Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Résumé

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Résumé

Lymphocyte extravasation dans le système nerveux central (SNC) est essentiel pour la surveillance immunitaire. altérations liés à la maladie de l'extravasation des lymphocytes pourraient entraîner des changements physiopathologiques du système nerveux central. Ainsi, l'enquête sur la migration des lymphocytes dans le système nerveux central est important de comprendre les maladies inflammatoires du système nerveux central et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous présentons ici un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau humain pour étudier extravasation des lymphocytes. les cellules endotheliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) sont cultivées confluente sur un téréphtalate de polyéthylène poreux Transwell insérer pour imiter l'endothélium de la barrière hémato-encéphalique. Fonction de barrière est validée par l'immunohistochimie de zonula, des mesures de résistance électrique (TEER) transendothéliale ainsi que l'analyse de permeation bleu Evans. Ce modèle permet d' étudier la diapédèse des sous - ensembles de lymphocytes rares tels que CD56 CD16 ^{lumineux dim / -} cellules NK. e plusle minerai, les effets d'autres cellules, des cytokines et des chimiokines, des altérations liées à la maladie, et les schémas thérapeutiques distincts sur la capacité migratoire des lymphocytes peut être étudiée. Enfin, l'impact des stimuli inflammatoires, ainsi que différents régimes de traitement sur la barrière endothéliale peuvent être analysées.

Introduction

la migration des lymphocytes du sang dans les tissus est crucial pour la surveillance immunitaire. Une séquence d'interactions moléculaires spécifiques assure le site extravasation spécifique dans l' intestin grêle, peau, ganglions lymphatiques, le système nerveux central (SNC) et d' autres tissus ^1. Les modifications de la migration des lymphocytes sont impliqués dans la physiopathologie d'un certain nombre de maladies largement répandus ^2. La migration dans le SNC immuno-privilégié est étroitement régulée , et en conséquence des modifications de ce procédé sont impliqués dans les maladies liées au SNC, comme l' encéphalomyélite ^3, la neuromyélite optique, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Il est donc important d'étudier extravasation des lymphocytes pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et de développer des outils pour une mélioration de la charge de morbidité ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Les lymphocytes migrent dans le système nerveux central par des voies distinctes. Extravasation à travers veinules post - capillaires dans l'espace sous - arachnoïdien par l' intermédiaire de la barrière de fluide céphalo-sang dans les plexus choroïdes et à travers la barrière sang-cerveau ont été décrits ^{1, 13, 14, 15.} La migration à travers la barrière hémato-encéphalique est réalisée par l'interaction des lymphocytes avec des cellules endotheliales ^14. Contrairement aux cellules endotheliales à la périphérie, les cellules endotheliales du système nerveux central expriment de grandes quantités de molécules de jonctions serrées, ce qui limite strictement la quantité de cellules et de protéines capables de traverser la barrière hémato-encéphaliquelass = "xref"> 16. Résultats de l'inflammation dans le desserrage des jonctions serrées et induit l'expression de molécules d'adhésion; Ainsi, l' amélioration de la migration des lymphocytes dans le SNC ^{1, 17, 18.}

Extravasation via la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Lymphocytes attache aux cellules endothéliales et ensuite rouler le long de l'endothélium dans un procédé principalement médiée par les sélectines ^{1, 15.} Par la suite, les interactions entre les chimiokines sécrétées par l'endothélium et les récepteurs de chimiokines respectifs exprimés sur les lymphocytes induisent des changements conformationnels d'intégrines, favorisant ainsi l' adhésion ferme aux cellules endothéliales ^1. Enfin, les lymphocytes, soit exploration le long de la barrière endothéliale contre le flux sanguin avant transmigrant dans l'espace périvasculaire, ou bloquer immédiatement et directement transmigrate au niveau du site d'adhérence de la firme ^{1, 19, 20.} Toutes ces étapes de l' extravasation des lymphocytes peuvent être analysés in vitro en utilisant des techniques distinctes ^21. La microscopie vidéo time-lapse est utilisé pour étudier la fixation initiale et le laminage ^15. Des tests d'adhésion fournissent des informations détaillées sur l' arrestation ferme endothéliale barrières ^22. Des dosages de transmigration comme démontré ici permettent l' analyse de la transmigration des cellules immunitaires ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Utilisation de l'humain in vitro modèle de barrière hémato-encéphalique, on pourrait montrer récemment que plus migrla capacité de Atory de CD56 CD16 ^{lumineux dim / -} cellules NK par rapport à leur CD56 CD16 ^{+ dim} homologues est reflété par une prédominance de ce sous - ensemble des cellules NK dans le compartiment ²¹ intrathécale. Ainsi, notre dispositif expérimental semble être approprié pour simuler la situation in vivo.

