를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

요약

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

초록

중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 - 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 ^-이 모델은 ^{/ 어두워} CD56 ^밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.

서문

조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 ^한 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 ^질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 ^3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7과} 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다 질병 부담이 ^{8, 9, 10, 11, 12의} 간척.

림프구는 별개의 경로를 통해 중추 신경계로 이동한다. 혈액 - 뇌 장벽 맥락총 내의 전역 혈액 - 뇌척수액 장벽을 통해 거미 막밑 공간에 모세관 세정맥을 통한 혈관 외 유출 ^{1, 13, 14, 15가} 설명되었다. 뇌 혈관 장벽을 통과 마이그레이션은 내피 세포 ^(14)와 림프구의 상호 작용에 의해 수행된다. 주변부에서 내피 세포는 대조적으로, CNS의 내피 세포함으로써 엄격 혈액 - 뇌 장벽을 횡단 할 수있는 세포와 단백질의 양을 제한하는 단단한 접합부 분자의 높은 발현 양아가씨 = "외부 참조"> 16. 단단히 접합 염증 완화 결과 및 부착 분자의 발현을 유도한다; 따라서, CNS ^{1, 17, 18로} 림프구 이동을 향상.

혈액 - 뇌 장벽을 통해 혈관 외로 유출 다단계 과정이다. 내피 세포 테더 림프구 다음 주로 셀렉틴 ^{1 (15)에} 의해 매개되는 과정에서 내피 굴러. 이어서, 림프구상에서 발현 내피 세포에 의해 분비 케모카인 및 각각의 케모카인 수용체 간의 상호 작용함으로써 내피 세포를 ¹ 밀착성을 촉진 인테그린의 구조적 변화를 유도한다. 마지막으로, 혈관 주위 공간으로 transmigrating 전에 혈액의 흐름에 대한 내피 장벽을 따라 하나 크롤링을 림프구, 즉시 직접 기어 박스 실속확고한 부착 ^{1, 19, 20의} 사이트 igrate. 림프구의 혈관 외 유출의 이러한 모든 단계는 별개의 기술 ^(21)를 사용하여 체외에서 분석 할 수 있습니다. 시간 경과 비디오 현미경은 초기 테 더링 및 ^{15 롤링을} 연구하는 데 사용됩니다. 접착 분석은 장벽 ^{(22) 내피} 회사 체포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 여기에서 입증 된 바와 같이 윤회 분석은 면역 세포 윤회 ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의} 분석을 허용한다.

체외 혈액 뇌 장벽 모델에서 인간을 사용하여, 우리는 더 높은 마이그레이션 백분율이 보여 최근 수CD56 ^밝은 CD16의 atory 용량 ^{/ 어두워 -} NK 세포 CD16 ⁺ 대조 물이 막내 실 ^21이 NK 세포 서브 세트의 우세에 의해 반사 된 ^{희미한들은} CD56에 비해. 따라서, 우리의 실험 장치는 생체 내 상황을 모방하기에 적합한 것 같다.

프로토콜

1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC)

1. 세포 배양 플라스크의 코팅
   1. 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다.
   2. 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크를 37 ℃ / 5 % CO _2에서 2 주 동안 저장 될 수있다.
2. 시드와 HBMEC의 세포 배양
   1. 세포 배양 플라스크의 바닥에서 대기음 피브로넥틴 용액. 6 mL의 ECM-B 배지에 현탁하고 7.2 × ¹⁰⁴ HBMEC / cm² 이상 추가 (= ECM-B는 5 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 %의 내피 세포 성장 보충 보충). 37 ° C / 5 % CO _2에서 인큐베이션. 현미경을 사용하여 매일 세포의 성장을 확인하십시오.
   2. 3 일마다 매체를 변경합니다.수확 또는 HBMEC 약 80 %의 합류에 도달 분할 세포. HBMEC 생리적 특성의 손실을 방지하기 위해 통로 (1) 및 (15) 사이에 사용한다.
3. 수확 HBMEC.
   1. 1의 비율로 PBS로 accutase (1X)를 혼합하여 용액을 제조 accutase 1. 추가 사용까지 수욕에서 37 ° C에서 accutase 솔루션을 유지합니다.
   2. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 배양 플라스크에서 ECM-B의 매체에 옮긴다. 세포 배양 플라스크의 바닥에 5 ㎖의 PBS를 추가하여 HBMEC 씻는다. 대기음 PBS 및 세척 단계를 두 번 더 반복한다.
   3. 2ml의 accutase의 미리 가온 용액을 첨가. 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 그 후, HBMEC 단단히 세포 배양 플라스크을 여러 번 눌러 다시 일시 중지됩니다. 세포 분리는 현미경을 사용하여 제어
   4. 이전에 15 ㎖의 튜브에 저장된 ECM-B 매체 빨리 HBMEC을 분리하기 시작 다시 세포 배양 플라스크에 첨가한다. 대부분의 HBMEC이 될 때까지 반복 플라스크의 바닥을 씻어다시 중단.
   5. 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 실온에서 10 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 버리고 1 mL의 ECM-B 배지에서 세포를 다시 일시. 세포를 세어 용액 ECM-B 배지 당 3 × ¹⁰⁵ HBMEC의 최종 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석.

