진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

요약

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

초록

이러한 폐, 간, 뼈 등의 보조 사이트에 전이가 약 90 % ^1의 사망률과 외상 이벤트입니다. 이러한 사이트 중 폐 인해 몸, 섬세한 자연과 적절한 생리 유지에 중요한 역할 내에서 밀폐 된 위치로 생체 내에 광학 영상을 사용하여 평가하기가 가장 어렵다. 임상 양상 (양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)이)이 조직의 비침 이미지를 제공 할 수있는 반면, 한 번의 픽셀과 초기 시드 이벤트를 시각화하는데 필요한 해상도를 결여 거의 천 세포로 구성. 단지 종양 세포의 도착 후 이벤트가 생존과 이후의 성장에 결정적 전이성 폐 시드 가정의 현재 모델. 이 단일 세포 ^분석이 실시간으로 생체 내에 이미징 도구 시딩 CEL의 표현형을 정의하기 위해 필요하다는 것을 의미LS는이 모델을 테스트합니다. 폐의 고해상도 광학 영상은 다양한 생체 제제를 사용하여 수행되었지만, 이러한 실험은 전형적으로 단일 시간 시점 분석하고 (인해 대폭 변화된 환경 온도 풍부, 사이토 카인 등 아티팩트 가능한 잘못된 결론에 취약 ) 흉강 및 순환 시스템 ^3에서 제거한. 최근 작품은 진공 그러나 영상 창 ^{2,4,5 안정화} 사용 가능한 그대로 폐의 시간 경과 생체 내에 광학 영상입니다 보이고있다 일반적인 영상 시간은 약 6 시간으로 제한되어있다. 여기에서 우리는 12 시간의 기간에 걸쳐 이러한 윈도우를 이용한 폐의 장기간 생체 내에 촬영 된 영상을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 시간 경과 이미지 시퀀스는 폐의 시각화 및 세포 - 세포 상호 작용의 정량, 막 역학과 혈관 관류 수 있습니다. 우리는 더 라폐의 미세 혈관의 전례 명확한 도면을 제공하는 영상 처리 기술을 방접원을 그리다.

서문

고해상도 생체 내에 광학 영상은 단일 셀 및 하위 세포 매개 변수 측정 및 정량화 될 수 있도록 다수의 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다. 암 연구에서, 종양 및 기질 세포의 생체 내에 영상은 그대로 동물에만 존재하는 많은 미세 환경의 상호 작용 ^6-11의 발견하게되었다.

생체 내에서 단일 세포 해상도 광학 영상을 이용하여 유방암 intravasation 및 종양 세포의 보급과 관련된 미세 환경에 대한 발견은 심지어 예후 유방암 환자의 ^12-16 치료에 대한 반응에 대한 신규 마커하게되었다. 그대로 내부 중요한 장기 내에서 깊은 볼에 사용할 수있는 최고의 영상 기술은 전체 기관의 뛰어난 전망을 제공하고 임상 증상을 생산하기도 전에 병리을 표시 할 수있는 임상 양상 (MRI, PET, CT)입니다. 그들은 수없는, 시간owever 때문에 단일 셀 해상도의 부족으로 종양의 진행을 구동 전이의 초기 단계와 세포 메커니즘을 공개합니다. 그 때까지는 폐 전이가이 양식에서 볼 수 있습니다, 그들은 잘 설립 및 확산된다. 그들은 훨씬 이전에 이미 도달 생존의 초기 단계 촬상 ¹⁹ 예상보다 도착 파종 성 종양의 폐에 도달하거나 ^{17 생존하지} 않거나 초기 휴지 ^{18 남아} 세포 및 관찰의 90 %가 중요하게되는 예상 주어 원거리 사이트에 시딩 전이성 종양 성장의 반복 과정을 이해.

폐에서 이러한 관측을 수행하면 그러나 매우 어려운 입증했다; 영상화 연구의 대부분은 단지 하나의 시점에서 폐로보기를 제공 체외 이식편 또는 제제 ^(20-23)을 이용했다. 이러한 준비는 유용한 정보를 제공 할 수 있지만rmation, 그들은 미세 환경의 다양한 구성 요소 사이에 발생하는 상호 작용, 원인과 결과 관계, 역학의 완전한 이해를 제공하지 않습니다. 적절한 순환 시스템 (및 항상성 수반 불균형)과 신체의 면역 시스템의 나머지 부분에서 단절의 부족은 내리기이 제제는 생체 내에서 그대로 조직에서 생성 결론을 확인 할 수 있습니다.

