JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Аннотация

Лимфоцит экстравазация в центральную нервную систему (ЦНС) имеет решающее значение для иммунного надзора. Болезни, связанные с изменениями в лимфоцитах кровоподтек может привести к патофизиологических изменений в ЦНС. Таким образом, исследование миграции лимфоцитов в ЦНС важно понимать, воспалительные заболевания ЦНС и для разработки новых подходов терапии. Здесь мы представляем модель в пробирке человеческого гематоэнцефалического барьера для изучения лимфоцитов кровоизлияния. микрососудистый мозг человеческого эндотелиальные клетки (HBMEC) являются confluently, выращенные на пористом полиэтилентерефталате Transwell вставки, чтобы имитировать эндотелий из гематоэнцефалического барьера. Функция Барьера подтверждено блокатора малой зоны иммуногистохимии, трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измерения, а также анализ Evans Blue проникания. Эта модель позволяет исследование диапедеза редких субпопуляций лимфоцитов , такие как CD56 CD16 ярко тусклые / - клетки NK. Furthermруды, влияние других клеток, цитокинов и хемокинов, связанных с болезнью изменений, а также различных схем лечения на миграционный способности лимфоцитов могут быть изучены. И, наконец, воздействие воспалительных стимулов, а также различные режимы лечения на эндотелиальном барьере может быть проанализированы.

Введение

Лимфоцит миграция из крови в ткань имеет решающее значение для иммунного надзора. Последовательность конкретных молекулярных взаимодействий обеспечивает сайт - специфическое экстравазации в тонком кишечнике, кожи, лимфатических узлов, центральной нервной системы (ЦНС), и других тканей 1. Изменения в миграции лимфоцитов участвуют в патофизиологии ряда широких распространенных заболеваний 2. Миграция в иммунной привилегированном ЦНС жестко регулируется и , соответственно , изменения этого процесса вовлечены в ЦНС заболеваний , связанных как энцефаломиелита 3, оптиконевромиелит, инсульт и рассеянный склероз (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Поэтому важно изучить лимфоциты кровоизлияния, чтобы лучше понять патофизиологию болезни и разработать инструменты для агромелиорация болезни бремени 8, 9, 10, 11, 12.

Лимфоциты мигрируют в ЦНС с помощью различных маршрутов. Экстравазационный через посткапиллярные венули в субарахноидальное пространство через кровь цереброспинальной жидкости барьера в пределах сосудистого сплетения и через гематоэнцефалический барьера, были описаны 1, 13, 14, 15. Миграция через гематоэнцефалический барьер проводится при взаимодействии лимфоцитов с эндотелиальными клетками 14. В отличие от эндотелиальных клеток на периферии, эндотелиальные клетки ЦНС экспрессируют высокие количества плотных молекул перехода, таким образом, строго ограничивая количество клеток и белков, способных пересекать гематоэнцефалический барьердеваха = "Xref"> 16. Результаты Воспаления в разрыхлении плотных контактов и индуцируют экспрессию молекул адгезии; Таким образом, усиление миграции лимфоцитов в ЦНС 1, 17, 18.

Экстравазационный через гематоэнцефалический барьер является многоступенчатым процессом. Лимфоциты привязь к клеткам эндотелия , а затем катиться по эндотелию в процессе , главным образом , опосредованного селектинов 1, 15. Впоследствии, взаимодействия между хемокинов , секретируемых эндотелием и соответствующих рецепторов хемокинов , выраженные на лимфоциты индуцируют конформационные изменения интегринами, тем самым способствуя твердую адгезию к клеткам эндотелия 1. И, наконец, лимфоциты либо ползать по эндотелиальному барьеру против кровотока, прежде чем переселяется в периваскулярное пространстве, или срыв немедленно и непосредственно радиопередающиеigrate на сайте фирмы адгезии 1, 19, 20. Все эти этапы экстравазации лимфоцитов могут быть проанализированы в пробирке с использованием различных методик 21. Покадровое видео микроскопия используется для изучения начальных привязывать и прокатки 15. Адгезионные анализы предоставляют подробную информацию о твердом аресте в эндотелиальные барьеры 22. Трансмиграция анализы , как продемонстрировано здесь , позволяют анализ иммунной клетки трансмиграции 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Использование человека в пробирке крови барьер мозга модель, недавно мы могли бы показать , что выше MIGRAtory емкость CD56 CD16 ярко тусклая / - клетки NK по сравнению с их CD56 DIM CD16 + аналоги отражались преобладанием этой субпопуляции NK в интратекальной камере 21. Таким образом, наша экспериментальная установка , кажется, подходит для имитации ситуации в естественных условиях.

