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Résumé

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Résumé

Métastase vers des sites secondaires , tels que le poumon, le foie et l' os est un événement traumatique avec un taux d'environ 1 à 90% de mortalité. Parmi ces sites, le poumon est le plus difficile à évaluer en utilisant l'imagerie optique intravitale en raison de sa position fermée dans le corps, la nature délicate et rôle vital dans le maintien de la physiologie appropriée. Bien que les modalités cliniques (tomographie par émission de positons (TEP), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et de tomodensitométrie (CT)) sont capables de fournir des images non invasives de ce tissu, ils manquent de la résolution nécessaire pour visualiser les premiers événements d'ensemencement, avec un seul pixel constitué de près d'un millier de cellules. Les modèles actuels de poumon métastatique ensemencement postulat que les événements juste après l'arrivée d'une cellule tumorale déterministes pour la survie et la croissance ultérieure. Cela signifie que en temps réel des outils d'imagerie intravitale avec une résolution à une seule cellule 2 sont nécessaires pour définir les phénotypes de l'ensemencement cells et de tester ces modèles. Alors que l' imagerie optique à haute résolution du poumon a été réalisée en utilisant divers ex vivo des préparations, ces expériences sont généralement seule fois-point des tests et sont sensibles à des artefacts et des conclusions erronées possibles en raison de l'environnement considérablement modifié (température, profusion, cytokines, etc. ) résultant de la suppression de la cavité thoracique et le système circulatoire 3. Des travaux récents ont montré que l' imagerie optique intravitale time-lapse du poumon intact est possible en utilisant un vide stabilisé fenêtre d'imagerie 2,4,5 cependant, les temps typiques d'imagerie ont été limités à environ 6 heures. Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une imagerie intravitale time-lapse à long terme du poumon en utilisant une telle fenêtre sur une période de 12 heures. Les time-lapse séquences d'images obtenues à l'aide de cette méthode permettent la visualisation et la quantification des interactions entre les cellules, la dynamique des membranes et de la perfusion vasculaire dans les poumons. Nous avons en outre dEscribe une technique de traitement d'image qui donne une vue sans précédent claire de la microvascularisation pulmonaire.

Introduction

L'imagerie haute résolution optique intravitale est avérée être essentielle à la compréhension de nombreux processus biologiques, ce qui permet une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaires qui doivent être mesurés et quantifiés. Dans la recherche sur le cancer, l' imagerie intravitale de cellules tumorales et stromales a conduit à la découverte de nombreuses interactions microenvironnementales 6-11 qui ne sont présents que chez l'animal intact.

Les découvertes sur microenvironnements associés à intravasation et la diffusion des cellules tumorales dans le cancer du sein par imagerie optique à résolution cellulaire unique in vivo a même conduit à de nouveaux marqueurs pour le pronostic et la réponse au traitement chez les patients atteints de cancer du sein 12-16. Les meilleures technologies d'imagerie disponibles pour la visualisation profondément dans les organes vitaux internes intacts sont les modalités cliniques (IRM, PET, CT) qui offrent d'excellentes vues de l'organe entier et peut révéler des pathologies avant même qu'ils produisent des symptômes cliniques. Ils sont incapables, houtefois, pour révéler les premiers stades de la métastase et les mécanismes cellulaires de conduite progression de la tumeur en raison de leur manque de résolution de la cellule unique. Au moment où les métastases pulmonaires sont visibles dans ces modalités, elles sont bien établies et la prolifération. Compte tenu de l'estimation selon laquelle 90% des cellules disséminées tumorales qui arrivent dans le poumon soit ne survivent pas à 17 ou initialement restent dormantes 18, et l'observation selon laquelle ils arrivent beaucoup plus tôt que prévu 19, imager les premières étapes de l' arrivée et la survie devient crucial de comprendre le processus d'ensemencement métastatique et la récurrence de la croissance tumorale sur des sites distants.