많은 그룹은 Wearn과 독일은 흉막 층 ^(24)을 노출 외과 적 먼저 테리 이식 이미징 창 ^(25)을 활용하는 첫번째 인에 그대로 폐 ^{2,4,5,24-33의} 생체 내에 이미징을 수행했습니다.

폐의 고해상도 영상은 크게 폐의 지속적인 움직임에 의해 방해되고, 몇몇 기술은 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었다. 바그너와 Filley ²⁷ 개 폐의 자연적인 움직임을 연구바그너는 조직 ^(28)를 고정하기 위해 자신의 창 수술 준비에 진공을 이용하면서 상대적으로 고정 된 영역에 걸쳐 이식 창을 찾기 위해 자신의 수술 프로토콜을 설계했습니다. 기관지 클램프, 순차적 인 가사와 게이트 이미징, 오버 샘플링 수집, 폐 엽 진공 ^(34)의 접착 : 그 이후, 다양한 기술은 이미지에 포함 폐를 활용하고있다. 이러한 각각의 장단점을 갖고 어떤 하나의 기술은 서로 ³⁴ 우량 등장하지 않았다. 예를 들어, 기관지 클램핑 순차적 무호흡증은 폐에서 가스의 정상적인 교환을 변경하고 무기폐의 원인이 될 수 있습니다. 정문 이미징 및 오버 샘플링 된 인수는 이러한 단점을하지만 고속 또는 전문 영상 장비 널리 액세스 할 수 없습니다 필요하지 않습니다. 결국 폐 모두 접착제 및 진공 기술은 상술 한 문제점을 모두 피할 수 있지만,주의가 탁하지 않은 경우 전단력에 의한 손상을 나타낼 수있다엉. 최근, 진공 창 소형화되었고 공 초점 및 다 광자 현미경 ^4,5,33 우수한 고해상도 화상을 사용하여 마우스에서 사용되도록 획득 ^된이. 표 1은 이러한 오랜 역사를 요약 및 신규를 설명 그 종이를 강조 생체 내에 폐 촬상 창 사용의 발전.

이 프로토콜은 가능한 가장 높은 세포 내 해상도 라이브, 그대로 폐의 이미지 전이에 장시간 경과 광자 생체 내에 현미경의 사용을 설명합니다. 이미지는 고 개구 수 대물 렌즈 복수 광전자 증 배관 (PMT) 검출기를 구비 한 다 광자 현미경을 사용하여 최대 12 시간 동안 획득된다. 형질 전환 마우스 모델은 형광 고 분자량 덱스 트란과 형광 단백질 형질 전환 된 종양 세포 (혈관과 종양 세포가 respectivel 레이블을 함께 형광 라벨 기본 식세포에 사용된다와이). 형광 표지 된 세포의이 선택은 종양 세포 내피 세포 - 대 식세포 상호 작용과 역학의 시각화 할 수 있지만,이 프로토콜은 형광 또는 비 형광 마우스의 변형을 위해 작동합니다. 인수 후, 잔류 드리프트 운동 (있는 경우) 레이블이없는 순환 혈액 세포에 의한 점멸 제거하기 위해 ^{35, 36} 및 사용자 지정 매크로 시간 평균에게 혈관 채널을 플러그인 피지를 사용하여 제거된다.

이 프로토콜은 촬상 전이에 초점을 맞추고 있지만, 기술은 폐 고해상도 단일 셀 이미징 관찰 다른 여러 생물학적 과정에 적용될 수있다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