Protocole

1. Culture cellulaire des cellules cérébrales microvasculaire endothéliales humaines (HBMEC)

1. Revêtement des flacons de culture cellulaire
   1. Pour préparer la solution de fibronectine, ajouter 10 ml de PBS à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 150 pi fibronectine et bien mélanger.
   2. Pour couvrir le fond d'un flacon de culture de cellules T-25 ajouter 2 mL de la solution de fibronectine. Incuber le flacon de culture cellulaire pendant au moins 3 h à 37 ° C dans l'incubateur. Des flacons revêtus de fibronectine peuvent être stockés pendant 2 semaines à 37 ° C / 5% CO _2.
2. Et Ensemencement culture cellulaire de HBMEC
   1. Aspirer la solution de fibronectine à partir du fond du flacon de culture de cellules. Ajouter 7,2 x 10 ⁴ HBMEC / cm² en suspension dans 6 ml de milieu ECM-b (= ECM-B supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de supplément de croissance des cellules endothéliales). Incuber à 37 ° C / 5% CO _2. Vérifiez la croissance cellulaire à l'aide quotidienne d'un microscope.
   2. Changer le support tous les 3 jours.Récolte ou fractionnement de cellules, lorsque HBMEC atteignent la confluence d'environ 80%. HBMEC doit être utilisé entre le passage 1 et 15 pour éviter la perte des propriétés physiologiques.
3. Récolte HBMEC.
   1. Préparer Accutase solution en mélangeant Accutase (1x) avec du PBS dans un rapport de 1: 1. Maintenir Accutase solution à 37 ° C dans un bain d'eau jusqu'à utilisation ultérieure.
   2. Transfert moyen ECM-b de la fiole de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Laver HBMEC par addition de 5 ml de PBS au fond du flacon de culture de cellules. Aspirer PBS et répéter l'étape de lavage deux fois de plus.
   3. Ajouter une solution préchauffée Accutase 2 ml. Incuber à 37 ° C pendant 2 min. Par la suite, HBMEC sont remis en suspension en appuyant fermement le flacon de culture cellulaire à plusieurs reprises. détachement des cellules est contrôlée à l'aide d'un microscope
   4. L'ECM-b-support précédemment stocké dans un tube de 15 ml est ajouté à nouveau dans le ballon de culture de cellules dès HBMEC commencent à se détacher. Rincer à plusieurs reprises le fond du flacon jusqu'à ce que la plupart sont HBMECremis en suspension.
   5. Transférer la suspension cellulaire à un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu ECM-b. Compter les cellules et on dilue la suspension de cellules pour obtenir une concentration finale de 3 x 10 ⁵ ml de milieu par HBMEC ECM-b.

2. Préparation des inserts pour la culture cellulaire

1. Le revêtement des inserts de culture cellulaire
   Remarque importante: Évitez de toucher la membrane des inserts de culture cellulaire.
   1. Ajouter une solution de 100 ul de fibronectine (voir 1.1.1) de chaque insert de culture de cellules (Figure 1A) et un puits d'une plaque à fond plat à 96 puits (puits de contrôle optique). Incuber pendant au moins 3 h à 37 ° C. Après incubation de la solution aspirée fibronectine.
   2. Ajouter 100 pi suspension HBMEC aux inserts de culture cellulaire et le puits de contrôle optique. Ajouter 600 ul de milieu ECM-B vers le compartiment inférieur de la celluleinserts de culture. Incuber pendant 3 - 4 jours à 37 ° C / 5% de _CO2 jusqu'à ce que l' intégrité de la barrière (figure 1B) est atteinte, vérifier la croissance cellulaire par évaluation microscopique du HBMEC dans le puits de contrôle optique. Note: La croissance cellulaire au-delà de quatre jours est pas recommandé.
   3. Facultatif: Pour reproduire les conditions inflammatoires Aspirer le milieu du compartiment inférieur et le remplacer par du milieu ECM-B supplémenté avec 500 U / ml d'IFN-γ / TNF-α de 24 h avant l'essai de migration.