L'exécution de ces observations dans le poumon a prouvé cependant extrêmement difficile; la grande majorité des études d'imagerie ont utilisé ex vivo ou explants préparations 20-23, qui ne donnent une vue dans le poumon à des moments uniques. Bien que ces préparations fournissent des informations utilesrmation, ils ne donnent pas une compréhension complète des interactions, des relations de cause à effet, et la dynamique qui se produisent entre les diverses composantes du microenvironnement. L'absence d'un système adéquat circulatoire (et le déséquilibre concomitant de l' homéostasie) et la déconnexion du reste du système immunitaire de l'organisme, il est désireux de valider les conclusions que ces préparations génèrent dans le tissu intact in vivo.

De nombreux groupes ont effectué l' imagerie intravitale du poumon intact 2,4,5,24-33 avec Wearn et l' allemand étant le premier à chirurgicalement exposer la couche pleural 24 et Terry le premier à utiliser une fenêtre d'imagerie implantable 25.

imagerie à haute résolution dans le poumon est fortement entravée par le mouvement constant du poumon et plusieurs techniques ont été développées pour surmonter cette limitation. Wagner et Filley 27 ont étudié le mouvement naturel du poumon canineet conçu leur protocole chirurgical pour localiser leur fenêtre implantée sur une région relativement stationnaire tandis que Wagner a utilisé le vide dans sa fenêtre préparation chirurgicale pour immobiliser le tissu 28. Depuis ce temps, une variété de techniques ont été utilisées pour l' image du poumon , y compris: serrage des bronches, l' apnée séquentielle et imagerie fermée, acquisition suréchantillonné, collage du lobe du poumon et de vide 34. Chacun d'eux a ses avantages et ses inconvénients et pas une technique est apparue comme supérieur à un autre 34. Par exemple, la bronche de serrage et de l'apnée séquentielle modifie l'échange normal de gaz dans les poumons et peuvent provoquer une atélectasie. imagerie Gated et l'acquisition suréchantillonné ne souffrent pas de ces inconvénients, mais exigent à grande vitesse ou des équipements spécialisés d'imagerie pas largement accessible. Enfin, tant encollage du poumon et de la technique du vide éviter les deux inconvénients mentionnés ci-dessus, mais peuvent présenter des lésions induites par la force de cisaillement si les soins ne sont pas taken. Au cours des dernières années, la fenêtre de vide a été miniaturisé et adapté pour une utilisation dans des souris en utilisant confocale et multiphotonique microscopie 4,5,33 et une excellente imagerie à haute résolution a été atteint 2. Le tableau 1 résume cette riche histoire et met en évidence ces documents qui décrivent roman les progrès dans l'utilisation de fenêtres d'imagerie intravitale du poumon.

Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotonique intravitale microscopie à l'image des métastases dans le, du poumon intact en direct avec la résolution subcellulaire le plus élevé possible. Les images sont acquises pour un maximum de 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé d'une ouverture numérique objectif élevé et tube photomultiplicateur multiple (PMT) détecteurs. des modèles de souris transgéniques sont utilisés pour l'étiquette fluorescente macrophages natifs avec fluorescent dextran de poids moléculaire élevé et des cellules tumorales de protéines fluorescentes transfectées (pour marquer les cellules tumorales du système vasculaire et respectively). Bien que ce choix de cellules marquées par fluorescence permet la visualisation des interactions cellulaires-macrophage cellules endothéliales tumorales et la dynamique, ce protocole va travailler pour toute souche de souris fluorescent ou non fluorescent. Après l' acquisition, le mouvement de dérive résiduelle ( le cas échéant) est éliminé en utilisant un plug - in Fiji 35,36 et macros personnalisées moyenne temporelle du canal vasculaire pour éliminer le clignotement provoquée par des cellules non marquées du sang circulant.

Bien que ce protocole met l'accent sur l'imagerie des métastases, les techniques sont applicables à de nombreux autres processus biologiques observables avec imagerie à haute résolution à cellule unique dans le poumon.