1. 생성 형광 표지 된 마우스 모델 및 종양 세포

1. PBS 100㎖로 BSA 0.1 g을 혼합하여 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민 / 인산 완충 생리 식염수 (BSA / PBS) 완충액 100 ㎖를 준비한다.
2. 안정적인 형질 전환에 의해 형광 표지 된 종양 세포를 준비합니다.
   참고 : 여기에서 우리는 E0771-LG 세포, 정맥 부모 E0771 셀 ^(38)를 주입 C57BL / 6 마우스의 폐에서 개발 된 전이성 종양에서 고립 된 E0771 마우스 유방 선암 세포 ^(37)의 높은 전이성 유도체를 사용합니다.
   1. 형질 전환 이전에 24 시간, 플레이트 (1) × 10 antibio 2 ㎖에 60mm 조직 배양 접시에 ⁵ EO771-LG 세포틱 무료 10 % FBS (소 태아 혈청) DMEM (둘 베코의 변형 이글 중간) 및 37 ° C에서 품어 5 % CO _2.
   2. 트랜시, 혈청 감소 배지 190 μl를 첨가하기 전에 30 분 동안 형질 감염 시약 10 μL와 형광 단백질 벡터의 2 μg의 부화.
   3. 워시 EO771-LG는 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (D-PBS)와 세포를 한 번 부드럽게 형질 믹스를 추가합니다.
   4. 6 시간 동안 37 ° C, 5 % CO _2에서 품어.
   5. 2 일 동안 완전한 DMEM 2 ㎖ (10 % FBS, 1mM의 피루브산, 100 U / ㎖ 페니실린, / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의)에 형질 감염된 세포와 문화를 씻으십시오.
   6. 멸균 PBS 2 ㎖로 세포를 씻으 0.25 % 트립신 EDTA 500 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분 동안 품어.
   7. 세포 현탁액을 수집하고 완전한 DMEM의 1 이상의 볼륨과 혼합하고 280 x g에서 스핀 다운.
   8. 완전 DMEM 1 ㎖에 재현 탁하고 세포로 세포 배양을 확장10cm의 조직 배양 접시.
   9. 3 일 매체를 변경, 일주일 동안 완전한 DMEM과 문화의 8 ml의 G418 선택적 항생제의 700 ㎍ / ml에 추가하여 형질 전환 된 세포의 선택을 시작합니다.
3. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) ^{39, 40에} 의해 G418의 선택을 받고있는 형질 감염된 세포에서 형광 인구 풍부.
   1. PBS 5 ㎖로 세포를 씻으 1.5 ml의 0.25 %의 트립신을 추가합니다.
   2. 37 ° C에서 2 분 동안 품어하고 완전한 DMEM 적어도 하나의 볼륨으로 섞는다.
   3. 세포 현탁액을 수집하고 280 XG에 스핀 다운 및 멸균 0.1 %의 1 ㎖ (w / v)의 BSA / PBS 버퍼에 세포를 다시 일시 중지합니다.
   4. 40 μm의 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링 및 정렬 0.1 % BSA / PBS 버퍼 1 ml의에 볼륨을 조정합니다.
   5. FACS 분류기 ^(41)를 사용하여 형광 스펙트럼에 기초하여 10 % 밝은 인구 FACS는 정렬 -.
   6. 다른 주 u를위한 문화 정렬 된 셀파인더 선택 (전체 DMEM 700 μg의 / ㎖의 G418).
   7. 세포 계측법 다시 한 번 단계 1.3.6에 1.3.1를 반복하여 흐름에 의해 형광 표지 된 세포를 다시 선택.
   8. (단계 1.3.1-1.3.4) 한 바와 같이 선택를 Trypsinize, 필터의 제 2 라운드에서 0.1 % BSA / PBS에 세포를 다시 일시. FACS 분류기를 사용하여 96 웰 플레이트에 정렬 단일 셀 2 × 10 ⁶ 세포 / ml로 농도를 조절합니다.
   9. 컬렉션의 전체 DMEM 100 ㎕로 3 ~ 96 웰 플레이트를 준비합니다. 정렬 후 생존율을 향상 EO771-LG 셀 ^(42)을 성장시켰다 요리에서 필터링 배지 100 μl를 추가합니다.
   10. 96 웰 플레이트로 세포를 선별 한 후, 2 일 동안 배양 세포 복귀 (37 ° C, 5 % CO _2).
   11. 5 배 배율에서 거꾸로 현미경으로 검사가 가능한 단일 클론과 우물을 확인합니다.
   12. 를 Trypsinize 및 실행 가능한 클론을 확장하여 백업을 위해 세포를 동결.
       1. GR에 우물을 씻으십시오멸균 PBS 100 ㎕와 클론을 때문에. V 트립신 / w 0.25 %의 50 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분을 품어. 완전한 DMEM 50 μl를 추가하고 5 분 동안 280 XG에 스핀 다운 멸균 V-바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다.
       2. 재현 탁의 700 μg의 / ㎖의 G418 완전한 DMEM 100 ㎕의 세포를 12 웰 플레이트의 각 클론을 접시. 합류 할 때까지 G418와 문화 완전한 DMEM의 400 μl를 추가합니다.
       3. , PBS 500 μL와 우물을 씻어 0.25 % 트립신의 100 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 분을 품어. 완전한 DMEM의 100 μl를 추가하고 280 X g에서 5 분 동안 스핀 다운. 합류까지 6 웰 플레이트에서 G418 및 플레이트 세포 완전한 DMEM의 100 UL에서 세포를 재현 탁.
       4. 합류 후를 Trypsinize 세포는, 스핀 다운 및 FBS 10 % DMSO에 재현 탁 세포의 주식을 동결 할 수 있습니다.
       5. 자신의 전이성 잠재력의 평가를 위해 100mm 조직 문화 요리를 도금 문화의 세포 현탁액의 1/10을 유지합니다.
4. 선택된 클론의 전이 가능성을 테스트합니다.
   1. 를 Trypsinize 및 ml의 2.5 × 10 ⁶ 세포 /의 농도로 생리 식염수 세포를 재 - 일시 중단 꼬리 정맥을 통해 정맥 C57BL / 6 마우스에 200 μl를 주입.
   2. 이전 ²³ 바와 같이 이주 후, 폐 조직을 수집 표면 수나 stereological 방법 ^(43)에 의해 종양 부담을 정량화. 생체 내에 영상에 대한 높은 전이성 잠재력을 가진 클론을 선택합니다.
5. MacBlue 기자 마우스 ⁽⁴⁴⁾ (시안 형광 단백질 (CFP) 식 (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16)를 구동 골수 특이 적 프로모터)를 올립니다.
   참고 : 일반적으로, 8, 12 주 사이에 마우스가 사용되지만, 빠르면 7로하고 후반 20 주뿐만 아니라 작업을 테스트 한 마우스.

