A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Riepilogo

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Abstract

Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% ^1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all'interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l'arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella ² sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l'imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell'ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio ^3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging ^2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l'imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.

Introduzione

Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l'imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali ^6-11 che sono presenti solo in animali intatti.

Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l'imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi e la risposta al trattamento in pazienti con cancro mammario ^12-16. Le migliori tecnologie di imaging disponibili per la visualizzazione in profondità all'interno intatti gli organi vitali interni sono le modalità clinici (risonanza magnetica, PET, CT), che offrono una vista eccellente di tutta organo e possono rivelare patologie ancor prima che essi producono sintomi clinici. Non sono in grado, however, per rivelare le prime fasi di metastasi e dei meccanismi cellulari di guida progressione del tumore a causa della loro mancanza di risoluzione di singola cellula. Per il momento in metastasi polmonari sono visibili in queste modalità, sono ben stabiliti e proliferare. Data la stima che il 90% delle cellule disseminate tumorali che arrivano al polmone o non sopravvivono ¹⁷ o inizialmente rimangono dormienti ^18, e l'osservazione che arrivano molto prima di quanto precedentemente previsto ^19, l'imaging le prime fasi di arrivo e la sopravvivenza diventa cruciale per la comprensione del processo di semina metastatico e la ricorrenza della crescita tumorale in siti distanti.

L'esecuzione di queste osservazioni nel polmone si è dimostrato estremamente difficile tuttavia; la stragrande maggioranza degli studi di imaging hanno utilizzato ex vivo o espianto preparati ^20-23, che solo danno una visione nei polmoni in momenti singoli. Mentre questi preparativi forniscono informazioni utilirmazioni, non danno una comprensione completa delle interazioni, rapporti di causa ed effetto, e dinamiche che si verificano tra i vari componenti del microambiente. La mancanza di un adeguato sistema circolatorio (e squilibrio concomitante di omeostasi) e la disconnessione dal resto del sistema immunitario del corpo rende desideravano convalidare le conclusioni che queste preparazioni generano nel tessuto intatto in vivo.

Molti gruppi hanno eseguito l'imaging intravitale del polmone intatto ^2,4,5,24-33 con Wearn e tedesco essere il primo a chirurgicamente esporre lo strato pleurico ²⁴ e Terry il primo a utilizzare una finestra di imaging impiantabile ^25.

immagini ad alta risoluzione nel polmone è fortemente ostacolata dal movimento costante del polmone e diverse tecniche sono state sviluppate per superare questa limitazione. Wagner e Filley ²⁷ hanno studiato il movimento naturale del polmone caninoe progettato loro protocollo chirurgico per localizzare loro finestra impiantato su una regione relativamente fisso mentre Wagner utilizzata vuoto nella sua finestra preparazione chirurgica per immobilizzare il tessuto ^28. Da quel momento, una varietà di tecniche sono state utilizzate per l'immagine polmone tra cui: bloccaggio bronchi, apnea sequenziale e di imaging gated, acquisizione sovracampionato, incollaggio del lobo polmonare e aspirazione ^34. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi e nessuno tecnica è emerso come superiore ad un altro ^34. Ad esempio, bronchi bloccaggio e apnea sequenziale alterano il normale scambio di gas nei polmoni e possono causare atelettasia. l'imaging Gated e l'acquisizione sovracampionato non soffrono di questi svantaggi, ma richiedono ad alta velocità o di apparecchiature di imaging specializzata non ampiamente accessibile. Infine sia incollaggio del polmone e la tecnica del vuoto evitare entrambi gli inconvenienti sopra citati, ma che possono mostrare lesioni forza indotta taglio se cura non è takit. Negli ultimi anni, la finestra di vuoto è stato miniaturizzato e adattato per l'uso nei topi utilizzando confocale e microscopia multifotonica ^4,5,33 e eccellente imaging ad alta risoluzione è stato raggiunto ^2. La tabella 1 riassume questa ricca storia ed esalta quelle carte che descrivono romanzo avanzamenti nella l'uso di finestre di imaging polmonare intravitale.