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Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Génération de souris marquées par fluorescence des modèles et des cellules tumorales

  1. Préparer 100 ml (p / v) de sérum-albumine bovine / tampon du tampon phosphate salin (PBS / BSA) à 0,1% en mélangeant 0,1 g de BSA avec 100 ml de PBS.
  2. Préparer les cellules tumorales marquées par fluorescence par transfection stable.
    REMARQUE: On utilise ici les cellules E0771-LG, un dérivé hautement métastatique des cellules de souris E0771 adénocarcinome mammaire 37 qui ont été isolées à partir de tumeurs métastatiques développées dans le poumon de souris C57BL / 6 par voie intraveineuse une injection de cellules parentales 38 E0771.
    1. 24 heures avant la transfection, plaque 1 x 10 5 cellules EO771-LG sur une boîte de culture de tissu de 60 mm sur 2 ml de antibiogratuitement 10% de FBS (sérum fœtal bovin) DMEM tic (milieu de Eagle modifié par Dulbecco) et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
    2. Au moment de la transfection, laisser incuber 2 ug du vecteur de la protéine fluorescente avec 10 pi de réactif de transfection pendant 30 minutes avant d'ajouter 190 ul de milieu de sérum réduit.
    3. Laver les cellules EO771-LG avec phosphate solution saline tamponnée de Dulbecco (D-PBS) une fois et ajouter doucement le mélange de transfection.
    4. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 6 h.
    5. Laver les cellules transfectées et la culture dans 2 ml de DMEM complet (10% de FBS, du pyruvate 1 mM, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine) pendant 2 jours.
    6. Laver les cellules avec 2 ml de PBS stérile, ajouter 500 ul de 0,25% de trypsine-EDTA et on incube pendant 2 min à 37 ° C.
    7. Collecter suspension cellulaire et mélanger avec au moins 1 volume de DMEM complet et centrifuger à 280 x g.
    8. Resuspendre les cellules dans 1 ml de DMEM complet et développer la culture de cellules enune boîte de 10 cm pour culture de tissus.
    9. Démarrer la sélection des cellules transfectées par l'addition de 700 ug / ml d'antibiotique G418 sélectif à 8 ml de DMEM complet et la culture pendant une semaine, en changeant milieu tous les trois jours.
  3. Enrichir la population fluorescente à partir de cellules transfectées qui ont été sous sélection dans G418 par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 39,40.
    1. Laver les cellules avec 5 ml de PBS et on ajoute 1,5 ml de trypsine à 0,25%.
    2. Incuber pendant 2 min à 37 ° C et on mélange avec au moins un volume de DMEM complet.
    3. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 280 x g et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de solution stérile à 0,1% (p / v) de tampon PBS / BSA.
    4. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 40 pm et ajuster le volume à 1 ml avec du tampon 0,1% de BSA / PBS pendant le tri.
    5. FACS-trier la plus brillante population de 10% sur la base spectre de fluorescence en utilisant le trieur FACS 41.
    6. Culture des cellules triées pour une autre semaine usélection de nder (700 pg / ml de G418 dans DMEM complet).
    7. Resélectionnez cellules marquées par fluorescence par cytométrie en répétant les étapes 1.3.1 à 1.3.6 une fois de plus.
    8. Après un deuxième cycle de sélection, trypsiniser, filtrer et remettre en suspension les cellules dans 0,1% de BSA / PBS (comme décrit étapes 1.3.1-1.3.4). Ajuster la concentration de 2 x 10 6 cellules / ml pour le tri monocellulaire dans des plaques à 96 puits en utilisant le trieur FACS.
    9. Préparer 3-5 plaques à 96 puits avec 100 ul de DMEM complet pour la collecte. Pour améliorer la survie après le tri, ajouter 100 ul de milieu de culture filtré plats où les cellules EO771-LG ont été cultivées 42.
    10. Après le tri des cellules dans des plaques à 96 puits, le retour à la culture des cellules pendant 2 jours (37 ° C, 5% CO 2).
    11. Identifier les puits avec des clones individuels viables par l'examen au microscope inversé à grossissement 5x.
    12. Trypsiniser et développer des clones viables et congeler les cellules pour la sauvegarde.
      1. Laver les puits avec gren raison des clones avec 100 ul de PBS stérile. Ajouter 50 pi de 0,25% p / v de trypsine et incuber pendant 2 min à 37 ° C. Ajouter 50 ul de DMEM complet et transfert à plaque de 96 puits à fond à fond en V ou rond stérile pour centrifuger à 280 g pendant 5 min.
      2. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 700 pg / ml de G418 DMEM complet et la plaque de chaque clone dans des plaques à 12 puits. Ajouter 400 ul de DMEM complet avec G418 et de la culture jusqu'à la confluence.
      3. Laver les puits avec 500 ul de PBS, ajouter 100 pi de trypsine à 0,25% et incuber pendant 2 min à 37 ° C. Ajouter 100 pi de DMEM complet et centrifuger pendant 5 min à 280 x g. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de DMEM complet avec G418 et de la plaque dans des plaques à 6 puits jusqu'à confluence.
      4. Une fois confluentes, Trypsiniser cellules, tournent vers le bas et remettre en suspension dans 10% de DMSO dans FBS à geler les stocks de cellules.
      5. Maintenir 10/01 des suspensions cellulaires en culture en les plaquant à 100 mm des plaques de culture tissulaire pour une évaluation de leur potentiel métastatique.
  4. Testez le potentiel métastatique des clones sélectionnés.
    1. Trypsiniser et remettre en suspension les cellules dans du sérum physiologique à une concentration de 2,5 x 10 6 cellules / ml et 200 pi injectent dans C57BL / 6 par voie intraveineuse à travers la veine caudale.
    2. Au bout de 2 semaines, de recueillir le tissu pulmonaire comme décrit précédemment 23 et de quantifier la charge tumorale par comptage de surface ou procédé stéréologique 43. Sélectionnez clones avec un potentiel métastatique élevé pour l'imagerie intravitale.
  5. Soulever MacBlue (un promoteur spécifique myéloïde conduite cyan protéine fluorescente (PCP) expression (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) des souris rapporteurs 44.
    NOTE: En règle générale, les souris entre 8 et 12 semaines sont utilisées, mais les souris aussi tôt que 7 et au plus tard jusqu'à 20 semaines ont été testés pour fonctionner aussi bien.