2. 다중 광자 현미경 세트 업 및 이미지 준비

주 :이 프로토콜은 모든 m에 대해 수행 될 수 있지만ultiphoton 현미경이 프로토콜에 도시 된 데이터를 획득하기 위해 사용되는 시스템을 상세히 ⁴⁵ 이전에 설명되었다.

1. 두 광자 레이저와 적어도 한 시간 앞으로 원하는 영상 시간의 검출기를 포함하여 모든 현미경과 레이저 구성 요소의 전원을 켭니다.
2. 에 판독 단지 수술하기 전에 단지 현미경 전에 빔 경로의 광 파워 미터의 헤드를 배치하여 현미경 광 입력 전력을 측정하고, 880 nm에서의 최대 광 강도까지 레이저 단부 공동 미러 노브 조정 광 파워 미터.

3. 진공 시스템 설정

1. 시아 노 아크릴 레이트와 이미징 창 (보충 그림 1)에 coverslip에 접착제. 완전히 건조 접착제에 적어도 4 시간을 허용합니다.
   참고 :이 단계는 또한 미리 수행 할 수 있습니다.
2. 작은 구멍에서 첫 번째 줄에 100 μL 피펫 팁을 잘라 얇은 V에 포경 끝을 연결acuum 호스.
3. 그림 1과 보조 그림 2에 따라 진공 시스템을 연결합니다.
4. 에 진공 차단 개방 끝으로, <3 inHg와의 진공 조절기를 조정합니다.
   주 : 진공 수준을 최종적으로 조정은 생체 내에서 혈관의 관찰에 의해 수행 될 것이다.
5. 이미징 플레이트에 의해 얻어 사악한에서 대물 렌즈 액침 매체를 방지하는 촬상 플레이트의 밑면에 석유 윤활제의 박막을 적용한다.
6. 현미경 단계에있는 이미징 플레이트를 놓습니다.
   주 : 사용자 촬상 판 (보조도 3) 1/8의 시트는 "두께의 알루미늄은 모두 스테이지 삽입 공간에 맞지 촬상 윈도우를 유지하는 중앙의 관통 구멍으로하는 가공.
7. 아래 커버 슬립와 이미징 플레이트에 진공 창을 삽입합니다.
8. 소독 모든 표면 및 악기 이미징 스테이지 판을 포함, 및 이미징 승리70 % 에탄올로 다우.
9. 진공 창에 피펫 팁의 절단 끝을 연결하고 영상 판까지 호스를 테이프.
10. 이미징 창 목적 가까이 가져오고 목적과 커버 슬립 사이에 물의 큰 방울을 배치합니다.
11. 진공 윈도우의 중앙 개구를 차단하고 객관적이고 커버 슬립 사이의 워터 드롭이 흡입되지 않는 것을 확인하여 커버 슬립에서 누출이 없는지 확인합니다.
    참고 : 창 위에 배치 오래 된 스타일 컴퓨터 마우스 볼이 중앙 개구를 차단하는 데 유용합니다.