Questo protocollo descrive l'uso di prolungato time-lapse multiphoton intravitale microscopia a immagine di metastasi nel vivo, polmone intatto con la massima risoluzione possibile subcellulare. Le immagini sono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multifotone dotato di elevata apertura numerica della lente obiettivo e rivelatori tubo fotomoltiplicatore multipla (PMT). modelli di topi transgenici sono utilizzati per etichetta fluorescente macrofagi native con fluorescente ad alta destrano peso molecolare e proteine ​​transfettate cellule tumorali fluorescenti (per etichettare le cellule tumorali e sistema vascolare respectively). Anche se questa scelta di cellule fluorescente consente la visualizzazione delle interazioni cellula-macrofagi cellule endoteliali tumorali e le dinamiche, questo protocollo funziona per qualsiasi ceppo di topo fluorescenti o non fluorescente. Dopo l'acquisizione, il movimento residuo di deriva (se presente) viene eliminata con un plug-in Fiji ^35,36 e personalizzati macro tempo medio del canale vascolare per eliminare lampeggiante causata da cellule del sangue circolanti senza etichetta.

Mentre questo protocollo concentra sull'imaging metastasi, le tecniche sono applicabili a molti altri processi biologici osservabili con l'imaging cella singola ad alta risoluzione nel polmone.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. Modello mouse e cellule tumorali Generazione fluorescente

