanto; a grande maioria dos estudos de imagem têm utilizado ex vivo ou explantes preparações ^20-23, que só dão uma visão para o pulmão em momentos isolados. Enquanto estas preparações não fornecem informações úteisrmação, eles não dão um completo entendimento das interações, causa e efeito relacionamentos e dinâmicas que ocorrem entre os vários componentes do microambiente. A falta de um sistema circulatório adequado (e concomitante desequilíbrio da homeostase) e a desconexão do resto do sistema imunológico do corpo torna desejoso para validar as conclusões que geram estas preparações em tecido intacto in vivo.

Muitos grupos ter realizado imagens intravital do pulmão intacta ^2,4,5,24-33 com Wearn alemão e sendo o primeiro a cirurgicamente expor a camada pleural ²⁴ e Terry o primeiro a utilizar uma janela de imagem implantável ^25.

imagiologia de alta resolução no pulmão é fortemente entravada pelo movimento constante do pulmão e várias técnicas têm sido desenvolvidas para ultrapassar esta limitação. Wagner e Filley ²⁷ estudou o movimento natural do pulmão caninoe projetou seu protocolo cirúrgico para localizar sua janela implantado sobre uma região relativamente estável enquanto Wagner utilizado vácuo na sua janela preparação cirúrgica para imobilizar o tecido ^28. Desde essa altura, uma variedade de técnicas têm sido utilizados para a imagem do pulmão incluindo: aperto brônquio, apneia sequencial e imagiologia fechado, aquisição de sobreamostragem, colagem do lobo pulmonar e de vácuo ^34. Cada uma delas tem as suas vantagens e desvantagens e não uma técnica emergiu como sendo superior a outro ^34. Por exemplo, de aperto e apneia do brônquio sequencial normal de alterar a troca de gases no pulmão e pode causar atelectasia. imaging Fechado e aquisição amostrado não sofrem com essas desvantagens, mas exigem alta velocidade ou equipamentos de imagem especializado não é amplamente acessível. Finalmente, tanto a colagem do pulmão e a técnica do vácuo evitar tanto dos inconvenientes acima mencionados, mas pode apresentar lesão induzida força de cisalhamento se o cuidado de não é Taken. Nos últimos anos, a janela de vácuo foi miniaturizado e adaptado para utilização em ratinhos, utilizando microscopia confocal e multifotônica ^4,5,33 e excelente imagem de alta resolução foi atingido ^2. A Tabela 1 resume esta história rica e destaca os documentos que descrevem novos avanços no uso de janelas de imagem de pulmão intravital.

Este protocolo descreve o uso de microscopia intravital multifotônica lapso de tempo prolongado para a metástase imagem no pulmão vivo, intacto com a resolução mais elevada possível subcelular. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipada com uma lente objetiva de alta abertura numérica e detectores múltiplos tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de camundongos transgênicos são utilizados para etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto com fluorescente alta dextrano de peso molecular e células tumorais proteína transfectadas fluorescentes (de rotular as células da vasculatura e tumorais respectively). Embora esta escolha de células marcadas com fluorescência permite a visualização de interações celulares de macrófagos de células do endotélio de tumor e dinâmicas, este protocolo irá funcionar para qualquer estirpe de rato fluorescente ou não fluorescente. Após a aquisição, o movimento deriva residual (se houver) é eliminado usando um plug-in Fiji ^35,36 e personalizados macros tempo médio do canal vascular para eliminar intermitente causada por células do sangue circulante não marcados.

Embora este protocolo incide sobre a metástase de imagens, as técnicas são aplicáveis ​​a muitos outros processos biológicos observáveis ​​com imagiologia de uma única célula de alta resolução no pulmão.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste protocolo foram realizados em conformidade com as directrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia do Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Geração fluorescente etiquetado Modelo rato e células tumorais