4. 수술

1. 멸균 수술 영역을 준비합니다.
   1. 쉽게 이동할 수 있습니다 모든 악기를 놓습니다. 외과 영역 및 70 % 에탄올로 수술 도구를 포함하여 모든 표면 및 악기를 소독.
2. 이중 매듭 부싱 위 카테터에 ¼ 인치를 2-0 봉합사의 3 인치의 길이를 묶어.
3. 꼬리 정맥 카테터 FOL 준비Harney 등의 등. ^(46)에 의해 게시 된 프로토콜을 lowing의.
4. ~ 5 분 꼬리 정맥에서 혈액 흐름을 증가시키고, 카테터의 삽입을 돕기 위해하기위한 적외선 (IR) 가열 램프를 사용하여, 그 장에 동물을 가온. 가열 램프 또는 온난화 패드를 사용하여 수술을 통해 생리적 온도로 가열 동물을 유지하는 것이 좋습니다.
5. 5 % 이소 플루 란과 동물을 마취하고 발가락 핀치에 대한 응답이 없음을 확인합니다.
6. 동물의 눈 안과 연고를 적용합니다.
7. 동물의 좌측으로부터 모발을 제거하기 위해 10 ~ 30 초 동안 제모 로션 적용; 뒷면의 ¼에 가슴의 중간 선에서 바로 흉곽 아래에 잎 겨드랑이에서.
8. 초과 로션을 청소하고 70 % 알코올에 노출 된 피부를 소독.
9. 꼬리 정맥 카테터로 PBS로 가득 멸균 주사기를 부착하고 Harney 등의 알에 의해 게시 된 프로토콜 다음 장소에 삽입하고 테이프. ^46. 테이프가 안전하게 바늘 자체에 부착하고, 꼬리와 테이프 사이의 간격에서 무료로하지 않습니다되어 있는지 확인합니다.
10. 다스 등. ^(47)에 의해 또는 듀 페이지 등에 의한 게시 된 프로토콜 중 다음 마우스를 삽관. ⁽⁴⁸⁾
11. 인공 호흡기의 전원을 켜고 분 당 135 호흡과 이소 플루 란 산소의 혼합물 200 μl를 공급하기 위해 설정합니다.
12. 인공 호흡기에 기관 카테터를 연결합니다.
13. 수술 영역으로 마우스를 이동합니다. 카테터을 제거하지 않도록 세심한주의를 기울입니다.
14. 앞니에서 마우스의 코 주위에 2-0 봉합을 묶어.
15. 주둥이에 카테터를 테이프입니다.
16. 수술 분야에서 그것을 유지하기 위해 카테터에 왼쪽 앞다리를 테이프.
17. 2.5 %의 유지 보수 레벨에 이소 플루 란 마취를 내리고 발가락 핀치에 대한 응답이없는 확인.
18. 날카로운 가위를 사용하여, 왼쪽 가슴 벽 위에 피부의 1cm ^{2를 제거합니다.}
19. 리프트 t그는 지방 패드를 유선과 소작 펜으로 노출 된 혈관을 소작.
20. 날카로운 가위로 절단하여 지방 패드를 절제.
21. 날카로운 가위로 절단하여 흉곽에 근육 층을 제거합니다. 앞다리의 기지에서 겨드랑 정맥의 실행을 차단하지 않도록주의하십시오.
22. 잡아 6 ^번째 늑골을 들어 올려 집게를 사용합니다. 얕은 각도에서 열린 날카로운 가위를 사용하여 (~ 5 °)은 피부의 구멍의 가장자리 근처에 리브를 잘라. 노출 된 폐 조직을 건드리지 않도록 세심한주의를 기울입니다.
23. 연속 4 리브를 제거함으로써 전체 폐 로브를 노출 가슴 벽의 개구를 넓힐.
    참고 : 마음을 피하기 위해 흉골에서 최소 5mm 거리에 개통을 유지합니다.
24. 조심스럽게 꼬리와 기관 카테터를 잡고 마우스를 올려 현미경 이미징 단계로 마우스를 이동합니다.
25. 진공 해제로, PBS와 진공 윈도우의 챔버를 입력합니다.
26. 마우스를 반전하고 노출 위치진공 촬상 창 위에 폐.
27. 천천히 볼 밸브를 사용하여 수은의 약 3-5인치에 진공을 켭니다.
28. 기업도 2에 도시 된 바와 같이 스테이지 판의 마우스와 테이프의 가슴 위에 두번 접은 반 휴지 이루어지는 구속 하네스 놓는다.
29. 동물의 상부 허벅지에 맥박 산소 측정기의 허벅지 센서를 클립하고 소프트웨어를 시작합니다.
30. 무대에 환경 챔버를 놓고 생리적 온도에서 마우스를 유지하기 위해 열을 켭니다.
31. 마취를 유지하고 혈류를 유지하기 위해 1.5 %의 이소 플루 란의 레벨을 줄인다.

5. 생체 내에 영상

1. 커버 슬립 근처 25 X 0.95의 개구 수 (NA)의 대물 렌즈를 가지고 그들 사이에 물의 큰 방울을 추가한다.
2. 표면 형광 모드를 이용하여 FITC 채널을 확인하고 초점 폐 조직을 가지고.
3. 수술 이전에 수행하지 않은 경우, 나는꼬리 정맥 카테터를 통한 nject 종양 세포.
   1. 꼬리 정맥 카테터에서 PBS 주사기를 분리합니다.
   2. 종양 세포 현탁액 (PBS 최대에서 2 × ¹⁰⁷ 세포 / ㎖) 100 ㎕와 함께 멸균 주사기를로드.
      참고 :이 단계는 서로 다른 시간 지점에서 폐에 암 세포 도착을 연구하기 위해 사전에 수행 할 수 있습니다.
   3. 꼬리 정맥 카테터에 종양 세포에 주사기를 연결합니다.
   4. 천천히 꼬리 정맥에 종양 세포를 주입.
   5. 꼬리 정맥 카테터에서 종양 세포와 주사기를 분리합니다.
   6. 꼬리 정맥 카테터에 PBS 주사기를 다시 연결합니다.
      주 :이 주입 후 안구 통해 덱스 신호로부터 종양 세포를 구별하는 것이 곤란해진다로서 덱스 트란을 주입하기 전에 종양 세포 모두의 위치를 ​​식별한다.
4. 이미지에 종양 세포를 찾습니다
   1. 각각의 종양 세포 이미징을위한 모든 종양 세포를 찾아 번째로 그 위치를 기록소프트웨어의 전자 멀티 패널.
      1. 현미경 안구의 종양 세포를 관찰하여 이미지 뷰의 모든 필드를 찾습니다.
      2. 소프트웨어에서 멀티 포인트 버튼을 클릭하여 멀티 패널로 전환하고 추가 위치 버튼을 클릭하여 셀의 위치를 ​​저장합니다.
   2. 모자이크 영상의 경우, 모자이크의 원점을 찾은 영상 좌표를 설정할
      1. 구조의 왼쪽 상단 모서리에 위치를 찾은 것은 캡처 할 수 있습니다.
      2. 스테이지 컨트롤러의 "제로"버튼을 눌러 스테이지의 제로 X, Y 및 Z 좌표.
      3. "로드"버튼을 클릭하고 목록을 선택하여 모자이크 좌표의 해당 목록을로드합니다.
         주 : 볼 500 ㎛의 영역의 20 % 오버랩을 갖는 2 × 2의 모자이크에 대한 예시적인리스트가 될 것이다 : Pos.1 = (0,0), 순위. 2 = (400,0), 순위. 3 = (0400), 순위. 4 = (400400).
5. 주사기 w를 제거꼬리 정맥 카테터 PBS i 번째 덱스 트란을 포함하는 주사기로 교체한다.
6. 천천히 라인을 플러시 멸균 PBS의 50 μl를 주입 다음에 20 mg의 꼬리 정맥 카테터를 통해 마우스로 PBS에 용해 / ㎖ 155 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 100 ㎕까지 주입. 라인에 모든 거품을 소개하지 마십시오. 마우스에게 투여 전량을 4 ㎖ / ㎏ / 인사를 초과하지 않도록, 필요에 덱스 트란을 암세포 주입 후, 1 시간 주입.
7. 영상 매개 변수를 설정합니다.
   1. 광자 모드로 현미경을 전환합니다.
   2. 타이밍 신호 버튼을 클릭하여 줌 배율 필드를 업데이트하여 2 배의 배 줌을 설정합니다.
   3. 레이저 파워를 조정에 ~ 10 % (~ 샘플에서 10 ~ 15 MW) (10)에 지진 해일 전원 슬라이더를 조정 한 후 검출기 및 레이저 버튼을 클릭하여.
8. 이미지 각 위치는 종양 세포의 존재를 확인하고 vascu의 흐름과 무결성을 시각화lature.
   참고 : 선박이 완전히 흐르는 적혈구와 관류 나타납니다해야하며, 형광 덱스 트란이 혈관 외 공간에 누출하지 않고 용기 내에 포함되어야한다. 약 10-20 종양 세포는 진공 창 투명 개구 내에있을 것으로 예상된다.
9. 각 위치의 시작 농도를 조정하는 촬상한다.
   1. 각각의 위치는, 이미지에 대한 종양 세포의 정상 슬라이스 스테이지 제어부에 초점 노브의 회전에 의해 Z 방향 위치를 조정한다.
   2. 시야의 중심에있는 셀을 배치.
   3. 는 멀티 버튼을 클릭하여 선택하고 지점 목록에서 셀의 저장 위치를 ​​대체하기 위해 삭제 버튼 다음 추가를 클릭하여보기의 필드의 위치를 ​​클릭합니다.
   4. 시각 각 위치에서의 종양 세포의 상대적인 밝기를 관찰한다.
10. 다 지점 패널에서 저장 버튼을 클릭하여 각 셀의 새 위치를 저장파일 이름을 지정 거라고.
11. 개별 종양 세포의 이미징의 경우, 약 동등한 밝기의 3 개의 셀을 선택하고 삭제 버튼을 클릭 한 다음 목록에서 자신의 위치를 ​​클릭하여 다중 목록에서 다른 모든 위치를 삭제합니다.
12. 감지기 및 레이저 버튼을 클릭하고 신호가 포화 미만이라는 녹색과 적색 채널 ⁴⁵ 그렇게의 PMT의 이익을 위해 슬라이더를 조정합니다.
13. 대 식세포는 시안 표시 그래서 파랑 채널 ^(45)의 슬라이더를 조정합니다.
    주 : 모든 두 번째 고조파 신호 만 청색 채널에 나타나고 채널 감산 절차에 따라 시안 식세포로부터 분리 될 수있는 이전 ^{(45)을 설명했다.}
14. 0 μm의에 Z-스택 시작 깊이와 각각 위치로 Z 스테이지를 이동하고 시작을 클릭하고 종료 버튼을 24 μm의 최종 깊이를 설정합니다.
    참고 :이 깊이 내에서 세포는 가장 좋은 신호로 가시화 될 것이다소음 및 해상도.
15. 3 μm의는 z 스텝 크기를 설정합니다.
16. 다음 파라미터 촬상 파라미터는 이전에 ^{설명 45,49} 설정한다.
    1. 개별 종양 세포의 이미징의 경우, 타이밍 신호 버튼을 클릭 한 다음 (1.5 배의 줌 배율에 해당) 줌 배율 필드, 프레임 평균 필드에 3 입력 시간 경과 버튼을 클릭하고 10을 입력으로 4 V를 입력 시간 경과 필드에.
       참고 :이 설정은 1 프레임마다 3 초를 취득합니다.
    2. 모자이크 영상의 경우, 타이밍 신호 버튼을 클릭하고 (4 배의 줌 배율에 상당) 1.5 V의 줌 배율을 입력 프레임 평균의 수에 3을 입력하고 시간 경과 버튼을 클릭하고 시간 -에 10를 입력 시간 지연 필드 경과.
       참고 :이 설정은 1 프레임마다 3 초를 취득합니다.
17. 해당 버튼을 클릭하여 멀티, Z-스택 t 경과 영상 모드를 활성화합니다.
18. 이미지를 수집 할 수있는 녹음 버튼을 누릅니다.
    아니E : 폐 조직이 매우 섬세하고 사진 손상에 영향을 받기 쉽다. 다른 필드의 시간 경과 이미징 혈액 흐름이 이미지화 된 필드에 정지 된 후, 레이저가 가장 가능성이있는 경우 너무 높은 이후의 영상은 낮은 전력에서 수행해야합니다.
19. 매 30-45 분 천천히 동물의 수화를 유지하기 위해 PBS 또는 식염수 50 ㎕를 주입.

6. 안락사

1. 5 %로 이소 플루 란을 늘립니다.
2. 그것은 호흡과 무대에서 동물을 제거하기 위해 중단 후 30 초까지 5 % 이소 플루 란에서 동물을 유지합니다.
3. 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위를 수행합니다.

7. 이미지 분석

1. 단일 세포 이미징 실험 :
   1. 피지에 이미지를로드하고 Hyperstack로 포맷합니다.
   2. Hyperstack 각 Z 슬라이스의 경우, 시간 경과 동영상을 재생 및 잔류 XY 운동을 찾습니다. 잔류 XY 운동이 발견되는 경우에 스택 ^{(36)이라고} StackReg 플러그인 적용움직임을 제거한다.
2. 모자이크 영상 실험의 경우 :
3. 피지로 이미지를로드 및 디렉토리, 파일베이스 명, 모자이크 x 및 y 필드의 수와 개수와 화상에 관한 모자이크 스티칭 매크로 (기업 코드 파일 모자이크 스티치) 및 입력 정보를 열어 그것들을 함께 스티치 조각의 시점.
   참고 : 자바 디렉토리를 해석하는 방법으로 인해, 폴더 이름은 하위 폴더 구분 기호로 두 개의 백 슬래시가 있어야합니다. 내장 된 플러그인 인접 쌍 바느질의 제한으로 인해, 기본 파일 이름은 대시를 포함 할 수 없습니다.
4. 혈관의 경계를 명확하게보기를 얻기 위해, 하나의 화상으로 통합 혈액 채널의 시점을 모두 평균 한 후, 다른 채널의 동영상의 각 프레임의 배경이 이미지를 복제.
   참고 :이 단순히 혈액 평균화를 수행 매크로를 실행하면됩니다 (기업 코드 파일이 혈액 평균화를 수행합니다).

결과

이 방법으로 얻을 수있는 결과의 유형을 설명하기 위해, 수술 전에 시점 변화에 MacBlue 마우스 ^(44)의 꼬리 정맥에 형광 단백질 클로버 표지 E0771-LG 종양 세포 주입. 수술 후, 155 가와사끼 로다 민 표지 된 덱스 트란은 혈관과 시간 경과 영상이 수행 된 표시하는 IV를 주입 하였다.

쥐 24 시간 후 분사를 이미징 할 때, 하나?...

토론

단백질 및 항체로 형광 표지 기능 태그와 함께 생체 광학 영상에서 높은 해상도는 전이성 캐스케이드에 대한 우리의 이해를 증가 극적으로했다. 이는 직접적인 시각화 및 단일 셀 및 종양 세포의 서브 세포 매개 숙주 세포 및 미세 정량화있게되었다. 기본 종양 내에서이 영상은 성장 침입 또는 보급 ^6,7 중 하나의지지 이산 미세 환경의 발견, 예를 들어, 주도하고있다. 침략의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter	Kent Scientific		Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A