протокол

1. Культура клеток головного мозга человека микрососудистой эндотелиальных клеток (HBMEC)

  1. Окраска клеточной культуры колб
    1. Для приготовления раствора фибронектина, добавляют 10 мл PBS в 15 мл центрифужной пробирки. Добавьте 150 мкл фибронектин и хорошо перемешать.
    2. Для того, чтобы покрыть дно Т-25 клеточной культуры колбу добавляют 2 мл раствора фибронектина. Инкубируйте колбы для культивирования клеток в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С в инкубаторе. Фибронектина покрытием колбы может храниться в течение 2 недель при 37 ° С / 5% CO 2.
  2. Посевная и культуры клеток из HBMEC
    1. Аспирируйте раствор фибронектина со дна колбы для культивирования клеток. Добавить 7,2 × 10 4 HBMEC / см² суспендируют в 6 мл ЕСМ-б среды (= ЕСМ-Ь с добавлением 5% сыворотки плода коровы, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% добавки для роста клеток эндотелия). Инкубируют при 37 ° C / 5% CO 2. Проверьте рост клеток ежедневно с помощью микроскопа.
    2. Изменение среды каждые 3 дня.Урожай или разделить клетки, когда HBMEC достигают примерно 80% сплошности. HBMEC следует использовать между прохождением 1 и 15, чтобы избежать потери физиологических свойств.
  3. Урожай HBMEC.
    1. Подготовка Accutase раствора путем смешивания Accutase (1x) с PBS в соотношении 1: 1. Хранить Accutase раствора при 37 ° С в водяной бане до дальнейшего использования.
    2. Передача ЕСМА-B среды из колбы для культивирования клеток в 15 мл центрифужной пробирки. Промыть HBMEC путем добавления 5 мл PBS на дно колбы для культивирования клеток. Аспирируйте PBS, и повторить стадии промывки еще два раза.
    3. Добавить 2 мл подогретого Accutase раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин. После этого, HBMEC ресуспендировали, твердо нажав клеточную культуру колбы несколько раз. Открепления клеток контролируется с помощью микроскопа
    4. ЕСМ-б-среда ранее сохраненная в трубке 15 мл добавляют обратно в колбу для культивирования клеток, как только HBMEC начинают отделяться. Промыть дно колбы несколько раз, пока большинство HBMEC нересуспендировали.
    5. Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужной пробирки. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл ЕСМ-б среды. Граф клеток и разбавленной клеточной суспензии , чтобы достичь конечной концентрации 3 × 10 5 HBMEC на мл ЕСМ-б среды.

2. Получение клеточной культуры вкладышами

  1. Покрытие клеточных культур вставок
    Важное замечание: Не прикасайтесь к мембране вставок клеточных культур.
    1. Добавьте 100 мкл раствора фибронектина (см 1.1.1) для каждой клеточной культуры вставки (рисунок 1А) и одну лунку 96-луночного плоским дном пластины (а оптического контроля). Инкубировать в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С. После инкубации аспирата фибронектина раствора.
    2. Добавьте 100 мкл суспензии HBMEC к вставкам культуры клеток и оптический контроль скважины. Добавьте 600 мкл ЕСМ-б среды в нижнее отделение ячейкикультуры вставки. Инкубируют в течение 3 - 4 дней при 37 ° C / 5% CO 2 до целостности барьера (фиг.1В) достигается, проверить рост клеток путем микроскопического оценки HBMEC в оптическом контроле хорошо. Примечание: рост клеток за четыре дня не рекомендуется.
    3. Необязательно: Для имитации воспалительных состояний аспираты среды из нижнего отсека и заменить его ЕСМ-б среды с добавлением 500 ед / мл IFN-gamma / TNF-alpha 24 ч предварительного анализа миграции.