셀 문화 삽입 2. 준비

1. 세포 배양 삽입의 코팅
   중요 사항 : 세포 배양 삽입의 막을 만지지 마십시오.
   1. 각 세포 배양 용 삽입 100 μL의 피브로넥틴 용액 (1.1.1 참조) (도 1a)와 96- 웰 편평 바닥 플레이트의 한 웰 (광 제어 웰)를 추가한다. 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 배양. 배양 대기음 피브로넥틴 솔루션 후.
   2. 100 μL HBMEC의 세포 배양 삽입 정학 잘 광학 컨트롤을 추가합니다. 셀의 하부 구획에 600 μL ECM-B 매체 추가문화 삽입합니다. 37 ° C / 5 배리어 무결성 (도 1b)까지의 CO ₂ %에 도달시 사일 아니라 광 제어에 HBMEC 현미경 평가하여 세포 성장을 확인 - 3 부화. 참고 : 사일 이상 세포 성장은하지 않는 것이 좋습니다.
   3. 선택적 : 염증 상태를 모방하는 하부 구획의 매체를 흡인하고 24 시간 마이그레이션 분석 전에 500 U / ㎖의 IFN-γ / TNF-α 보충 ECM-B 배지로 교체한다.

윤회의 분석의 날에 에반스 블루 3. 품질 관리

1. 에반스 블루 용액의 제조
   1. 15 ML의 원심 분리기 튜브를 사용하여 200 μL의 B27 보충제와 PBS / B27 솔루션 믹스 10 mL의 PBS를 준비합니다. 에반스 블루 원액을 희석 (20 ㎎ / ㎖ PBS) 1 : PBS / B27 1,000.
2. 에반스 블루 투과성 분석
   1. 상부 구획이어서 하부 구획에서 매체 기음합류 HBMEC 단층을 함유 한 세포 배양 인서트. 세포 배양 삽입에 100 μL 에반스 블루 솔루션을 추가합니다.
   2. 상기 하부 구획에 600 μL PBS / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO _2에서 60 분 동안 배양한다. 조심스럽게 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 제거합니다.
3. 에반스 블루 측정
   1. 상기 하부 구획에서 PBS / B27를 제거하고 블랙 폴리스티렌 96- 웰 평면 바닥 플레이트의 웰에 두 100 μL를 각각 전송. 테칸 무한 M200 프로 플레이트 리더로 플레이트를 삽입하고, Z 최적의 위치를 ​​결정한다.
   2. (예 : 여기 620 nm의 방출 : 680 nm의 여기 대역 : 9 nm의 발광 대역 : 20 ㎚, 175x를 향상 25 개 깜박 통합 시간 : 20 μS) 에반스 블루 이용한 각 설정의 기준 여기.
   3. HBMEC 장벽 기능이 씨앗 후 다른 시간 지점에서 HBMEC를 통해 에반스 블루 침투를 묘사 한 표준 곡선에 수집 된 데이터를 비교할 확인하려면보내고 셀 (우측도 1b).

4. 마이그레이션 분석

1. 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 제조.
   1. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 10 mL의 RPMI를 추가하고 200 μL B27 보충제를 추가합니다. 5 분 동안 300 XG에 PBMC 세포를 원심 분리를 계산. 5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 RPMI / B27 최종 농도 PBMC를 다시 일시.
2. 마이그레이션 분석의 설정
   1. 합류 HBMEC 단층 (도 1a)을 함유하는 세포 배양 물 삽입물의 상부 구획이어서 하부 구획에서 대기음 매체. 도너 단위 당 24 웰 플레이트의 한 웰 (시험관 제어)를 또한 세포 배양 인서트 100 μL PBMC 현탁액을 각각 추가하고.
   2. 체외 제어 PBMC에 세포 배양 용 삽입 500 μL의 하부 구획에 600 μL RPMI / B27을 추가하고, 37 ℃ / 5 % CO _2에서 6 시간 동안 _{배양한다.}
3. 마이그레이션 된 PBMC의 수확
   1. 집게를 사용하여 세포 배양 삽입을 꺼내 조심스럽게 멤브레인을 건드리지 않고 400 μL PBS와 바닥을 씻어. 세포 배양 삽입을 폐기하십시오.
   2. 20 μL 유동 카운트 fluorospheres 추가 세포 배양의 하부 구획 (약 1,000 비즈 / μL)의 시험 관내 제어뿐만 아니라 넣고 잘 섞는다. 튜브 유동 세포 계측법 PBMC 현탁액을 수득 한 용액의 전송.