1. Preparare 100 ml di 0,1% (w / v) di siero albumina bovina / tampone fosfato (BSA / PBS) mescolando 0,1 g di BSA con 100 ml di PBS.
2. Preparare le cellule tumorali fluorescente mediante trasfezione stabile.
   NOTA: Qui usiamo cellule E0771-LG, un derivato altamente metastatico E0771 topo cellule di adenocarcinoma mammario ³⁷ che sono stati isolati da tumori metastatici sviluppate nel polmone di C57BL / 6 del mouse iniettata per via endovenosa con le cellule E0771 parentali ^38.
   1. 24 ore prima della trasfezione, Piastra 1 x 10 ⁵ cellule EO771-LG su un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri su 2 ml di antibiofree 10% FBS (siero fetale bovino) DMEM tic (Dulbecco Modified Eagle Medium) e incubare a 37 ° C e 5% di CO _2.
   2. Al momento della transfezione, incubare 2 ug del vettore proteina fluorescente con 10 ml di reagente di trasfezione per 30 minuti prima di aggiungere 190 ml di mezzi di siero ridotte.
   3. Lavare EO771-LG cellule con tampone fosfato Dulbecco (D-PBS) una volta e aggiungere al mix trasfezione delicatamente.
   4. Incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ per 6 ore.
   5. Lavare le cellule e la cultura trasfettate in 2 ml di DMEM completo (10% FBS, piruvato 1 mM, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) per 2 giorni.
   6. Lavare le cellule con 2 ml di PBS sterile, aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C.
   7. Raccogliere sospensione cellulare e mescolare con almeno 1 volume di DMEM completo e spin down a 280 x g.
   8. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM completo ed espandere la coltura cellulare in10 cm coltura di tessuti piatto.
   9. Avviare selezione di cellule trasfettate con l'aggiunta di 700 ug / ml di G418 antibiotico selettivo 8 ml di DMEM completo e cultura per una settimana, cambiando media ogni tre giorni.
3. Arricchisci la popolazione fluorescente da cellule transfettate che sono stati sotto selezione in G418 per l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) ^39,40.
   1. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e aggiungere 1,5 ml di 0,25% tripsina.
   2. Incubare per 2 minuti a 37 ° C e miscelare con almeno un volume di DMEM completo.
   3. Raccogliere sospensione cellulare e centrifugare a 280 xg e risospendere le cellule in 1 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) di tampone BSA / PBS.
   4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia 40 micron e regolare il volume di 1 ml con 0,1% BSA / PBS per l'ordinamento.
   5. FACS-ordinare la popolazione più luminoso del 10% sulla base di spettro di fluorescenza utilizzando il sorter FACS ^41.
   6. Coltivare le cellule ordinati per un'altra settimana uselezione nder (700 ug / ml di G418 in DMEM completo).
   7. Selezionare di nuovo le cellule fluorescente di citometria a flusso ripetendo i punti da 1.3.1 a 1.3.6, ancora una volta.
   8. Dopo un secondo turno di selezione, trypsinize, filtro e ri-sospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS come descritto (gradini 1.3.1-1.3.4). Regolare la concentrazione a 2 x 10 ⁶ cellule / ml per singola cella di smistamento in 96 pozzetti usando Ordine FACS.
   9. Preparare 3-5 96 pozzetti con 100 ml di DMEM completo per la raccolta. Per migliorare la sopravvivenza dopo la cernita, aggiungere 100 ml di terreno di coltura filtrati dai piatti in cui le cellule EO771-LG sono stati coltivati ^42.
   10. Dopo l'ordinamento delle cellule nelle piastre a 96 pozzetti, tornare alle cellule di coltura per 2 giorni (37 ° C, 5% di CO _2).
   11. Identificare pozzi con vitali singoli cloni con l'esame sotto un microscopio invertito a 5x ingrandimento.
   12. Trypsinize ed espandere cloni vitali e congelare le cellule per il backup.
       1. Lavare pozzi con gra causa cloni con 100 ml di PBS sterile. Aggiungere 50 ml di 0,25% w / v tripsina e incubare 2 min a 37 ° C. Aggiungere 50 ml di DMEM completo e trasferimento sterile fondo piastra a 96 pozzetti V-parte inferiore o rotonda a girare verso il basso a 280 xg per 5 min.
       2. Risospendere le cellule in 100 ml di 700 mg / ml G418 DMEM completo e piastra ogni clone in piastre da 12 pozzetti. Aggiungere 400 ml di DMEM completo con G418 e la cultura fino confluenti.
       3. Lavare i pozzetti con 500 ml di PBS, aggiungere 100 ml di 0,25% tripsina e incubare 2 minuti a 37 ° C. Aggiungere 100 ml di DMEM completo e spin down per 5 min a 280 x g. Risospendere le cellule in 100 ul di DMEM completo con le cellule G418 e lamiere in 6 piastre bene fino confluenti.
       4. Una volta confluenti, trypsinize cellule, centrifugare e risospendere in 10% DMSO in FBS di congelare le scorte di cellule.
       5. Mantenere 1/10 delle sospensioni cellulari in coltura da loro placcatura in 100 mm piastre di coltura dei tessuti per la valutazione del loro potenziale metastatico.
4. Prova potenziale metastatico dei cloni selezionati.
   1. Trypsinize e risospendere le cellule in soluzione salina ad una concentrazione di 2,5 x 10 ⁶ cellule / ml e iniettare 200 microlitri in C57BL / 6 topi per via endovenosa attraverso la vena della coda.
   2. Dopo 2 settimane, raccogliere tessuto polmonare come descritto in precedenza ²³ e quantificare il carico tumorale dal conte di superficie o di un metodo stereologica ^43. Selezionare cloni ad alto potenziale metastatico per l'imaging intravitale.
5. Sollevare MacBlue (un promotore specifico mieloide guida proteina fluorescente (PCP) espressione ciano (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^{16)) 44} topi reporter.
   NOTA: in genere, vengono utilizzati topi tra 8 e 12 settimane, ma i topi già nel 7 e più tardi a 20 settimane sono stati testati per funzionare pure.

2. Multiphoton Microscopio Set up and Imaging Preparazione

NOTA: Anche se questo protocollo può essere eseguita su qualsiasi multiphoton microscopio, il sistema utilizzato per acquisire i dati riportati in questo protocollo è stato descritto in precedenza in dettaglio ^45.

1. Accendere tutti i componenti del microscopio e laser, tra cui laser a due fotoni e rivelatori almeno un'ora prima del tempo di imaging desiderato.
2. Appena prima dell'intervento chirurgico, misurare la potenza dell'ingresso luce microscopio posizionando la testa del misuratore di potenza ottica nel percorso ottico poco prima del microscopio e regolare le manopole specchio fine cavità laser fino alla massima intensità luminosa a 880 nm è leggere il misuratore di potenza ottica.