2. multiphotonique Microscope Set et imagerie Préparation

NOTE: Bien que ce protocole peut être effectué sur tout multiphoton microscope, le système utilisé pour acquérir les données présentées dans ce protocole a été décrit précédemment en détail 45.

  1. Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs au moins une heure avant l'heure d'imagerie souhaitée.
  2. Juste avant la chirurgie, de mesurer la puissance de l'entrée de la lumière au microscope en plaçant la tête de l'appareil de mesure de puissance optique dans la trajectoire du faisceau juste avant le microscope et régler les boutons de miroir laser à cavité d'extrémité jusqu'à ce que l'intensité lumineuse maximale à 880 nm est lue sur l'appareil de mesure de puissance optique.

3. Système à vide Configurer

  1. Collez la lamelle dans la fenêtre d'imagerie (Figure 1 supplémentaire) avec cyanoacrylate. Prévoyez au moins 4 heures pour que la colle sécher complètement.
    REMARQUE: Cette étape peut également être fait à l'avance.
  2. Couper la pointe de pipette 100 pi à la première ligne de la petite ouverture et connectez l'extrémité non coupée à la mince vacuum tuyau.
  3. Connectez le système à vide selon la figure 1 et supplémentaire Figure 2.
  4. Avec le vide sur l'extrémité ouverte et bloquée, régler le régulateur de vide pour <3 poHg.
    REMARQUE: L' ajustement final du niveau de vide sera effectuée par l' observation du système vasculaire in vivo.
  5. Appliquer une fine couche de graisse de pétrole sur la face inférieure de la plaque d'imagerie pour empêcher le moyen lentille à immersion objectif d'être évacuée par la plaque d'imagerie.
  6. Placer la plaque d'imagerie sur la platine du microscope.
    NOTE: La plaque d'imagerie personnalisée (Figure supplémentaire 3) est une feuille de 1/8 "aluminium épais usiné à la fois pour tenir dans l'espace d'insertion de la scène et avec un trou de passage dans le centre de maintien de la fenêtre d'imagerie.
  7. Insérer la fenêtre vide dans la plaque d'imagerie avec la lamelle vers le bas.
  8. Stériliser toutes les surfaces et instruments, y compris plaque de stade de l'imagerie et l'imagerie gagnantdow avec 70% d'éthanol.
  9. Connectez l'extrémité de la pointe de la pipette à la fenêtre de vide de coupe et la bande du tuyau vers le bas sur la plaque d'imagerie.
  10. Apportez l'objectif près de la fenêtre d'imagerie et de placer une grosse goutte d'eau entre l'objectif et la lamelle.
  11. Veiller à ce qu'il n'y ait pas de fuites de la lamelle en bloquant l'ouverture centrale de la fenêtre de vide et de vérifier que la goutte d'eau entre l'objectif et la lamelle ne soit pas aspiré.
    NOTE: Une vieille boule de souris d'ordinateur de style placé sur la fenêtre est utile pour bloquer l'ouverture centrale.