1. Preparação de 100 ml de 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino / solução salina tamponada com fosfato (BSA / PBS) por mistura de 0,1 g de BSA com 100 ml de PBS.
2. Preparar células tumorais marcadas por fluorescência através de transfecção estável.
   NOTA: Aqui usamos células E0771-LG, um derivado altamente metastático de ratinho E0771 células de adenocarcinoma mamário ³⁷ que foram isoladas a partir de tumores metastáticos desenvolvidos no pulmão de ratinhos C57BL / 6 de rato injectado por via intravenosa com células parentais E0771 ^38.
   1. 24 horas antes da transfecção, placa 1 x 10 ⁵ células EO771-LG em um prato de cultura de tecidos de 60 mm em 2 ml de antibio10% de FBS (soro fetal bovino) DMEM isento de tiques (por Dulbecco Modified Eagle Médium) e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2.
   2. Na altura da transfecção, incubar 2 ug do vector de proteína fluorescente com 10 ul de reagente de transfecção durante 30 min antes da adição de 190 ul de meio de soro reduzido.
   3. Lave as células EO771-LG com tampão fosfato de Dulbecco (D-PBS) uma vez e adicione a mistura de transfecção com cuidado.
   4. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 6 h.
   5. Lavam-se as células e de culturas transfectadas em 2 ml de DMEM completo (10% de FBS, piruvato 1 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) durante 2 dias.
   6. Lavar as células com 2 ml de PBS estéril, adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA e incubar durante 2 min a 37 ° C.
   7. Recolhe suspensão celular e misturar com pelo menos um volume de DMEM completo e girar a 280 x g.
   8. Ressuspender as células em 1 ml de DMEM completo e expandir a cultura de células emum prato de cultura de tecidos de 10 cm.
   9. Comece a selecção de células transfectadas pela adição de 700 ug / ml de G418 antibiótico selectivo a 8 ml de DMEM completo e cultura durante uma semana, mudando meio de três em três dias.
3. Enriquecer a população de fluorescência a partir de células transfectadas que estiveram sob selecção em G418 por separação de células activada por fluorescência (FACS) ^39,40.
   1. Lavar as células com 5 ml de PBS e adicionar 1,5 ml de 0,25% de tripsina.
   2. Incubar durante 2 min a 37 ° C e misturar com pelo menos um volume de DMEM completo.
   3. Recolhe suspensão de células e girar a 280 x g e as células re-suspender em 1 mL de solução estéril de 0,1% (w / v) de tampão de BSA / PBS.
   4. Filtra-se a suspensão de células através de uma malha de 40 um e ajustar o volume para 1 ml com tampão de BSA a 0,1% / PBS durante a triagem.
   5. FACS-classificar a população mais brilhante 10% com base no espectro de fluorescência usando o classificador FACS ^41.
   6. Cultura as células classificadas por mais uma semana under selecção (700 ug / mL de G418 em meio DMEM completo).
   7. Reselect células marcadas por fluorescência por citometria de fluxo, repetindo os passos 1.3.1 a 1.3.6, mais uma vez.
   8. Depois de um segundo ciclo de selecção, trypsinize, filtro e as células em 0,1% BSA / PBS de re-suspender (como descrito passos 1.3.1-1.3.4). Ajustar a concentração para 2 x 10 ⁶ células / ml para uma única célula a separação em placas de 96 poços utilizando o classificador de SCAF.
   9. Prepare 3-5 placas de 96 poços com 100 ul de DMEM completo para a recolha. Para melhorar a sobrevivência após a triagem, adicione 100 ml de meio de cultura filtrada de pratos onde as células EO771-LG foram cultivados ^42.
   10. Após a classificação de células em placas de 96 poços, as células de regresso para a cultura durante 2 dias (37 ° C, 5% CO _2).
   11. Identificar poços com clones individuais viáveis ​​por exame sob um microscópio invertido em 5x ampliação.
   12. Trypsinize e expandir clones viáveis ​​e congelar células para backup.
       1. Lave os poços com grdevido clones com 100 ul de PBS estéril. Adicionar 50 ul de 0,25% w / v de tripsina e incubar 2 min a 37 ° C. Adicionar 50 ul de DMEM completo e transferir para estéril placa de 96 cavidades de fundo em V inferior ou rodada para girar a 280 xg durante 5 min.
       2. Ressuspender as células em 100 ul de 700 ug / ml de G418 DMEM completo e a placa de cada clone em placas de 12 poços. Adicionar 400 ul de DMEM completo com G418 e a cultura até à confluência.
       3. Lavar os poços com 500 ul de PBS, adicionar 100 ul de tripsina a 0,25% e incubar 2 min a 37 ° C. Adicionar 100 ul de DMEM completo e girar durante 5 minutos a 280 x g. Ressuspender as células em 100 ul de DMEM completo com células G418 e placa em placas de 6 cavidades até à confluência.
       4. Uma vez confluentes, Trypsinize células, spin para baixo e ressuspender em 10% DMSO em FBS a congelar stocks celulares.
       5. Manter 1/10 das suspensões de células em cultura por plaqueamento em placas de cultura de tecidos de 100 mm para a avaliação do potencial metastático.
4. Teste potencial metastático de clones selecionados.
   1. Tripsinizar as células e em solução salina re-suspensão a uma concentração de 2,5 x 10 ⁶ células / ml e injectar 200 ul em ratinhos C57BL / 6 por via intravenosa através da veia da cauda.
   2. Após 2 semanas, recolher o tecido pulmonar tal como previamente descrito ²³ e quantificar a carga tumoral por contagem de superfície ou método estereologia ^43. Selecione clones com alto potencial metastático para imagiologia intravital.
5. Levante MacBlue (um promotor específico mielóide condução expressão ciano proteína fluorescente (PCP) (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ¹⁶⁾⁾ ratos repórter ^44.
   NOTA: Normalmente, os ratos entre 8 e 12 semanas são usados, mas os ratos tão cedo quanto 7 e tão tarde quanto 20 semanas foram testados para funcionar tão bem.