3. Контроль качества Evans Blue, на день анализа Трансмиграции

  1. Приготовление раствора синего Эванса
    1. Для приготовления PBS / B27 смеси 10 мл раствора PBS 200 мклы B27 добавки с использованием 15 мл центрифужной пробирки. Развести Evans Blue маточного раствора (20 мг / мл PBS), 1: 1 000 с PBS / B27.
  2. Эванс синего анализа проницаемости
    1. Аспирируйте среды из нижнего отсека, затем верхний отсекиз одной клеточной культуры, содержащей вставку сливающийся HBMEC монослой. Добавьте 100 мкл синего Эванса решение вставки клеточной культуры.
    2. Добавьте 600 мкл PBS / B27 в нижний отсек и инкубируют в течение 60 мин при 37 ° C / 5% CO 2. Осторожно удалите вставку для культивирования клеток с помощью щипцов.
  3. Эванс синий измерение
    1. Удалить PBS / B27 из нижнего отсека и передачи 100 мкл каждого к двум лунки черного полистирола 96-луночного плоской нижней плите. Вставьте пластину в считывающем Tecan Бесконечного M200 Pro пластины и определить оптимальную Z-позицию.
    2. Мера возбуждения синего Эванса с использованием соответствующих настроек (например: возбуждение: 620 нм, излучение 680 нм, ширина полосы частот возбуждения: 9 нм, ширина полосы излучения: 20 нм, повышение 175x, 25 мигает, время интегрирования: 20 мкс).
    3. Для того, чтобы определить, барьерные функции HBMEC сравнить данные приобрели со стандартным кривым, изображающей Evans Blue проникания через HBMEC в различные моменты времени после семениING клетки (рис 1В, справа).

4. Анализ миграции

  1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).
    1. Добавляют 10 мл RPMI в 15 мл центрифужные пробирки и добавляют 200 мкл B27 дополнения. Граф РВМС и центрифужные клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить РВМС до конечной концентрации 5 × 10 6 клеток / мл RPMI / B27.
  2. Настройка из анализа миграции
    1. Аспирируйте среда из нижнего отсека , затем верхний отсеком для культивирования клеток , содержащих вставки сливающегося HBMEC монослоев (Фигура 1А). За донора добавляют 100 мкл суспензии РВМС каждый к вставкам клеточных культур , а также одну лунку 24-луночного планшета на (в пробирке) управления.
    2. Добавьте 600 мкл RPMI / B27 в нижний отсек вставки для культивирования клеток и 500 мкл в РВМС контроля в пробирке и инкубируют в течение 6 ч при 37 ° C / 5% CO 2.
  3. Заготовка мигрированного РВМСА
    1. Выньте вставку для культивирования клеток с помощью щипцов и тщательно промыть дно с 400 мкл PBS, не касаясь мембраны. Выбросьте вставку для культивирования клеток.
    2. Добавьте 20 мкл подсчета потока флуоросферы (около 1000 бусин / мкл) в нижнем отсеке клеточной культуры вставки, а также к контролю в пробирке и хорошо перемешать. Передача 1 мл суспензии РВМСА в результате проточной цитометрии трубок.