4. Surgery

  1. Préparer la zone chirurgicale stérile.
    1. Placez tous les instruments à portée de main. Stériliser toutes les surfaces et les instruments, y compris la zone chirurgicale, et les outils chirurgicaux avec 70% d'éthanol.
  2. Attachez une longueur de 3 pouces de 2-0 suture au cathéter, ¼ pouce au-dessus de la douille avec un double noeud.
  3. Préparer la queue fol veine de cathéterLowing le protocole publié par Harney et al. 46.
  4. L'utilisation d'un infrarouge (IR) lampe chauffante, chauffer l'animal dans sa cage pendant environ 5 min pour augmenter le débit sanguin dans la veine caudale et pour aider à l'insertion du cathéter. Il est recommandé de garder l'animal chauffé à des températures physiologiques tout au long de la procédure chirurgicale en utilisant soit une lampe chauffante ou un coussin chauffant.
  5. Anesthésier l'animal avec 5% d'isoflurane et de vérifier qu'il n'y a pas de réponse à un pincement de l'orteil.
  6. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de l'animal.
  7. Appliquez une lotion dépilatoire pour 10-30 sec pour enlever les poils du côté gauche de l'animal; à partir de la ligne médiane de la poitrine à un quart du dos et de la région axillaire juste sous la cage thoracique.
  8. Nettoyer tout excès de lotion et stériliser la peau exposée avec 70% d'alcool.
  9. Fixer une seringue stérile remplie de PBS à la veine cathéter de queue et insérer et bande en place suivant le protocole publié par Harney et al. 46. Assurez-vous que le ruban est bien collé à l'aiguille elle-même et ne sont pas libres dans l'intervalle entre la queue et la bande.
  10. Intuber la souris suivant soit le protocole publié par Das et al. 47 ou par DuPage et al. 48
  11. Allumez le ventilateur et le mettre à fournir 135 respirations par minute et 200 pi de mélange isoflurane-oxygène.
  12. Connecter le cathéter trachéal au ventilateur.
  13. Déplacez la souris vers la zone chirurgicale. Prenez soin de ne pas déloger le cathéter.
  14. Attachez le 2-0 suture autour du museau de la souris sous la dents de devant.
  15. Tape le cathéter pour le museau.
  16. Tape le forelimb gauche au cathéter pour le garder hors du champ opératoire.
  17. Abaisser l'anesthésie isoflurane à un niveau de 2,5% de l'entretien et vérifiez qu'il n'y a pas de réponse à un pincement de l'orteil.
  18. À l' aide des ciseaux pointus, retirer 1 cm 2 de peau au- dessus de la paroi thoracique gauche.
  19. Ascenseur til mammaires pad graisse et cautériser des vaisseaux sanguins exposés avec la plume de cautérisation.
  20. Réséquer le coussinet adipeux en coupant avec les ciseaux pointus.
  21. Retirer la couche musculaire vers la cage thoracique en découpant avec des ciseaux tranchants. Prenez soin de ne pas couper la veine axillaire en cours d'exécution à la base de la patte antérieure.
  22. Utilisez une pince pour saisir et soulever le 6 ème côte. À l'aide des ciseaux pointus tenue à un angle faible (~ 5 °) couper la nervure près du bord de l'ouverture dans la peau. Prenez soin de ne pas toucher le tissu pulmonaire exposée.
  23. Élargir l'ouverture dans la paroi thoracique afin d'exposer le lobe pulmonaire entier en retirant quatre nervures consécutives.
    Remarque: Gardez l'ouverture d'au moins 5 mm du sternum pour éviter le cœur.
  24. Soulevez délicatement la souris en saisissant la queue et trachéale cathéter et déplacer la souris à l'étape d'imagerie du microscope.
  25. Avec l'arrêt de vide, remplir la chambre de la fenêtre sous vide avec du PBS.
  26. Inversez la souris et positionnez le exposéspoumon sur la fenêtre d'imagerie sous vide.
  27. Tournez lentement le vide à environ 3-5 pouces de mercure en utilisant la vanne à boisseau sphérique.
  28. Placez un harnais de retenue en papier tissu plié en deux à deux reprises sur la poitrine de la souris et du ruban adhésif à la plaque de platine comme le montre la figure 2 supplémentaire.
  29. Fixez le capteur de la cuisse de l'oxymètre de pouls à la cuisse de l'animal et démarrer le logiciel.
  30. Placez la chambre de l'environnement sur la scène et allumer la chaleur pour maintenir la souris à une température physiologique.
  31. Réduire le niveau de l'isoflurane à 1 à 1,5% pour maintenir l'anesthésie et de maintenir le flux sanguin.