3. Vacuum System Impostare

1. Incollare il vetrino nella finestra di imaging (Supplemental Figura 1) con cianoacrilato. Lasciare almeno 4 ore per la colla si asciughi completamente.
   NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche prima del tempo.
2. Tagliare la punta della pipetta 100 microlitri alla prima linea dalla piccola apertura e collegare l'estremità non tagliata per il sottile vTubo uoto.
3. Collegare il sistema di aspirazione secondo la figura 1 e la figura 2 supplementare.
4. Con il vuoto su e l'estremità aperta bloccato, regolare il regolatore di vuoto per <3 Hg.
   NOTA: La regolazione finale del livello di vuoto viene eseguita mediante osservazione del sistema vascolare in vivo.
5. Applicare un sottile strato di grasso minerale al lato inferiore della piastra di imaging per evitare il mezzo di immersione lente dell'obiettivo venga trasferita all'esterno dalla piastra di imaging.
6. Posizionare la piastra di imaging sul palco microscopio.
   NOTA: La piastra di imaging personalizzato (Supplemental Figura 3) è un foglio di 1/8 "in alluminio di spessore lavorato sia per adattarsi allo spazio inserto palco e con un foro passante nel centro per lo svolgimento della finestra di imaging.
7. Inserire la finestra di vuoto nella piastra di imaging con il vetrino verso il basso.
8. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui piastra fase di imaging, e vincere l'imagingDow con il 70% di etanolo.
9. Collegare l'estremità del taglio della punta della pipetta alla finestra del vuoto e il nastro il tubo verso il basso alla piastra di imaging.
10. Portare l'obiettivo vicino alla finestra di imaging e posto una grossa goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino.
11. Assicurarsi che non vi siano perdite dal vetrino, bloccando l'apertura centrale della finestra vuoto e verificare che la goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino non viene aspirato.
    NOTA: Una sfera del mouse del computer vecchio stile posto sopra la finestra è utile per bloccare l'apertura centrale.