3. Contrôle de la qualité avec Evans bleu le jour du dosage Transmigration

1. Préparation de la solution bleu evans
   1. Pour préparer une solution de mélange PBS / B27 10 ml de PBS avec 200 ul de complément B27 en utilisant un tube à centrifuger de 15 mL. Diluer la solution mère bleu Evans (20 mg / ml de PBS) 1: 1000 avec du PBS / B27.
2. Evans essai de perméabilité bleu
   1. Aspirer le milieu du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieurd'un insert de culture cellulaire contenant une monocouche confluente HBMEC. Ajouter 100 ul d'une solution bleu evans à l'insert de culture cellulaire.
   2. Ajouter 600 ul de PBS / B27 dans le compartiment inférieur et incuber pendant 60 min à 37 ° C / 5% CO _2. Retirez délicatement l'insert de culture cellulaire en utilisant une pince.
3. Evans mesure bleu
   1. Retirer PBS / B27 du compartiment inférieur et le transfert de 100 ul de chacun de deux puits d'une polystyrol noir plaque de 96 puits à fond plat. Insérer la plaque dans un lecteur de plaque Tecan Pro infini M200 et déterminer position z optimal.
   2. excitation de la mesure de Evans en utilisant des paramètres respectifs bleu (par exemple: excitation: 620 nm, émission: 680 nm, largeur de bande d'excitation: 9 nm, largeur de bande d'émission: 20 nm, l'amélioration de 175x, 25 clignote, le temps d'intégration: 20 us).
   3. Pour déterminer les fonctions de barrière HBMEC pour comparer les données acquises à une courbe étalon représentant permeation bleu Evans à travers HBMEC à différents points de temps après la semencecellules ING (Figure 1B, à droite).

4. Essai de migration

1. Préparation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC).
   1. Ajouter 10 ml RPMI dans un tube de centrifugation de 15 ml et ajouter 200 pi supplément B27. Count PBMC et les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Re-suspendre PBMC à une concentration finale de 5 x 10 ⁶ cellules / ml de RPMI / B27.
2. Mise en place du test de migration
   1. Aspirer moyen du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieur d'inserts de culture cellulaire contenant des monocouches confluentes HBMEC (figure 1A). Par donneur d' ajouter 100 uL de suspension de PBMC chacun des inserts de culture cellulaire et également à un puits d'une plaque à 24 puits par (contrôle in vitro).
   2. Ajouter 600 ul de RPMI / B27 dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire et de 500 ul de la PBMC du contrôle in vitro et incuber 6 heures à 37 ° C / 5% CO _2.
3. La récolte des PBMC migrée
   1. Retirez l'insert de culture cellulaire à l'aide des pinces et rincer soigneusement le fond avec 400 ul de PBS sans toucher la membrane. Jeter l'insert de culture cellulaire.
   2. Ajouter 20 ul Fluorospheres de comptage de débit (environ 1000 perles / ul) au compartiment inférieur de la culture cellulaire insérer ainsi que pour le contrôle in vitro et bien mélanger. Transfer 1 ml de suspension de PBMC résultant de cytométrie en flux tubes.

