Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Zusammenfassung

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Zusammenfassung

Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 ^hell CD16 ^{dim / -} NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.

Einleitung

Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe ^1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten ² beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis ^3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , ^{2, 4, 5, 6, 7} beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium Melioration von Krankheitsbelastung ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat ¹ beschrieben worden ist ^{, 13, 14, 15.} Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen ¹⁴ durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = "xref"> 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS ^{1, 17, 18.}

Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine ^{1, 15} vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen ¹ zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung ^{1, 19, 20.} All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken ²¹ analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen ^15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer ^22. Transmigrationsassays als ²¹ hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations ^{demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 ^hell CD16 ^{dim / -} NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 ^dim CD16 ⁺ Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer ²¹ reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.

Protokoll

1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC)

1. Beschichtung von Zellkulturflaschen
   1. Um die Fibronektin-Lösung vorbereitet, mit 10 ml PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 150 & mgr; l Fibronektin und gut mischen.
   2. Zur Abdeckung des Bodens einer T-25-Zellkulturflasche 2 mL der Fibronektin-Lösung. Inkubieren der Zellkultur-Kolben bei 37 ° C im Inkubator mindestens 3 h. Fibronectin beschichteten Kolben können für 2 Wochen bei 37 ° C / 5% CO ₂ aufbewahrt werden.
2. Säen und Zellkultur von HBMEC
   1. Aspirat Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Zellkulturflasche. Hinzufügen 7,2 x 10 ⁴ HBMEC / cm² suspendiert in 6 ml ECM-B - Medium (= ECM-B mit 5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% Endothelzellwachstum Ergänzung). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO _2. Überprüfen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Mikroskop.
   2. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.Ernte oder Teile von Zellen, wenn HBMEC etwa 80% Konfluenz erreichen. HBMEC sollte zwischen dem Kanal 1 und 15 verwendet werden, Verlust der physiologischen Eigenschaften zu vermeiden.
3. Ernte HBMEC.
   1. Bereiten Accutase Lösung durch Mischen Accutase (1x) mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1. Halten Accutase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad bis zur weiteren Verwendung.
   2. Übertragen ECM-B-Medium von der Zellkulturflasche in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen HBMEC durch Zugabe von 5 ml PBS, um den Boden der Zellkulturflasche. Absaugen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male.
   3. In 2 ml vorgewärmten Accutase Lösung. für 2 min bei 37 ° C inkubieren. Danach HBMEC werden durch fest Antippen der Zellkulturflasche mehrmals wieder suspendiert. Zellablösung wird gesteuert unter Verwendung eines Mikroskops
   4. Das ECM-B-Medium, die zuvor in einem Rohr 15 mL gespeichert wird zurück in die Zellkulturflasche hinzugefügt, sobald HBMEC abzulösen beginnen. Spülen Sie den Boden des Kolbens wiederholt, bis die meisten HBMEC sinderneut suspendiert.
   5. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml ECM-B-Medium. Zählen von Zellen und verdünne die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 3 × 10 ⁵ pro mL HBMEC ECM-B - Medium zu erreichen.

2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze

1. Beschichtung von Zellkultureinsätzen
   Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie die Membran der Zellkultur - Einsätze zu berühren.
   1. Füge 100 & mgr; l Fibronektin - Lösung (siehe Abschnitt 1.1.1) zu jedem Zellkultureinsatz (1A) und eine Vertiefung einer 96-Well - Flachbodenplatte (optischen Kontrolle gut). Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 3 h. Nach der Inkubation absaugen Fibronektinlösung.
   2. 100 l HBMEC Suspension auf die Zellkultur-Einsätze und die optische Kontrolle gut. Hinzufügen 600 ul ECM-B-Medium mit dem unteren Bereich der ZelleKultureinsätze. Inkubieren für 3 - 4 Tage bei 37 ° C / 5% CO ₂ , bis Barrierenintegrität (1B) erreicht ist , das Zellwachstum kontrolliert durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung. Hinweis: Das Zellwachstum über 4 Tage wird nicht empfohlen.
   3. Optional: entzündliche Bedingungen nachahmen aspirieren das Medium aus dem unteren Fach und ersetzen sie durch ECM-B-Medium, ergänzt mit 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 h vor der Migrationstest.

3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay

1. Herstellung von evans blaue Lösung
   1. PBS / B27-Lösung der Mischung 10 ml PBS mit 200 & mgr; l B27 Ergänzung unter Verwendung einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen. Verdünnte Evans-Blau-Stammlösung (20 mg / ml PBS) 1: 1000 mit PBS / B27.
2. Evans-Blau-Assay Permeabilität
   1. Anzusaugen, das Medium aus dem unteren Abteil durch die obere Kammer gefolgtvon einer Zellkultureinsatzes eine konfluente Monoschicht HBMEC enthält. 100 l evans blaue Lösung des Zellkultureinsatzes.
   2. Hinzufügen 600 & mgr; l PBS / B27 zu dem unteren Abteil und Inkubation für 60 min bei 37 ° C / 5% CO _2. Entfernen Sie vorsichtig den Zellkultureinsatz Pinzette.
3. Evans-Blau-Messung
   1. Entfernen PBS / B27 aus dem unteren Abteil und übertragen wurden jeweils 100 ul zu zwei Vertiefungen einer schwarzen 96-Napf-Polystyrol-Platte mit flachem Boden. Legen Sie Platte in einem Tecan Infinite M200 Pro-Plattenleser und bestimmen die optimale z-Position.
   2. Measure Anregung von Evans-Blau unter Verwendung von entsprechenden Einstellungen (zum Beispiel: Anregung: 620 nm, Emission: 680 nm, Anregungsbandbreite: 9 nm, Emissionsbandbreite: 20 nm, 175x Verbesserung, 25 blinkt, Integrationszeit: 20 us).
   3. HBMEC Barrierefunktionen vergleichen erfassten Daten zu einer Standardkurve zeigt evans blau Permeation durch HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Samen zu bestimmening Zellen (1B, rechts).