4. Chirurgia

1. Preparare l'area chirurgica sterile.
   1. Mettere tutti gli strumenti a portata di mano. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui area chirurgica, e strumenti chirurgici con il 70% di etanolo.
2. Tie una lunghezza di 3 pollici di 2-0 sutura al catetere, ¼ di pollice sopra la bussola con un doppio nodo.
3. Preparare coda fol vena del cateterelowing il protocollo pubblicato da Harney et al. ^46.
4. Utilizzando una lampada di calore a raggi infrarossi (IR), riscaldare l'animale nella sua gabbia per ~ 5 minuti per aumentare il flusso di sangue nella vena della coda e per aiutare a catetere. Si raccomanda di mantenere l'animale riscaldato a temperature fisiologiche durante tutta la procedura chirurgica utilizzando una lampada di calore o un pad riscaldamento.
5. Anestetizzare l'animale con 5% isoflurano e verificare che non vi è alcuna risposta ad una presa punta.
6. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi dell'animale.
7. Applicare la lozione depilatorio per 10-30 secondi per rimuovere i capelli dal lato sinistro dell'animale; dalla linea mediana del torace per ¼ della schiena e dal cavo ascellare per appena sotto la gabbia toracica.
8. Pulire qualsiasi lozione in eccesso e sterilizzare la pelle esposta con il 70% di alcol.
9. Attaccare una siringa sterile riempita con PBS alla coda della vena del catetere e inserire e nastro in posizione seguendo il protocollo pubblicato da Harney et al. ^46. Assicurarsi che il nastro è rispettato in modo sicuro l'ago stesso e non è libero nello spazio tra la coda e il nastro.
10. Intubare il mouse, o dopo il protocollo pubblicato da Das et al. ⁴⁷ o da DuPage et al. ⁴⁸
11. Accendere il ventilatore e impostarlo per la fornitura di 135 respiri al minuto e 200 ml di miscela isoflurano-ossigeno.
12. Collegare il catetere tracheale al ventilatore.
13. Muovi il mouse per l'area chirurgica. Fate estrema attenzione a non rimuovere il catetere.
14. Legare il 2-0 sutura intorno al muso del mouse sotto i denti davanti.
15. Nastro il catetere per il muso.
16. Nastro dell'arto anteriore sinistra al catetere di tenerlo fuori del campo chirurgico.
17. Abbassare le anestesia isoflurano ad un livello di 2,5% manutenzione e verificare l'assenza di risposta ad una presa punta.
18. Utilizzando le forbici affilate, rimuovere 1 cm ² di pelle al di sopra della parete toracica sinistra.
19. ascensore tegli mammaria cuscinetto adiposo e cauterizzare eventuali vasi sanguigni vista con la penna cauterizzazione.
20. Resecare il cuscinetto adiposo tagliando con le forbici affilate.
21. Rimuovere lo strato muscolare fino alla gabbia toracica tagliando con le forbici affilate. Fare attenzione a non tagliare la vena ascellare esecuzione alla base della zampa anteriore.
22. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare il 6 ^° costola. Utilizzando le forbici affilate tenuti ad un angolo poco profondo (~ 5 °) tagliare la nervatura in prossimità del bordo dell'apertura in pelle. Prestare la massima attenzione a non toccare il tessuto polmonare esposto.
23. Allargare l'apertura nella parete toracica per esporre l'intero lobo polmonare rimuovendo quattro costole consecutivi.
    Nota: Mantenere l'apertura di almeno 5 mm di distanza dallo sterno per evitare il cuore.
24. Sollevare con cautela il mouse afferrando la coda e tracheale catetere e spostare il mouse alla fase di imaging microscopio.
25. Con l'off vuoto, riempire la camera della finestra sottovuoto con PBS.
26. Capovolgere il mouse e posizionare l'espostopolmone sopra la finestra di imaging vuoto.
27. Lentamente attivare il vuoto per circa 3-5 pollici di mercurio utilizzando la valvola a sfera.
28. Inserire una cintura di trattenimento di carta tissue piegato a metà per due volte sul petto del mouse e nastro al piattello come mostrato in Figura 2 supplementare.
29. Agganciare il sensore coscia del pulsossimetro per coscia dell'animale e avviare il software.
30. Posizionare la camera ambientale sulla fase e accendere il calore per mantenere il mouse a temperatura fisiologica.
31. Ridurre il livello di isoflurano al 1-1,5% per mantenere l'anestesia e mantenere il flusso di sangue.

5. Imaging intravitale

1. Portare la lente obiettivo 25 x 0,95 apertura numerica (NA), vicino al vetrino e aggiungere una grande goccia d'acqua tra di loro.
2. Utilizzando la modalità epifluorescenza, visualizzare il canale FITC e portare il tessuto polmonare a fuoco.
3. Se non fatto prima dell'intervento chirurgico, icellule tumorali nject attraverso il catetere vena della coda.
   1. Staccare la siringa PBS dal catetere coda vena.
   2. Caricare una siringa sterile con 100 ml di sospensione cellulare tumorale (2 x 10 ⁷ cellule / ml in PBS massimo).
      NOTA: Questo passaggio può essere fatto in anticipo per studiare arrivo cellule di cancro al polmone in diversi punti temporali.
   3. Collegare la siringa con le cellule tumorali sul catetere vena della coda.
   4. Iniettare lentamente le cellule tumorali nella vena della coda.
   5. Staccare la siringa con le cellule tumorali dal catetere vena della coda.
   6. Collegare nuovamente la siringa PBS al catetere vena della coda.
      NOTA: identificare le posizioni di tutte le cellule tumorali prima di iniettare il destrano come diventa difficile distinguere le cellule tumorali dal segnale destrano via oculare dopo l'iniezione.
4. Individuare le cellule tumorali a immagine
   1. Per l'imaging cellule tumorali singole, individuare tutte le cellule tumorali e registrare le loro posizioni con °Pannello multipunto e del software.
      1. Individuare tutti i campi di vista di immagine osservando le cellule tumorali nel oculari microscopio.
      2. Nel software, passare al pannello multipunto facendo clic sul pulsante Multi-Point e memorizzare la posizione della cella facendo clic sul pulsante Aggiungi posizione.
   2. Per l'imaging mosaico, localizzare l'origine del mosaico e impostare le coordinate di imaging
      1. Individuare una posizione in alto a sinistra della struttura per essere catturato.
      2. Zero le coordinate x, yez del palcoscenico premendo il tasto "Zero" sul controller palco.
      3. Caricare l'elenco appropriato di coordinate mosaico facendo clic sul pulsante "Carica" ​​e selezionando la lista.
         NOTA: Un elenco esempio per un mosaico 2 x 2 con una sovrapposizione di 20% di un campo di 500 micron di vista sarebbe: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
5. Rimuovere la siringa with PBS nella vena della coda catetere e sostituirlo con la siringa contenente il destrano.
6. Iniettare lentamente fino a 100 ml di 20 mg / ml 155 kDa rodamina-destrano sciolto in PBS nel mouse tramite il catetere vena della coda seguiti iniettando 50 ml di PBS sterile per lavare la linea. Non introdurre eventuali bolle nella linea. Quando necessario, iniettare destrano almeno un'ora dopo l'iniezione delle cellule del cancro in modo che il volume totale somministrata al topo non superi le 4 ml / Kg / hr.
7. Impostare i parametri di imaging.
   1. Passare il microscopio alla modalità multiphoton.
   2. Impostare lo zoom ad un fattore di 2X facendo clic sul pulsante di segnali di temporizzazione e l'aggiornamento del campo Fattore di zoom.
   3. Regolare la potenza del laser al ~ 10% (~ 10-15 mW a campione) facendo clic sul pulsante Rilevatori e laser e poi regolando il cursore Tsunami alimentazione a 10.
8. Immagine ciascuna posizione per verificare la presenza di cellule tumorali e visualizzare il flusso e l'integrità del vascunitario.
   NOTA: Le navi dovrebbero apparire pienamente perfuso con eritrociti fluenti e destrano fluorescente devono essere contenute all'interno dei vasi senza perdite agli spazi extravascolare. Circa 10 - 20 cellule tumorali dovrebbero essere all'interno della apertura libera della finestra di vuoto.
9. Regolare la profondità di partenza di ciascuna posizione per essere ripreso.
   1. Per ciascuna posizione, regolare la posizione z ruotando la manopola del fuoco sul controller palco all'immagine la fetta superiore della cellula tumorale.
   2. Posizionare la cella al centro del campo visivo.
   3. Fare clic sul pulsante Multipoint, fare clic sulla posizione del campo visivo per evidenziarlo e fare clic su Add seguito dal pulsante Elimina per sostituire posizione memorizzata della cella nella lista multipunto.
   4. Visivamente osservare la luminosità relativa della cellula tumorale in ogni posizione.
10. Salvare le nuove posizioni di ciascuna delle cellule facendo clic sul pulsante Salva nel pannello un multipuntod specificare un nome di file.
11. Per l'imaging di cellule tumorali singole, raccogliere tre celle di luminosità approssimativamente equivalente ed eliminare tutte le altre località dalla lista multipunto cliccando sulla loro posizione nella lista e facendo clic sul pulsante Elimina.
12. Fare clic sul pulsante Rilevatori e laser e regolare i cursori per il guadagno PMT dei canali verde e rosso ⁴⁵ in modo che i segnali sono al di sotto della saturazione.
13. Regolare il cursore per il canale blu ⁴⁵ in modo che i macrofagi appaiono ciano.
    NOTA: apparirà Qualsiasi segnale di seconda armonica solo nel canale blu e può essere separato dal macrofagi ciano seguendo la procedura di canale di sottrazione descritto in precedenza ^45.
14. Impostare la profondità di inizio z-stack a 0 micron e la profondità finale di 24 micron spostando la fase Z per la posizione e facendo clic sul pulsante Start e pulsanti Fine rispettivamente.
    NOTA: Le cellule all'interno di questa profondità verrà visualizzato con il miglior segnale dirumore e risoluzione.
15. Impostare la dimensione z passo per 3 micron.
16. Impostare i parametri di imaging seguenti parametri precedentemente descritti ^45,49.
    1. Per l'imaging di cellule tumorali singole, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e quindi immettere 4 V nel campo fattore di zoom (equivalente ad un fattore di zoom 1.5X), inserire 3 nel campo medie telaio e fare clic sul pulsante di Time-Lapse e immettere 10 nel campo Time-lapse.
       NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
    2. Per l'imaging mosaico, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e immettere un fattore di ingrandimento di 1,5 V (equivalente ad un fattore di zoom 4X), digitare 3 nel numero di medie telaio e fare clic sul pulsante Time-Lapse e immettere 10 nel tempo- lapse campo ritardo.
       NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
17. Abilitare il multipunto, z-stack e modalità di imaging t-lapse cliccando sui relativi pulsanti.
18. Premere il pulsante Record per acquisire immagini.
    NONE: il tessuto polmonare è molto delicata e suscettibile a foto-danni. Se dopo il tempo del flusso sanguigno lapse imaging ferma nel campo immaginata, il laser potrebbe essere troppo elevata e successiva imaging altri campi deve essere fatto a potenza inferiore.
19. Ogni 30-45 min, iniettare lentamente 50 ml di PBS o soluzione salina per mantenere l'idratazione dell'animale.