5. Imagerie intravitale

  1. Porter le 25 x 0,95 ouverture numérique (NA) objectif à proximité de la lamelle et ajouter une grosse goutte d'eau entre eux.
  2. Utilisation du mode épifluorescence, voir le canal FITC et amener le tissu pulmonaire dans le foyer.
  3. Dans le cas contraire effectuée avant l'intervention chirurgicale, iles cellules tumorales nject à travers le cathéter dans la veine caudale.
    1. Déconnecter la seringue PBS du cathéter dans la veine caudale.
    2. Charger une seringue stérile avec 100 ul de suspension de cellules tumorales (2 x 10 7 cellules / ml dans du PBS au maximum).
      Remarque: Cette étape peut être effectuée à l'avance pour étudier les cellules du cancer du poumon à l'arrivée à différents points de temps.
    3. Connecter la seringue avec des cellules tumorales sur le cathéter dans la veine caudale.
    4. Injecter lentement les cellules tumorales dans la veine de la queue.
    5. Déconnecter la seringue avec les cellules tumorales du cathéter dans la veine caudale.
    6. Rebranchez la seringue PBS au cathéter veine de la queue.
      REMARQUE: identifier les emplacements de toutes les cellules tumorales avant d'injecter le dextrane car il devient difficile de distinguer les cellules tumorales à partir du signal de dextran par l'oculaire après l'injection.
  4. Repérez les cellules tumorales à l'image
    1. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, localiser toutes les cellules tumorales et enregistrer leurs emplacements avec ee multipoint panneau du logiciel.
      1. Localiser tous les champs de vision de l'image en observant les cellules tumorales dans l'oculaire du microscope.
      2. Dans le logiciel, passez à l'écran multipoint en cliquant sur le bouton Multi-Point et de stocker l'emplacement de la cellule en cliquant sur le bouton Ajouter Position.
    2. Pour l'imagerie mosaïque, localiser l'origine de la mosaïque et définir les coordonnées d'imagerie
      1. Localiser une position dans le coin supérieur gauche de la structure à capturer.
      2. Zéro coordonnées x, y et z de la scène en appuyant sur le bouton "Zero" sur le contrôleur de scène.
      3. Chargez la liste appropriée des coordonnées mosaïque en cliquant sur le bouton "Charger" et en sélectionnant la liste.
        REMARQUE: une liste d'exemples de 2 x 2 mosaïque avec un chevauchement d'un champ de vision de 500 um 20% serait: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
  5. Retirez la seringue with PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant le dextran.
  6. Injecter lentement jusqu'à 100 ul de 20 mg / ml de rhodamine 155 kDa dextrane dissous dans du PBS dans la souris via le cathéter dans la veine caudale, suivie par l'injection de 50 ul de PBS stérile pour rincer la ligne. Ne pas introduire de bulles dans la ligne. Le cas échéant, l'injection de dextrane au moins une heure après l'injection des cellules cancéreuses de sorte que le volume total administré à la souris, ne dépasse pas 4 ml / kg / h.
  7. Mettre en place des paramètres d'imagerie.
    1. Mettez le microscope en mode multiphotonique.
    2. Réglez le zoom sur un facteur de 2X en cliquant sur le bouton des signaux de synchronisation et de mise à jour du champ Facteur Zoom.
    3. Réglez la puissance du laser à ~ 10% (~ 10-15 mW à l'échantillon) en cliquant sur le bouton Détecteurs et laser, puis en ajustant le curseur Tsunami Puissance à 10.
  8. Chaque emplacement d'image pour vérifier la présence de cellules tumorales et de visualiser l'écoulement et l'intégrité du Vasculateur.
    NOTE: Les navires doivent apparaître complètement perfusé avec des érythrocytes fluides et dextran fluorescent doivent être contenues dans les vaisseaux sans fuite vers les espaces extravasculaires. Environ 10 - 20 cellules tumorales sont censés se situer dans l'ouverture libre de la fenêtre à vide.
  9. Régler la profondeur de départ de chaque emplacement à imager.
    1. Pour chaque emplacement, régler la position z en tournant le bouton de mise au point sur le contrôleur de la scène à l'image de la tranche supérieure de la cellule tumorale.
    2. Placer la cellule dans le centre du champ de vision.
    3. Cliquez sur le bouton Multipoint, cliquez sur la position du champ de vision pour le mettre en surbrillance et cliquez sur Ajouter puis sur le bouton Supprimer pour remplacer la position mémorisée de la cellule dans la liste multipoint.
    4. Observer visuellement la luminosité relative de la cellule tumorale, dans chaque position.
  10. Enregistrer les nouveaux emplacements de chacune des cellules en cliquant sur le bouton Enregistrer dans le panneau un MultipointD spécifier un nom de fichier.
  11. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, choisir trois cellules de luminosité à peu près équivalente et supprimer tous les autres emplacements de la liste multipoint en cliquant sur leur emplacement dans la liste, puis en cliquant sur le bouton Supprimer.
  12. Cliquez sur le bouton Détecteurs et laser et ajuster les curseurs pour le gain du PMT des canaux vert et rouge 45 de sorte que les signaux sont en dessous de la saturation.
  13. Réglez le curseur pour le canal bleu 45 de sorte que les macrophages apparaissent cyan.
    NOTE: Tout signal de second harmonique apparaît seulement dans le canal bleu et peut être séparé des macrophages cyan en suivant la procédure canal de soustraction décrite précédemment 45.
  14. Réglez le début profondeur z-stack à 0 pm et la profondeur de fin à 24 um en déplaçant la phase de z à l'emplacement et en cliquant sur Démarrer et boutons de fin respectivement.
    NOTE: Les cellules au sein de cette profondeur sera visualisée avec le meilleur signal àle bruit et la résolution.
  15. Définissez la taille z étape à 3 pm.
  16. Réglez les paramètres d'imagerie suivants paramètres précédemment décrits 45,49.
    1. Pour l'imagerie des cellules tumorales individuelles, cliquez sur le bouton des signaux de synchronisation, puis entrez 4 V dans le champ de facteur de zoom (équivalent à un facteur de zoom de 1,5x), entrez 3 dans le domaine des moyennes de cadre et cliquez sur le bouton Time-Lapse et entrez 10 dans le champ Time-lapse.
      REMARQUE: Ces paramètres vont acquérir 1 image toutes les 3 secondes.
    2. Pour l'imagerie mosaïque, cliquez sur le bouton des signaux de synchronisation et entrez un facteur de zoom de 1,5 V (équivalent à un facteur de zoom de 4X), entrez 3 dans le nombre de moyennes de cadre et cliquez sur le bouton Time-Lapse et entrez 10 dans la Time- lapse champ de temporisation.
      REMARQUE: Ces paramètres vont acquérir 1 image toutes les 3 secondes.
  17. Activer le multipoint, z-stack et modes d'imagerie t-lapse en cliquant sur leurs boutons.
  18. Appuyez sur le bouton d'enregistrement pour acquérir des images.
    NE PASE: Le tissu pulmonaire est très délicate et sensible à la photo-dommages. Si après le temps du flux sanguin d'imagerie lapse arrête dans le champ imagé, le laser est le plus susceptible d'imagerie trop élevé et ultérieur d'autres champs doit être fait au plus faible puissance.
  19. Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l'hydratation de l'animal.

6. euthanasie

  1. Augmenter le isoflurane à 5%.
  2. Gardez l'animal de moins de 5% d'isoflurane jusqu'au 30 sec après qu'il cesse de respirer et enlever l'animal de la scène.
  3. Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.