4. Migration Assay

1. Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC).
   1. Fügen Sie 10 ml RPMI in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 200 & mgr; L B27 Ergänzung. Graf PBMC und zentrifugieren Zellen bei 300 · g für 5 min. Resuspendieren PBMC in einer Endkonzentration von 5 x 10 ⁶ Zellen / ml RPMI / B27.
2. Aufbau des Migrationstest
   1. Aspirat Medium aus der unteren Kammer , gefolgt von der oberen Kammer aus dem Zellkultur - Inserts enthalten konfluenten Monolayern HBMEC (1A). Spender pro 100 uL PBMC - Suspension jeweils mit den Zellkultureinsätzen hinzufügen und auch eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen pro (in vitro - Kontrolle).
   2. Hinzufügen 600 & mgr; l RPMI / B27 zum unteren Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 & mgr; l auf die PBMC der in vitro - Steuerung und inkubieren 6 h bei 37 ° C / 5% CO _2.
3. Ernten von migrierten PBMC
   1. Nehmen Sie den Zellkultureinsatz aus einer Pinzette vorsichtig den Boden mit 400 ul PBS spülen, ohne die Membranen zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz.
   2. Fügen Sie 20 & mgr; l Fließzahl Fluorospheres (etwa 1.000 Perlen / ul) zu dem unteren Abteil des Zellkultureinsatzes sowie an die in - vitro - Kontrolle und gut mischen. 1 ml der resultierenden Suspension PBMC Cytometry Rohre zu fließen.

5. Durchflusszytometrie

1. Probenvorbereitung
   1. Zentrifuge PBMC bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Bereiten Antikörperlösung durch Zugabe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu 100 & mgr; l Durchflusszytometrie-Puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pro Probe. Für die Ergebnisse präsentiert unter 1 & mgr; l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 & mgr; l CD56-PC7, 1 & mgr; l CD8-A700 und 1 ul CD16-A750 wurden pro Probe verwendet.
   3. Resuspendieren PBMC in 100 & mgr; l der Antikörperlösung und bei 4 ° C für 30 min inkubieren.
   4. Nach Eintragen von 250 & mgr; L Durchflusszytometrie-Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min.
2. Probennahme
   1. Resuspendieren PBMC in der erforderlichen Menge (variiert in Abhängigkeit von dem Durchflusszytometer verwendet wird) der Durchflusszytometrie-Puffer.
   2. Acquire stained PBMC unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem aktiven Detektors zwischen 525 und 700 nm Wellenlängen-Durchflusszahl Fluorospheres (Anregung 488 nm, Emission 525 bis 700 nm) zu erfassen.
      (Die folgenden Schritte sind ein Beispiel, wenn ein Gallios Durchflusszytometer betrieben mit Kaluza G-Software verwendet wird. (1) Starten der Computer (2) Wenn das Betriebssystem vollständig geladen ist, startet das Durchflusszytometer durch den „Zytometer auf“ Drücken der Taste das jeweilige Erfassungsprotokoll Laden von „open-Protokoll“ drücken. (4) wählen Sie das gewünschte Protokoll und wählen Sie „öffnen“. (5) Duplizieren Sie das Protokoll für jede Probe mit der rechten Taste anklicken. (3)Maustaste auf das Protokoll sichtbar im virtuellen Karussell und einem Linksklick auf das Feld „Duplikat“. (6) Beschriften jede Probe in der Probenliste. (7) übertragen, die Proben zu den angegebenen Positionen des Karussells und die Übernahme beginnen.)
3. Probenanalyse
   1. Öffnen resultierende Durchflusszytometriedaten die jeweilige Software. Bestimmt Anzahl von Subpopulationen von Interesse für transmigrierten PBMC sowie Zellen , die von in vitro - Kontrollvertiefungen und Zählung Fluorospheres fließt die jeweilige Analyse - Software.
      (Ein Beispiel für die Gating - Strategie wird im Ergebnisteil (Abbildung 1 C gegeben: die Transmigration von NK-Zell - Untergruppen zu analysieren, zunächst auswählen Lymphozyten in einer Seitwärtsstreuungskanals (SSC) gegen Vorwärtsstreuung Kanal (FSC) Plot Lymphocyten ist. dann in einem CD3 gegen CD56 Plot angezeigt und CD56 ⁺ CD3 ^-. NK - Zellen ausgewählt werden , zu unterscheiden zwischen NK-Zell - Untergruppen, NK - Zellen angezeigt inein CD56 gegen CD16 Grundstück und CD56 ^hell CD16 ^{dim / -} sowie CD56 ^dim CD16 ⁺ NK - Zellen ausgewählt. Außerdem Zählung Strömungs Fluorospheres werden aus einem FSC gegen SSC Stück ausgewählt und anschließend in einem Grundstück eines Kanals mit einer Emission zwischen 525 und 700 nm gegenüber der Zeit angezeigt, deren Anzahl zu bestimmen.)
   2. Um die Gesamtzellzahl jeder Probe zu berechnen, normalisieren die erfasste Anzahl von Zellen unter Verwendung von Flusszahl Fluorospheres:
      
   3. Bestimmen Prozentsatz der migrierten Zellen als Verhältnis zwischen dem gesamten migrierten Zellen und den Gesamtzellen in der in - vitro - Kontrolle.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, lin...

Diskussion

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren.

Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartime...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11