6. L'eutanasia

1. Aumentare la isoflurano al 5%.
2. Mantenere l'animale sotto il 5% isoflurano fino al 30 sec dopo che cessa di respirare e rimuovere l'animale dal palco.
3. Eseguire dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.

Analisi 7. Immagine

1. Per gli esperimenti singoli imaging cellulare:
   1. Caricare le immagini in Fiji e formato come una HyperStack.
   2. Per ogni z-slice nel HyperStack, riprodurre il filmato lasso di tempo e guardare per il movimento xy residua. Se viene rilevato il movimento xy residuo, applicare il plugin chiamato StackReg ³⁶ alla pila aeliminare il movimento.
2. Per gli esperimenti di imaging a mosaico:
3. Caricare le immagini in Fiji ed unirle aprendo il Mosaico Stitching macro (file supplementare codice Mosaico in brossura) e le informazioni di entrare sulle immagini, come la directory, il nome di base del file, il numero di X e Y campi nel mosaico e il numero di fette e punti di tempo.
   NOTA: a causa di come Java interpreta le directory, i nomi delle cartelle deve avere due barre rovesciate come separatori sottocartella. A causa delle limitazioni del built-in plug-in a coppie in brossura, i nomi dei file di base non devono contenere trattini.
4. Per ottenere una visione chiara dei confini del sistema vascolare, media insieme tutti i punti di tempo per il canale di sangue in una singola immagine e quindi replicare questa immagine come sfondo per ogni fotogramma del film degli altri canali.
   NOTA: Questo viene fatto semplicemente eseguendo la macro Eseguire della media Sangue (file di codice Supplemental Perform della media Sangue).

Risultati

Per dimostrare il tipo di risultati che si possono ottenere con questo metodo, abbiamo iniettato cellule tumorali E0771-LG etichettati con il trifoglio proteina fluorescente nella vena della coda di topi MacBlue ⁴⁴ a varie punti di tempo prima dell'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, 155 kD rodamina destrano marcato è stato iniettato IV per segnare è stata eseguita imaging vascolare e time-lapse.

Discussione

Ad alta risoluzione in vivo imaging ottico in combinazione con le etichette funzionali fluorescente come proteine e anticorpi ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della cascata metastatica. Ha permesso la visualizzazione diretta e la quantificazione di cella singola e parametri sub-cellulare nelle cellule tumorali, cellule ospiti e la loro microambiente. Questo l'imaging all'interno del tumore primario ha portato, ad esempio, alla scoperta di microambienti discreti, a sostegno di una invasio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter	Kent Scientific		Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A