5. cytométrie en flux

1. La préparation des échantillons
   1. Centrifugeuse PBMC à 300 xg pendant 5 min à température ambiante.
   2. Préparer la solution d'anticorps par addition d'un fluorochrome conjugué d'anticorps à 100 pi de tampon de cytométrie en flux (PBS / 1% BSA / EDTA 2 mM) par échantillon. Pour les résultats présentés ci-dessous 1 ul CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 pi CD8-A700 et 1 ul CD16-A750 ont été utilisés par échantillon.
   3. Resuspendre PBMC dans 100 ul de la solution d'anticorps et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
   4. Ajouter tampon cytométrie de flux 250 uL et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
2. acquisition d'échantillons
   1. Re-suspendre PBMC en la quantité requise (varie en fonction du cytomètre de flux utilisé) de cytométrie de flux tampon.
   2. Acquérir coloré les PBMC en utilisant un cytomètre à écoulement avec un détecteur actif entre 525 et 700 nm de longueur d'onde pour détecter Fluorospheres de comptage de débit (excitation 488 nm, émission 525 à 700 nm).
      (Les étapes suivantes sont, par exemple, si un flux Gallios cytomètre fonctionnant avec le logiciel Kaluza G est utilisé:. (1) Démarrer l'ordinateur (2) Lorsque le système d'exploitation est entièrement chargé, démarrer le cytomètre à écoulement en appuyant sur le « cytomètre sur bouton » . (3) Chargez le protocole d'acquisition respectif en appuyant sur le bouton « protocole ouvert ». (4) Choisissez le protocole requis et sélectionnez « ouvrir ». (5) en double le protocole pour chaque échantillon en cliquant avec le droitbouton de la souris sur le protocole visible dans le carrousel virtuel et un clic gauche sur le terrain « en double ». (6) d'étiquetage de chaque échantillon dans la liste de l'échantillon. (7) Transférer les échantillons aux positions indiquées sur le carrousel et commencer l'acquisition.)
3. L'analyse des échantillons
   1. Ouvrir flux résultant cytométrie données à l'aide du logiciel respectif. Déterminer le nombre de sous - populations d'intérêt pour transmigré PBMC ainsi que les cellules provenant de puits de contrôle in vitro et de débit comptage Fluorospheres en utilisant le logiciel d'analyse respective.
      (Un exemple de la stratégie de déclenchement est donnée dans la partie des résultats (Figure 1 C: Pour analyser la transmigration des sous - ensembles de cellules NK, d' abord sélectionner les lymphocytes dans un canal de diffusion latéral (SSC) par rapport au canal de diffusion vers l' avant (FSC) parcelle Lymphocytes sont. puis affichés dans une CD3 contre parcelle CD56 et CD56 ⁺ CD3 ^-. Les cellules NK sont choisies pour distinguer entre les sous - ensembles des cellules NK, les cellules NK sont affichées dansCD56 contre CD16 intrigue et CD56 CD16 ^{lumineux dim / -} ainsi que CD56 CD16 ^{+ dim} cellules NK sont sélectionnées. En outre, comptage de flux Fluorospheres sont choisis parmi un FSC contre SSC terrain et par la suite affichées dans une trame d'un canal avec une émission entre 525 et 700 nm en fonction du temps pour déterminer leur nombre.)
   2. Pour calculer le nombre total de cellules de chaque échantillon, à normaliser le nombre détecté de cellules en utilisant Fluorospheres de comptage de débit:
      
   3. Déterminer le pourcentage de cellules ayant migré comme rapport entre les cellules totales et les cellules ayant migré au total dans le contrôle in vitro.

Résultats

Les résultats représentatifs montrant transmigration des sous - ensembles de cellules NK et de lymphocytes T en utilisant le modèle de barrière sang-cerveau humain (figure 1A) sont représentés. L'intégrité de la monocouche mesures HBMEC a été validé par la coloration de la molécule de jonction étanche ZO-1, transendothéliaux résistance électrique (TEER), et permeation bleu Evans (figure 1B). Suite à 3 - 4 jours de culture HBMEC a exp...

Discussion

Nous présentons ici une technique pour étudier la transmigration des lymphocytes à travers la barrière sang-cerveau humain. L'analyse in vitro de la migration des lymphocytes au système nerveux central est important d'étudier les processus de base de l' extravasation des lymphocytes, des altérations liées aux maladies potentielles, et de nouvelles approches thérapeutiques.

Plusieurs modifications du modèle de barrière hémato-encéphalique sont possibles. Par ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11