5. 유동 세포 계측법

1. 샘플 준비
   1. 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (300) XG PBMC.
   2. 100 μL에 형광 색소 - 컨쥬 게이트 항체를 첨가하여 항체 용액을 제조는 샘플 당 (PBS / 1 % BSA / 2 mM의 EDTA) 버퍼 유동 세포 계측법. 1 μL CD4-FITC 아래 제시된 결과, 1-μLCD3를 PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7 1 μL CD8-A700, 1 μL CD16-A750은 샘플 당 사용되었다.
   3. PB를 다시 중단항체 용액 100 μL의 MC 및 4 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
   4. 250 μL를 5 분 동안 300 XG에 버퍼 원심 유동 세포 계측법에 추가.
2. 샘플 획득
   1. 필요한 양의 PBMC를 일시 중지 다시 버퍼의 유동 세포 계측법 (사용 사이토 흐름에 따라 다름).
   2. 유동 계수 fluorospheres를 검출 (525) 및 700 nm 파장 간의 활성 검출기 플로우 사이토 미터를 사용하여 염색 PBMC 획득 (여기 488 nm의 발광 525 - 700 ㎚).
      (다음 단계 Kaluza G 소프트웨어 동작 사이토 Gallios 흐름이 사용되는 경우의 예이다 :. (1) 컴퓨터를 시작할 작동 시스템이 완전히 로딩 될 때 (2) 버튼 "을 사이토의"를 누름으로써 플로우 사이토 시작할 . (3) "오픈 프로토콜"버튼을 누름으로써 각각 획득 프로토콜로드. (4)에 필요한 프로토콜을 선택하고 "열기"를 선택한다. (5)과 우측 클릭하여 각 시료에 대한 프로토콜 중복가상 회전 목마 "중복"필드에 왼쪽 클릭에 표시 프로토콜에 마우스 버튼을 클릭합니다. (6) 샘플에서의 각각의 샘플에 라벨. (7) 슬라이드 쇼의 표시 위치에 샘플을 전송 및 획득을 시작한다.)
3. 샘플 분석
   1. 각각의 소프트웨어를 사용하여 데이터 흐름 계측법 열기 결과. 체외 대조군 웰의 PBMC transmigrated 대한 관심뿐만 아니라 세포 개체군의 수를 결정하고, 각 분석 소프트웨어를 사용하여 카운트 fluorospheres 흐름.
      (게이팅 전략의 예 (도 께 결과 1 부 C가 주어진다 : 전방 산란 채널 (FSC) 플롯 대 측방 산란 채널 (SSC)에서 림프구를 선택 우선, NK 세포 서브 세트의 윤회를 분석 림프구이다. 다음 CD56 플롯 대 CD3 및 CD56 ⁺ CD3 표시 ^-. NK 세포가 선택 NK 세포의 부분 집합을 구별하는, NK 세포에 표시되는CD56 CD16 CD56 대 플롯 및 ^밝은 CD16 ^{/ 어둡게 -뿐만} 아니라 CD56 ⁺ CD16 ^희미 NK 세포가 선택된다. 또한, 유동 계수 fluorospheres 그들의 수를 결정하는 시간에 대한 525 내지 700 nm의 사이에 발광 갖는 채널의 그래프에 표시된 후속 FSC 대 SSC 플롯으로부터 선택된다.)
   2. 각 샘플의 총 세포 수를 계산하기 위해, 유량 계수를 사용 fluorospheres 세포의 검출 수를 정규화 :
      
   3. 이전 총 세포와 시험 관내 제어 총 셀 간의 비율로서 이전 셀의 비율을 결정한다.

결과

NK 세포 및 인간 혈액 - 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 - 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또?...

토론

여기서 우리는 인간의 혈액 - 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다.

혈액 - 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11