7. Analyse de l'image

  1. Pour les expériences d'imagerie cellulaire simples:
    1. Charger des images dans les Fidji et les formater comme un HyperStack.
    2. Pour chaque z-tranche dans le HyperStack, lire le film laps de temps et de regarder pour le mouvement xy résiduel. Si le mouvement xy résiduel est trouvé, appliquer le plugin appelé StackReg 36 à la pileéliminer le mouvement.
  2. Pour les expériences d'imagerie en mosaïque:
  3. Charger des images dans les Fidji et les assembler en ouvrant la mosaïque Stitching macro (fichier supplémentaire de code mosaïque Broder) et la saisie des informations sur les images telles que le répertoire, le nom de base de fichier, le nombre de champs x et y dans la mosaïque et le nombre des tranches et des points de temps.
    NOTE: En raison de la façon dont Java interprète les répertoires, les noms de dossier doit avoir deux barres obliques comme séparateurs de sous-dossiers. En raison de limitations dans le plug-in intégré Paires Brochage, les noms de fichiers de base ne doivent pas contenir de tirets.
  4. Pour obtenir une vue claire des limites de la vascularisation, en moyenne ensemble tous les points de temps pour le canal de sang en une seule image, puis répliquer cette image comme arrière-plan pour chaque image du film des autres canaux.
    NOTE: Cela se fait simplement en exécutant la macro Effectuer étalement du sang (fichier de code supplémentaire Effectuer étalement du sang).

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Résultats

Pour démontrer le type de résultats qui peuvent être obtenus avec cette méthode, nous avons injecté des cellules tumorales E0771-LG étiquetés avec le Clover protéine fluorescente dans la veine de la queue de souris MacBlue 44 à différents points de temps avant la chirurgie. Après la chirurgie, 155 kD rhodamine dextran marqué a été injecté par voie IV pour marquer la vascularisation et imagerie time-lapse a été réalisée.

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Discussion

Haute résolution en imagerie optique in vivo combinée avec des étiquettes fonctionnelles marquées par fluorescence tels que des protéines et des anticorps a augmenté de façon spectaculaire notre compréhension de la cascade métastatique. Elle a permis la visualisation directe et la quantification d'une seule cellule et des paramètres de sous-cellulaire dans les cellules tumorales, des cellules hôtes et leur microenvironnement. Cette imagerie au sein de la tumeur primaire a conduit, par ex...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg VacuumMcMaster Carr4172K12 Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male PipeMcMaster Carr5346K13Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 mlCorning Life Sciences Glass5360-50Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia. Ted Pella, Inc.260368Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in. Exel International26746Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0VWR95056-992String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 ozHendel Corp.LOC1647358Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. LengthMcMaster Carr5155T12Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length McMaster Carr5181K24 Thick Tubing
Depillatory LotionNair-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide NeedleBD305128Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube IDMcMaster Carr5117k51Connectors between tubes
One-Hole Rubber StoppersFisher Scientific14-135FStopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µlDenville Scientific Inc.P1125Pipette Tip
Laboratory tapeFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Opthalmic Ointment
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" LengthRoboz SurgicalRS-5135 Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/BluntRoboz SurgicalRS-5980Blunt Scissors
WipesFisher Scientific06-666-A Harness
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip TipBD309659Syringe
Cyano acrylateStaplesLOC1647358Cover Slip Adhesive
Petroleum JellyFisher Scientific19-086291Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mmHarvard Apparatus734118Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeterKent ScientificPulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033250 ml
OxygenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 InGrainger3CGJ7Vacuum Valve
Small Animal VentilatorHarvard Apparatus683Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J MiceJackson Laboratory026051 
Multiphoton MicroscopeOlympusFluoview FV1000Alternative to custom built scope
Environmental EnclosurePrecision PlasticsChamber for FV1000Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered SalineThermoFisher Scientific14190136
Laser Power MeterCoherentFieldMaxIITOP
Laser Power Meter HeadCoherentPM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein VectorAddgene40259
G418 Sulfate Selective AntibioticThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter Beckman CoulterXDP
Trypsin EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 µm MeshFalcon352235
96 Well PlateCostar3599
60 mm Culture DishCorning430196
10 cm Culture DishCorning353003
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 
Kim WipesFisher Scientific06-666-A 

Références

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