2. Multiphoton Microscópio Set up and Imaging Preparação

Nota: Embora este protocolo pode ser realizada em qualquer multiphoton microscópio, o sistema utilizado para adquirir os dados apresentados neste protocolo foi descrito anteriormente em pormenor ^45.

1. Ligue todos os componentes do microscópio e laser, incluindo lasers de dois fótons e os detectores de pelo menos uma hora antes do tempo de imagem desejada.
2. Imediatamente antes da cirurgia, medir a potência de entrada de luz para o microscópio através da colocação da cabeça do medidor de potência óptica no caminho do raio um pouco antes do microscópio e ajustar os botões de espelho de laser de cavidade final até que a máxima intensidade de luz a 880 nm é lida no o medidor de potência óptica.

3. Aspiração Configurar

1. Cole a lamela para a janela de imagem (Suplementar Figura 1) com cianoacrilato. Permitir que pelo menos 4 horas para a cola secar completamente.
   NOTA: Esta etapa também pode ser feito antes do tempo.
2. Corte a ponta da pipeta de 100 mL na primeira linha da pequena abertura e ligue a extremidade sem cortes ao v finaMangueira acuum.
3. Ligar o sistema de vácuo de acordo com a Figura 1 e Figura 2 suplementar.
4. Com o vácuo na extremidade aberta e a bloqueado, ajuste do regulador de vácuo para <3 inHg.
   NOTA: o ajuste final do nível de vácuo irá ser realizada por observação da vasculatura in vivo.
5. Aplicar uma fina película de massa lubrificante de petróleo para o lado de baixo da placa de imagem para impedir que a forma da lente de imersão objectivo de serem maus distância pela placa de imagem.
6. Colocar a placa de imagem na platina do microscópio.
   NOTA: A placa de imagem personalizado (Supplemental Figura 3) é uma folha de 1/8 "de espessura de alumínio usinado tanto para caber no espaço fase de inserção e com um orifício no centro para a realização de janela de imagem.
7. Insira a janela de vácuo na placa de imagem com a lamela para baixo.
8. Esterilizar todas as superfícies e instrumentos, incluindo placa estágio de imagem, e vitória de imagemdow com etanol 70%.
9. Ligar a extremidade cortada a ponta da pipeta para a janela de vácuo e tape o tubo para baixo para a placa de imagem.
10. Trazer o próximo objectivo para a janela de imagem e coloque uma grande gota de água entre o objetivo ea lamela.
11. Certifique-se de que não existem fugas provenientes da lamela, bloqueando a abertura central da janela do vácuo e verificar que a gota de água entre o objetivo e lamela não se aspirado.
    NOTA: Uma bola do rato do computador do estilo antigo colocado sobre a janela é útil para bloquear a abertura central.

4. Surgery

1. Prepare a área cirúrgica esterilizada.
   1. Coloque todos os instrumentos de fácil acesso. Esterilizar todas as superfícies e instrumentos, incluindo área cirúrgica, e as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol.
2. Amarre um comprimento de 3 polegadas de 2-0 sutura ao cateter, ¼ de polegada acima da bucha com um nó duplo.
3. Prepare cauda fol cateter na veiaguinte o protocolo publicado por harney et ai. ^46.
4. Usando uma lâmpada de calor de infravermelho (IR), aquecer o animal na sua gaiola durante ~ 5 min para aumentar o fluxo de sangue na veia da cauda e para ajudar na inserção do cateter. Recomenda-se para manter o animal aquecido a temperaturas fisiológicas ao longo do procedimento cirúrgico utilizando uma lâmpada de calor ou uma almofada de aquecimento.
5. Anestesiar os animais com 5% de isoflurano e verificar que não há resposta a uma pitada dedo do pé.
6. Aplicar pomada oftálmica para os olhos do animal.
7. Aplicar loção depilatória para 10-30 segundos para remover o cabelo do lado esquerdo do animal; a partir da linha média do peito para ¼ das costas e desde a axila até logo abaixo da caixa torácica.
8. Limpe qualquer excesso de loção e esterilizar a pele exposta com álcool a 70%.
9. Anexar uma seringa estéril preenchido com PBS ao cateter na veia da cauda e inserir e fita no lugar seguindo o protocolo publicado pela Harney et al. ^46. Verifique se a fita está firmemente aderido à própria agulha e não é livre no espaço entre a cauda e a fita.
10. Entubar o mouse seguindo um protocolo publicado por Das et al. ^47, ou por DuPage et al. ⁴⁸
11. Ligue o ventilador e configurá-lo para fornecer 135 respirações por minuto e 200 mL de mistura de isoflurano em oxigênio.
12. Conectar o cateter traqueal ao ventilador.
13. Mova o mouse para a área cirúrgica. Tenha muito cuidado para não deslocar o cateter.
14. Amarre o 2-0 sutura em torno do focinho do mouse sob a dentes da frente.
15. Tape o cateter para o focinho.
16. Tape o membro anterior esquerdo para o cateter para mantê-lo fora do campo cirúrgico.
17. Reduzir a anestesia isoflurano a um nível de manutenção de 2,5% e verifique se não há resposta a uma pitada dedo do pé.
18. Usando a tesoura afiada, retire 1 ^cm2 de pele por cima da parede torácica esquerda.
19. elevador tele mamária almofada de gordura e cauterizar quaisquer vasos sanguíneos expostos com a caneta cautério.
20. Ressecar a almofada de gordura por corte com a tesoura afiada.
21. Remover a camada de músculo para baixo para a caixa torácica por corte com uma tesoura afiada. Tome cuidado para não cortar a veia axilar em execução na base do membro anterior.
22. Use uma pinça para agarrar e levantar a ^6ª costela. Usando os tesoura afiada realizada em um ângulo raso (~ 5 °) cortar a nervura perto da borda da abertura na pele. Tenha muito cuidado para não tocar no tecido pulmonar exposta.
23. Alargar a abertura na parede torácica para expor todo o lobo pulmonar através da remoção de quatro alhetas consecutivas.
    Nota: Mantenha a abertura de pelo menos 5 mm de distância do esterno para evitar o coração.
24. Levante cuidadosamente o mouse, segurando o cateter cauda e traqueal e mova o mouse para o estágio de imagem de microscópio.
25. Com o off de vácuo, encher a câmara da janela do vácuo com PBS.
26. Inverta o mouse e posicionar o expostopulmão sobre a janela de imagem de vácuo.
27. Lentamente ligar o vácuo para cerca de 3-5 polegadas de mercúrio usando a válvula de esfera.
28. Coloque um arnês de restrição feita de papel de tecido dobrado ao meio duas vezes sobre o peito do rato e fita para a placa da platina, como mostrado na Figura 2 Suplementar.
29. Prenda o sensor de coxa do oxímetro de pulso para coxa do animal e iniciar o software.
30. Coloque a câmara ambiental no palco e ligue o calor para manter o rato a uma temperatura fisiológica.
31. Reduzir o nível de isoflurano a 1-1,5% para manter a anestesia e manter o fluxo de sangue.

5. Imagem intravital

1. Traga a lente objectiva 25 x 0,95 abertura numérica (NA), próximo da lamela e adicionar uma grande queda de água entre eles.
2. Usando o modo de epifluorescência, ver o canal FITC e trazer o tecido pulmonar em foco.
3. Se não for feito antes da cirurgia, icélulas tumorais nject através do cateter da veia da cauda.
   1. Desligue o PBS seringa a partir do catéter da veia da cauda.
   2. Carregar uma seringa estéril, com 100 ul de suspensão de células tumorais (2 x 10 ⁷ células / ml em PBS máxima).
      NOTA: Este passo pode ser efectuada previamente, para estudar chegada de células de cancro no pulmão em diferentes pontos de tempo.
   3. Ligar a seringa com células tumorais para o cateter da veia da cauda.
   4. Lentamente injectar as células tumorais na veia da cauda.
   5. Desligar a seringa com as células do tumor a partir do catéter da veia da cauda.
   6. Voltar a ligar a seringa ao cateter de PBS na veia da cauda.
      NOTA: Identificar as localizações de todas as células tumorais antes de injectar o dextrano, uma vez que se torna difícil distinguir as células tumorais a partir do sinal de dextrano através da ocular após injecção.
4. Localizar as células tumorais a imagem
   1. For Imaging células tumorais individuais, localize todas as células tumorais e gravar seus locais com thpainel multiponto e do software.
      1. Localize todos os campos de visão para a imagem através da observação das células tumorais na ocular microscópio.
      2. No software, mudar para o painel de multiponto, clicando no botão Multi-Point e armazenar a localização do celular, clicando no botão Adicionar Posição.
   2. Para geração de imagens em mosaico, localize a origem do mosaico e definir as coordenadas de imagem
      1. Localizar uma posição no canto superior esquerdo da estrutura a ser capturado.
      2. Zero x, yez coordenadas do palco, empurrando o botão "Zero" no controlador de estágio.
      3. Coloque-se a lista apropriada de coordenadas de mosaico clicando no botão "Load" e selecionando a lista.
         NOTA: Uma lista exemplificativa de um mosaico 2 x 2 com uma sobreposição de 20% de um campo de 500 um de vista seria: Pos.1 = (0,0), pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400400).
5. Remover a seringa Wom PBS na veia da cauda do cateter e substituir com a seringa contendo o dextrano.
6. Injecte lentamente até 100 ul de 20 mg / ml 155 kDa rodamina-dextrano dissolvido em PBS para o rato através do cateter da veia da cauda, ​​seguido por injecção de 50 ul de PBS estéril para lavar a linha. Não introduzir quaisquer bolhas na linha. Quando necessário, injectam dextrano, pelo menos, uma hora após a injecção de células de cancro de modo a que o volume total administrada ao rato não exceda 4 ml / kg / hr.
7. Configurar os parâmetros de imagem.
   1. Mudar o microscópio para o modo multiphoton.
   2. Ajuste o zoom para um fator de 2X, clicando no botão sinais de temporização e atualizar o campo Zoom Factor.
   3. Ajustar a potência do laser para ~ 10% (~ 10-15 mW na amostra), clicando no botão Detectores e Laser e depois ajustando o controle deslizante Tsunami de energia a 10.
8. Imagem cada local para verificar a presença de células tumorais e visualizar o fluxo e a integridade do vasculature.
   Nota: Os recipientes devem aparecer totalmente perfundidos com eritrócitos de fluidez e dextrano fluorescente deve ser contido dentro dos vasos sem fugas aos espaços extravasculares. Aproximadamente 10 - 20 as células tumorais são esperados para estar dentro da abertura livre da janela de vácuo.
9. Ajustar a profundidade de partida de cada local a ser trabalhada.
   1. Para cada local, ajustar a posição de Z através da rotação do botão de foco no controlador de fase para a imagem da fatia superior da célula de tumor.
   2. Posicionar a célula no centro do campo de visão.
   3. Clique no botão Multipoint, clique na posição do campo de visão para destacá-lo e clique no botão Adicionar, seguido do botão Excluir para substituir a posição armazenada da célula na lista multiponto.
   4. Observar visualmente o brilho relativo da célula do tumor em cada posição.
10. Salvar os novos locais de cada uma das células, clicando no botão Salvar no painel de um Multipointd especificar um nome de arquivo.
11. Para geração de imagens de células tumorais individuais, escolher três células de brilho aproximadamente equivalente e excluir todos os outros locais da lista multiponto, clicando sobre sua localização na lista e clicando no botão Excluir.
12. Clique no botão Detectores e Laser e ajustar os controles deslizantes para o ganho de PMT dos canais verde e vermelho ⁴⁵ para que os sinais estão abaixo da saturação.
13. Ajuste o controle deslizante para o canal azul ⁴⁵ de modo a que os macrófagos parecem ciano.
    NOTA: Qualquer segundo sinal harmónico aparecerá apenas no canal azul e pode ser separado dos macrófagos ciano, seguindo o procedimento de canal subtração descrito anteriormente ^45.
14. Definir a profundidade início z-stack para 0 mm e a profundidade final de 24 mm, movendo o estágio z para o local e clicando em Iniciar e Fim botões, respectivamente.
    NOTA: As células dentro desta profundidade será visualizado com o melhor sinal pararuído e resolução.
15. Defina o tamanho z passo a 3 um.
16. Defina os parâmetros de imagem seguintes parâmetros previamente descrita ^45,49.
    1. Para geração de imagens de células tumorais individuais, clique no botão sinais de temporização e digite 4 V para o campo fator de zoom (equivalente a um fator de zoom de 1.5X), digite 3 no campo quadro médias e clique no botão Time-Lapse e digite 10 no campo Time-lapse.
       NOTA: Estas definições irá adquirir um quadro a cada 3 segundos.
    2. Para imagens de mosaico, clique no botão sinais de temporização e insira um fator de zoom de 1,5 V (equivalente a um fator de zoom de 4X), digite 3 no número de médias de quadro e clique no botão Time-Lapse e digite 10 para o tempo- caducar campo atraso de tempo.
       NOTA: Estas definições irá adquirir um quadro a cada 3 segundos.
17. Ative a multiponto, z-stack e modos de imagem t-lapso clicando em seus botões.
18. Pressione o botão de gravação para adquirir imagens.
    NÃOE: O tecido pulmonar é muito delicado e suscetível a foto-dano. Se após o tempo de fluxo sanguíneo imagem lapso pára no campo imagético, o laser é mais provável de imagem muito alta e posterior de outros campos deve ser feito pelo poder inferior.
19. Cada 30-45 minutos, injectam-se lentamente 50 mL de PBS ou soro fisiológico para manter a hidratação do animal.

6. A eutanásia

1. Aumentar o isoflurano a 5%.
2. Mantenha o animal com menos de 5% de isoflurano até 30 segundos depois ela deixa de respirar e remover o animal do palco.
3. Realizar deslocamento cervical para assegurar a eutanásia completa.

Análise 7. Imagem

1. Para experimentos com imagens de células individuais:
   1. Carregar imagens em Fiji e formatá-los como um hyperstack.
   2. Para cada z-slice na hyperstack, reproduzir o filme de lapso de tempo e olhar para o movimento xy residual. Se o movimento xy residual for encontrada, aplicar o plugin chamado StackReg ³⁶ a pilha paraeliminar o movimento.
2. Para experimentos com imagens em mosaico:
3. Carregar imagens em Fiji e uni-las abrindo o Mosaic costura macro (arquivo Suplementar código mosaico costura) e inserir as informações sobre as imagens como o diretório, o nome de base do arquivo, o número de X e Y campos no mosaico eo número de fatias e pontos de tempo.
   NOTA: Devido à forma como Java interpreta diretórios, nomes de pastas deve ter duas barras invertidas como separadores de subpastas. Devido a limitações no plug-in Pairwise costura built-in, os nomes dos arquivos de base não devem conter quaisquer traços.
4. Para obter uma visão clara dos limites da vasculatura, em média, em conjunto todos os pontos de tempo para o canal de sangue em uma única imagem e, em seguida, esta imagem replicar como o fundo para cada quadro do filme dos outros canais.
   NOTA: Este é feito simplesmente executando a macro executar médias Blood (arquivo de código suplementar Execute Média Blood).

Resultados

Para demonstrar o tipo de resultados que podem ser conseguidos com este método, as células tumorais injectadas E0771-LG marcadas com o trevo proteína fluorescente na veia da cauda de ratinhos MacBlue ⁴⁴ em diferentes pontos de tempo antes da cirurgia. Após a cirurgia, 155 kD rodamina dextran marcado foi injectado por via intravenosa para marcar a imagem vasculatura e lapso de tempo foi realizada.

Quando imagiolo...

Discussão

Alta resolução em imagiologia óptica vivo combinada com etiquetas marcadas fluorescentemente funcionais, tais como proteínas e anticorpos aumentou dramaticamente a nossa compreensão da cascata metastática. Ele permitiu a visualização directa e quantificação de uma única célula e os parâmetros de sub-celulares em células tumorais, células hospedeiras e o seu microambiente. Esta imagem no interior do tumor primário tem levado, por exemplo, para a descoberta de microambientes discretas que...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter	Kent Scientific		Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A