5. Проточная цитометрия

  1. Базовые приготовления
    1. Центрифуга РВМС при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Готовят раствор антител путем добавления Флуорохром-конъюгированные антитела к 100 мкл буфера проточной цитометрии (PBS / 1% БСА / 2 мМ ЭДТА) на образец. Для получения результатов, представленных ниже 1 мкл CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 мкл CD56-PC7, 1 мкл CD8-A700, и 1 мкл CD16-A750 были использованы на образец.
    3. Re-приостановить PBМС в 100 мкл раствора антител и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С.
    4. Добавьте 250 мкл буфера для проточной цитометрии и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин.
  2. приобретение образца
    1. Повторное приостановить РВМС в требуемом количестве (варьируется в зависимости от используемого проточного цитометра) проточной цитометрии буфера.
    2. Acquire окрашенную РВМС с использованием проточного цитометра с активным детектором между 525 и 700 нм для обнаружения потока подсчета флуоросферы (возбуждение 488 нм, излучение 525 - 700 нм).
      (Следующие шаги являются примером, если используется поток Gallios цитометр работает с программным обеспечением Калуца ​​G:. (1) Запустить компьютер (2) Когда операционная система полностью загружена, начинается поток цитометра, нажав кнопку «цитометра на» кнопке . (3) Загрузите соответствующий протокол сбора, нажав кнопку «открытого протокола». (4) выберите нужный протокол и выберите «открыть». (5) Дублирование протокола для каждого образца, щелкнув справакнопка мыши на протоколе видимого в виртуальной карусели и левой кнопкой мыши на поле «Дубликата». (6) Добавьте каждый образец в списке выборки. (7) Передача образцов в указанных положениях карусели и начать приобретение.)
  3. анализ проб
    1. Открыть в результате проточной цитометрии данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Определение количества субпопуляций , представляющих интерес для переселилась РВМС, а также из клеток в пробирке контрольных лунок , и поток подсчета флуоросферы с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа.
      (Пример стратегии стробирования приведен в части результатов (рисунок 1 C: Для анализа трансмиграцию НК-клеток подмножеств, сначала выбрать лимфоциты в вбок рассеяния канала (SSC) в сравнении вперед разброс канала (FSC) участка Лимфоциты. затем отображается в CD3 против CD56 и CD56 сюжета + CD3 -. выбраны клетки NK Чтобы различать NK-клеток подмножеств, клетки NK отображаются вCD56 против CD16 и CD56 сюжет яркий CD16 тусклый / - а также CD56 тусклый CD16 + NK - клетки выбраны. Кроме того, граф потока флуоросфера выбираются из FSC против SSC участка, а затем отображаются на участке канала с испусканием в диапазоне от 525 до 700 нм в зависимости от времени, чтобы определить их число.)
    2. Для того, чтобы вычислить общее количество клеток каждой пробы, нормализует обнаруженное число клеток с помощью подсчета потока флуоросферы:
      figure-protocol-9882
    3. Определить процент мигрировавших клеток , как соотношение между общими мигрировавших клеток и общего числа клеток в контроле в пробирке.

Результаты

Типичные результаты , показывающие трансмиграцию NK-клеток и подмножеств Т-клеток с использованием человеческой гематоэнцефалического барьера модели (рисунок 1А) показаны. Целостность монослоя HBMEC была подтверждена окрашиванием плотных соединений молекулы ...

Обсуждение

Здесь мы представляем технику для исследования перевоплощения лимфоцитов через человек гематоэнцефалического барьера. В пробирке анализа лимфоцитов миграции в ЦНС важно изучить основные процессы лимфоцитарного кровоподтека, потенциальных изменений , связанные с болезнью, и но...

Раскрытие информации

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Благодарности

This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSGibco14190-094without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mLSigmaF1141-5MGfrom bovine plasma
T-25 cell culture flaskGreiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Penicillin/StreptomycinScienCell1001-b
Endothelial cell growth supplementScienCell1001-b
TranswellCorning3472clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plateCorning3596
Evans blueSigmaE2129-10Gstock solution: 1 g/50 mL PBS
B27Gibco17504-04450x concentrated
Infinite M200ProTecan
96-well black flat bottom plateGreiner BioOne675086
48-well plateCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Flow Count FluorospheresBeckman Coulter7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios 10-color flow cytometerBeckman Coulter
Kaluza 1.5aBeckman Coulter
TNF-αPeprotech300-01A
IFN-γPeprotech300-02
CD3-PerCP/Cy5.5Biolegend300430clone UCHT1
CD56-PC7Beckman CoulterA21692clone N901
CD16-A750Beckman CoulterA66330clone 3G8
CD4-FITCBiolegend300506clone RPA-T4
CD8-A700Beckman CoulterA66332clone B9.11

Ссылки

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122HBMEC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены